富有机硒甘味绞股蓝的种植方法

富有机硒甘味绞股蓝的种植方法
【专利摘要】本发明提供了一种富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，属于栽培技术领域，一种富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，选用甘味绞股蓝品种，首先对甘味绞股蓝的外植体进行组织培养获得组培苗，然后将将组培苗移栽到苗圃中建成株系圃；将株系圃里生长1年的绞股蓝株系植株的根茎进行种植建成扩繁圃；将扩繁圃生长1年的绞股蓝植株的根茎进行种植建成大田用种圃；以及将大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎种植到大田；本发明利用组织培养技术建立株系圃，组织培养能够快速繁殖甘味绞股蓝，增加了甘味绞股蓝的产量，同时减少病毒病的发生，然后通过三圃繁殖的建立，使组织培养的组培苗得到很好的生长，提高了甘味绞股蓝的品质和产量，实现高产高效种植。
【专利说明】
富有机砸甘味绞股蓝的种植方法
技术领域
[0001] 本发明设及于栽培技术领域，具体而言，设及一种富有机砸甘味绞股蓝的种植方 法。
【背景技术】
[0002] 全世界绞股蓝有16种和3个变种，我国有15种和3个变种，仅湖北恩施州就有11种 和3个变种。国内外推广的绞股蓝原变种因味极苦，寒性重，难W入口，易伤脾胃，成为绞股 蓝人工种植和产业化开发的瓶颈;加之，绞股蓝长期W来处于野生和半野生状态，国内没有 可供栽培的品种，适合其生长和实现其保健价值的高产高效栽培技术研究是空白。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的在于提供一种富有机砸甘味绞股蓝的种植方法，不仅仅保持甘味绞 股蓝的种性，提高了甘味绞股蓝的品质和产量，实现高产高效种植，同时提高了甘味绞股蓝 的保健功能。
[0004] 本发明解决其技术问题是采用W下技术方案来实现的。
[0005] -种富有机砸甘味绞股蓝的种植方法，包括：
[0006] 组织培养:将甘味绞股蓝的外植体接种到培养基上，进行组织培养，获得组培苗， 组织培养包括愈伤组织诱导培养、丛生芽分化培养和生根培养;Ξ圃繁殖建立:将组培苗移 栽到苗圃中建成株系圃；将株系圃里生长1年的绞股蓝株系植株的根茎进行种植建成扩繁 圃;将扩繁圃生长1年的绞股蓝植株的根茎进行种植建成大田用种圃；W及
[0007] 种植管理:将大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎种植到大田。
[000引本发明实施例提供的富有机砸甘味绞股蓝的种植方法的有益效果是:本发明利用 组织培养技术建立株系圃，组织培养能够保持甘味绞股蓝的种性，组织培养能够快速繁殖 甘味绞股蓝，极大地增加了甘味绞股蓝的产量，同时通过组织培养能够获得脱病毒的组培 苗，再用运种苗进行繁殖，则种植的甘味绞股蓝就不会或极少发生病毒病。有利于提高甘味 绞股蓝的品质，同时降低种植成本，然后通过Ξ圃繁殖的建立，使组织培养的组培苗得到很 好的生长，将大田用种圃内的绞股蓝植株的根茎种植到大田，提高了甘味绞股蓝的品质和 产量，实现高产高效种植。经过本发明提供的种植方法种植的甘味绞股蓝的营养价值高，保 健功能更优。
【具体实施方式】
[0009] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市售购买获得的常规产 品D
[0010] 下面对本发明实施例的富有机砸甘味绞股蓝的种植方法进行具体说明。
[0011] -种富有机砸甘味绞股蓝的种植方法，包括w下步骤：
[0012] S1、外植体选择:将经过消毒处理的待选外植体放入筛选培养基中培养筛选出外 植体，待选外植体包括茎尖、茎段和叶片；筛选培养基是在MS培养基中加入0.5~1.5mg/L 6-BA、0.1~0.3mg/L NAA、20~40g/L薦糖和6~8g/L琼脂制成;所述外植体为所述茎尖。
[0013] 其中，筛选培养基的制作方法为:在MS培养基的基础上先加适量水于烧杯中，再加 入6-BA 0.5~1.5mg、NAA 0.1~0.3mg、薦糖20~40g和琼脂6~8g，接着量筒加水定容到1L， 然后调试PH。
[0014] MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，MS培养基是目前 使用最普遍的培养基。具体地，本实施例中甘味绞股蓝的外植体选自恩五叶蜜品种或恩屯 叶甜的组织或器官。
[0015] 恩五叶蜜品种：利用绞股蓝变种Gynostemma pentaphyllum Makino DanTian No.9926835为母本，与Gynostemma pentaphyllum Makino DanTian No. 17892为父本杂交， 对其Fi代群体进行个体选择，选到了表现优异的Fi株系，用其Fi株系根茎繁殖种苗，得到"恩 五叶蜜"新品种，其根茎繁殖后代遗传稳定。
[0016] 恩屯叶甜品种：利用绞股蓝变种Gynostemma pentaphyllum Makino DanTian No. 19371 为母本与Gynostemma pentaphyllum Makino DanTian No.592为父本杂交，对其 Fi代群体进行个体选择，选到了表现优异的Fi株系；用其Fi株系根茎繁殖种苗，得到"恩屯叶 甜"新品种，其根茎繁殖后代遗传稳定。
[0017] 甘味绞股蓝新品种消除了苦味绞股蓝原变种味苦伤脾胃之缺陷，药用成分较苦味 绞股蓝原变种没有降低，不仅人参皂武大大提高，而且甘味绞股蓝新品种含有苦味绞股蓝 所没有的药用成分，例如:特有的黄酬、芳香物质、皂巧元、甘味素等，运些特有药用成分有 很高药用及保健价值。
[0018] 甜叶绞股蓝新品种药用价值高，品质好，恩屯叶甜含绞股蓝总皂武5.52%，氨基酸 14.2 %，维生素 E 108.70mg/kg，比国内外推广的原变种分别高33.3%、11.8%、66%;亩产 290kg，比国内外推广的原变种亩产243kg高47kg;恩五叶蜜含绞股蓝总皂武5.56%，氨基酸 13.3%，维生素 E6.72mg/kg，分别比国内外推广的原变种高34.3%、4.7%、17.2%;亩产 274kg，比国内外推广的原变种亩产243kg高31kg，提高了其药用价值，拓展了应用途径。
[0019] 目前为止，绞股蓝进行过离体培养的有5种外植体，包括茎段、茎尖、叶片、叶柄、花 芽等。在适宜的培养条件下，选取不同产地、不同品种、不同生长时期的健壮绞股蓝植株的 幼嫩茎段、茎尖、叶片、叶柄、花芽等作为外植体，经适当的消毒处理，接种在不同激素配比 的MS培养基上，其愈伤组织诱导、丛生芽分化、生根培养及移植成活均容易进行，但结果有 一定差异。
[0020] 研究愈伤组织诱导率与外植体选材相关性发现:叶片的诱导愈伤率最高，但形成 的愈伤组织呈黄绿色、较脆弱，很难进一步分化出不定芽，不易继代培养;幼嫩的茎段形成 的愈伤组织呈绿色、疏松、膨大，诱导率较高;茎尖诱导率较低，但诱导出的愈伤组织更易存 活，生长势好且容易分化出不定芽，可避免内生菌对整个快繁过程的影响。因此，选取生长 健壮的茎尖作为外植体.是防止品种退化的最有效途径，W此培育出的再生苗可大大提高 繁殖速度，适宜无性快繁规模化生产。
[0021] 同时，本发明实施例提供了一种针对甘味绞股蓝的消毒处理的方法，将外植体用 洗洁精或浓度为5 %的洗衣粉漂洗3~8min后，用流水冲洗ο. 5~Ih，接着用75 %乙醇浸泡25 ~35s，无菌去离子水冲洗4~6遍，接着放入浓度为0.1 %化C12溶液中振荡消毒7~lOmin或 用次氯酸钢消毒22~27min，接着用无菌去离子水冲洗5~6次。
[0022] 在用流水冲洗洗0.5~化之后，在用75%乙醇浸泡25~35s之前，需要用滤纸吸去 外植体上多余的水分，并将外植体移入超净工作台，进行后续操作。
[0023] 当外植体消毒处理完成后，将消毒后的外置体置于灭菌培养皿中，然后将外植体 切小段(长0.5~1.5cm，带有1个蔽芽或顶芽，切除药液接触过的伤口），接着将切段后的外 植体接种到筛选培养基中。
[0024] S2、组织培养:将甘味绞股蓝的外植体接种到培养基上，进行组织培养，获得组培 苗，所述组织培养包括愈伤组织诱导培养、丛生芽分化培养和生根培养。
[0025] 具体地，愈伤组织诱导培养包括将外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，外植体 上形成愈伤组织。
[0026] 取1.0cm健壮茎尖，W按浓度计含有3 %薦糖和0.7 %琼脂的MS培养基为基础培养 基，添加不同浓度的KT和2，4-D、6-BA和NAA、6-BA和2，4-DS种激素组合，观察对愈伤组织的 诱导及生长势的影响。
[0027] 结果表明，KT和2，4-D组合对愈伤组织的诱导率和存活率较低，长势较慢;按浓度 计的1.5mg/L 6-BA和0.3mg/L NAA组合诱导的愈伤组织呈嫩绿色、结构较紧密、生长势较 好，诱导率达92.6% ;按浓度计的l.Omg/L 6-BA和2.0mg/L 2,4-D组合诱导的愈伤组织为黄 白色、疏松、膨大、含水量较高，诱导率达91.9 %。
[002引因此，优选地，诱导愈伤组织的最佳激素组合为1.5mg/L 6-BA和0.3mg/LNAA。愈伤 组织诱导培养基是在MS培养基中加入1~2mg/L 6-BA、0.2~0.4mg/L NAA、20~40g/L薦糖 和6~8g/L琼脂制得。
[0029] 具体地，丛生芽分化培养包括将愈伤组织转接到分化培养基中，并分化出丛生芽。
[0030] 将茎尖愈伤组织接种到分化培养基上经过2-3次继代培养，第6d开始出现丛生芽， 25d后丛生芽的诱导率可达93%。单纯添加生长素(NAA)有利于愈伤组织的诱导和根的形 成，单纯加入细胞分裂素(6-BA)也能诱导愈伤组织，并分化出丛生芽，而加入低浓度的两类 生长素(NAA和2,4-D)和高浓度的细胞分裂素(6-BA)，对丛生芽的分化频率明显高于仅单独 添加细胞分裂素的组合。
[0031] 优选地，分化培养基是在MS培养基中加入0.1~0.3mg/L NAA、0.1~0.3mg/L 2,4- 0、0.5~1.5111旨/16-84、20~40旨/1薦糖和6~8旨/1琼脂。
[0032] 具体地，生根培养包括将丛生芽转接到生根培养基中，生长出根，形成组培苗。
[0033] 芽苗长至约2cm左右时，剪下单根芽苗转入1/2MS培养基中进行生根培养。结果表 明，NAA单独使用时可W生根，且W浓度为1.5mg/L的最佳，但在培养基中添加多效挫(PP333) 后可促进生根，PP333浓度为0.3mg/L时效果最佳;添加生根粉后根系多，根粗壮，芽苗粗壮， 叶色浓绿，生根粉WlOOmg/L浓度为最佳。综合考虑后，生根培养基是在1/2MS培养基中加入 1 ~2mg/L NAA、0.2~0..4mg/L PP333和90~llOmg/L生根粉制成。
[0034] 具体地，不同光照强度、光照周期及溫度条件对植物组织培养有显著影响。溫度高 于24~26°C，组培苗生长细弱，不粗壮;光照时间高于11~13h/d，组培苗生长不旺盛，光照 时间低于11~13h/d，组培苗生长细弱;光照强度高于1500~20001X，组培苗发黄，光照强度 低于1500~20001X组培苗生长缓慢，延长组培时间15dW上，而且组培苗细弱，矮小。
[0035] 因此，优选甘味绞股蓝外植体愈伤组织的诱导、丛生芽分化和生根培养在溫度为 24~26 °C、光照时间11~13h/d、光照强度为1500~20001X的条件下进行。
[0036] 在本条件下愈伤组织诱导培养基培养7d后，外植体切口基部突起膨大，切口的周 边开始愈伤化，至2周后全部愈伤化，愈伤组织诱导率平均达95 % W上，而且1周后就能诱导 出大量的无菌不定芽，3周后即可繁殖出大量丛生芽苗；将丛生芽苗转入生根培养基后约 15d左右长出根。
[0037] 此外，本发明实施例还对培养基的酸碱度进行了研究，培养基的酸碱度对外植体 的生长没有直接影响，但存在一定的间接影响，合适的pH值不仅有益于外植体生长，而且有 助于培养基凝固，当pH值高于6.5时，培养基会变硬；低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。因 此，本发明实施例中，优选培养基的抑值为5.8~6.4。
[0038] 为了提高组培苗对陆地不良环境的适应力，缩短缓苗时间，增强组培苗对低溫、大 风等的抵抗能力。本发明实施例在将组培苗移栽到苗圃之前，先对组培苗进行炼苗。
[0039] 具体地，当组培苗生根数达10条左右、苗高5cm左右时，可W进行炼苗:在遮荫网下 将瓶盖或封口膜打开，适时在培养基表面补加薄层的无菌水，适应5d后将苗移出，小屯、洗尽 残余培养基后移栽到装有营养上的营养鉢中培养。培养鉢置于遮荫棚内，保持溫度15°CW 上，湿度90 %左右，成活率平均达到98%，栽后7d恢复正常生长，15d后植株达10cm左右，1个 月后，株高可达20cm。此时可将营养鉢内苗移至其它荫棚中进行日常管理，也可直接移栽在 大田中，旁边插带叶的小树枝条遮荫。绞股蓝组培苗的移栽成活率较高，一般可达95% W 上。
[0040] 当组培苗生根数超过10条、苗高6cm时炼苗，虽然其成活率也达到98%，但因培养 基营养变少，培养时间延长至6天，植株体积变大，光和条件变差，使其组培苗植株变弱，不 利炼苗移栽，同时延长组培时间，还会增加组培光照成本。
[0041] 苗高小于5cm时，培养基营养没有充分利用，苗过小，炼苗和大田移栽成活率低于 98%，成活率在80 %-91 %范围内。
[0042] 所W，优选当组培苗生根数达10条左右、苗高5cm左右时，可W进行炼苗。
[0043] 83、Ξ圃繁殖建立:将经过炼苗后的组培苗移栽到苗圃中建成株系圃；将株系圃里 生长1年的绞股蓝株系植株的根茎进行种植建成扩繁圃；将扩繁圃生长1年的绞股蓝植株的 根茎进行种植建成大田用种圃。
[0044] 具体地，将甘味绞股蓝组培苗在炼苗棚中炼苗后移栽到苗圃。苗圃基质底肥拌腐 熟有机肥3000kg/亩，富砸生物有机肥80kg/亩，复合微生物菌剂肥4kg/亩，厢宽1.2m，株行 距15cmX 15cm，厢沟宽0.3m，每穴1根，把每个当选株系苗种植成1厢，建成株系圃。
[0045] 选择株系圃里生长1年的健壮无病的绞股蓝株系植株的根茎，用稀释1800~2200 倍的农用链霉素浸润0.4~0.6min拱出，按3-4个茎节为1段，截为种根，按株行距15cmX 15cm种植，每穴1根，建成扩繁圃。
[0046] 将扩繁圃生长1年的健壮无病的绞股蓝植株根茎，用稀释1800~2200倍的农用链 霉素浸润0.4~0.6min拱出，按3-4个茎节为1段，截为种根，按株行距15cmX15cm种植，每穴 1根，建成大田用种圃，种植1年供大田生产用种。
[0047] S4、种植管理:将大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎种植到大田。
[0048] 选地:在对大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎进行种植之前，首先选择适 合种植的田地，优选田地位于海拔400-1600m，有排灌条件的区域，附近有沼气池，有灌根和 喷灌设施，可用潜水累连接管道将沼气肥送到田间施肥。±壤为腐殖±、沙壤±或壤±， pH6.0-7.5,前作不能是马铃馨、烟草、番茄等茄科作物或葫芦科作物，最高气溫不超过30 °C，最低气溫不低于-9.5°C。
[0049] 整田：株系圃、扩繁圃、大田用种圃、大田播种前翻耕晒田一次，整细±壤，整平田 块，作厢1.2m宽，厢沟宽0.3m，沟深0.25m。
[0050] 绞股蓝连作的±地，每年收获后，田块灌水淹没田±7d，杀死田块中的线虫，消除 绞股蓝根际害虫;若在旱田区域建绞股蓝种植基地，则在栽种绞股蓝前15d结合整田使用生 防菌株SR18线虫杀虫剂(有效活抱子数>100亿个/g)，毎亩用160g拌细±混匀撒于定植穴 内或定植沟内。
[0051 ]施肥:株系圃、扩繁圃、大田用种圃、大田的底肥每亩施用底肥:腐熟有机肥4500~ 5500kg、复合微生物菌剂肥1~3kg和富砸生物有机肥70~90kg。
[0052] 其中，腐熟有机肥是人畜禽粪尿经过EM(有效微生物群发酵技术)法、高溫发酵堆 腐法、自制发酵催熟堆腐法等无公害化处理，杀灭了各种寄生虫卵、病原菌、杂草种子，并去 除了有害的有机酸和有害气体的肥料。
[0053] 复合微生物菌剂是由两种或两种W上互不括抗的微生物菌种制成的微生物制剂。
[0054] 富砸生物有机肥是多种有益微生物菌群与富砸有机肥结合形成的新型、高效、安 全的微生物-有机肥复合肥料。
[0055] 本发明实施例中施用的腐熟有机肥、复合微生物菌剂和富砸生物有机肥均在市面 上可直接采购。
[0056] 栽种:在对田块施肥后，选用大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎繁殖复壮 的恩五叶蜜、恩屯叶甜脱毒苗种植，3-5个茎节的绞股蓝根茎每穴一根，种植规格15cmX 15cm，种植深度5cm。栽种后覆盖黑色地膜，起保溫和防治杂草生长的作用，待出苗后将地膜 戳破，让绞股蓝苗露出地膜。
[0057] 种植模式根据不同海拔高度、地形地势可采用立体搭架、铺地等多种栽培模式，玉 米套作时玉米播种在厢面的中央，每穴双株。
[0058] 除草:封行前働净杂草，W后见草即除。
[0059] 田间封行期：出苗时追施沼气肥20担/亩，绞股蓝苗高30cm趁晴天打顶，每采摘1次 喷施沼肥1次，每次20担/亩。
[0060] 追肥:在生长盛期施用复合微生物菌剂肥，在茎叶采摘期施用富有机砸液态肥，在 采摘茎叶后追施沼气肥20担/亩。复合微生物菌剂肥施用：用复合微生物菌剂肥W稀释250 倍的水溶液于生长盛期灌根1次，用量为50kg/亩，W后用复合微生物菌剂肥W稀释500倍的 水溶液间隔30d再喷施1次，用量为50kg/亩，共两次。复合微生物菌剂肥能够对甘味绞股蓝 起到防病的作用。
[0061] 富有机砸液态肥施用:在茎叶采摘期，采摘茎叶前15d根外每亩喷施16kg含砸量为 0.30mg/ml富有机砸液态肥，W后间隔30d再喷施1次，共两次;每次采摘茎叶后追施沼气肥 20担/亩。富有机砸液态肥能够为±地补砸，而沼气肥能够为±地补充营养，使甘味绞股蓝 的含砸量更高，营养更充分。
[0062] 其中，沼气肥和复合微生物菌剂肥可在市面上直接采购。
[0063] 而富有机砸液态肥是通过将枯草芽抱杆菌接种到试管复壮培养基中培养形成试 管种，接着将试管种接种到发酵罐中进行发酵制得。
[0064] 其中，试管复壮培养基的组成包括:6g/L葡萄糖、5g/L薦糖、5g/L牛肉膏、5g/L蛋白 腺、4g/L氯化钢、18g/L琼脂;所述发酵罐内包括:6g/L葡萄糖、5g/L薦糖、5g/L牛肉膏、1 Og/L 蛋白腺、4g/L氯化钢，生物发酵消泡剂1 g/L。
[0065] 其中试管复壮培养基和发酵罐内物质的浓度是指物质在1L水中的含量。
[0066] 具体地，在制备1吨含有机砸300mg/L的富有机砸液态肥时，
[0067] (1)试管复壮培养基组成：6g葡萄糖、5g薦糖、5g牛肉膏、10蛋白腺、4g氯化钢、18g 琼脂、水1〇〇〇1^、抑7.6;
[0068] (2)复壮培养基灭菌:置伽马射线福照机2.5kGy灭菌，摆成斜面，冷却凝固；
[0069] (3)将冰箱4Γ冷藏中的枯草芽抱杆菌试管菌中用接种环种取1环菌种接种在试管 复壮培养基上，接种100支试管种置32Γ培养箱中培养至SE201412试管斜面长满菌；
[0070] (4)枯草芽抱杆菌种子液扩大培养:取曝气的自来水10化装入20化发酵罐中，再加 入600g葡萄糖、500g薦糖、500g牛肉膏、lOOOg蛋白腺、400g氯化钢、生物发酵消泡剂0.1kg， 用氨氧化钢调pH7.6,用伽马射线福照机3kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌 发酵液，然后将接种的100支枯草芽抱杆菌SE201412试管种接种中接入发酵罐中，设定发酵 揽拌速度19虹/min，罐内溫度32°C，罐内压力0.05MPa，罐内培养液体积与通入空气体积比1 :〇.3(V/V)。发酵罐培养15h，接入种子后，每隔化取样发酵液用酸度计测定抑(保持发酵罐 在发酵过程中发酵液保持抑7.6)和用722可见光分光光度计测定细菌细胞浓度，当发现发 酵液12h细菌细胞浓度与15h细菌细胞浓度在最大吸光度处检测，没有明显增加时，结束发 酵。
[0071] (5)1吨含有机砸300mg/L富有机砸液态肥的生产:在2吨的发酵罐中加入1吨曝气 自来水，再加入6000g葡萄糖、5000g薦糖、5000g牛肉膏、1 OOOOg蛋白腺、4000g氯化钢，纯度 99 %亚砸酸钢673.7g、GPE-6330生物发酵专用消泡剂1kg，调抑7.6，用伽马射线福照机4kGy 灭菌，发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将接种的100支枯草芽抱杆菌 SE201412试管种接种中接入发酵罐中，设定发酵揽拌速度195r/min，罐内溫度32°C，罐内压 力0.05MPa，罐内培养液体积与通入空气体积比1:0.3(V/V)。发酵罐培养15h，接入种子后， 每隔化取样发酵液用酸度计测定抑(保持发酵罐在发酵过程中发酵液保持抑7.6)和用722 可见光分光光度计测定细菌细胞浓度，当发现发酵液1她细菌细胞浓度与15h细菌细胞浓度 在最大吸光度处检测，没有明显增加时，结束发酵，管道输入储罐，用自动灌装机灌装，每瓶 灌化，封盖后用伽马射线福照机3kGy灭菌后可存放1年。
[0072] 当然，本发明实施例提供的富有机砸液态肥可W根据具体需要进行等比例缩放制 备，并不限于本发明实施例中提供的1吨含有机砸300mg/L的富有机砸液态肥的制备。
[0073] 下面对立体栽培模式、铺地栽培模式、玉米套作种植模式进行具体说明：
[0074] 立体栽培模式：
[0075] 立体栽培模式区试及示范效果为：种植25000株绞股蓝处理的绞股蓝产鲜叶 7300kg/667m2;种植20000株绞股蓝，产鲜叶5695kg/667m2;种植15000株绞股蓝产鲜叶 456.0化g/667m2;方差分析，立体栽培增加绞股蓝株数，绞股蓝鲜叶增产极显著。
[0076] 铺地栽培模式：
[0077] 铺地栽培区试及示范效果为:种植15000株绞股蓝均产鲜叶2265.5kg/667m2;种植 20000株绞股蓝均产鲜叶2905.5kg/667m2;种植化000株绞股蓝均产鲜叶3433.5kg/667m 2;方 差分析，增加绞股蓝株株数，绞股蓝鲜叶增产显著。
[0078] 玉米间套作种植模式：
[0079] 与玉米套作区试及示范中栽培模式及产量如下表：
[0080]
[0081] 方差分析结果显示，玉米3500株，绞股蓝15000株处理，玉米增产极显著，绞股蓝增 产极显著。
[0082] 用甘味绞股蓝与玉米间作，不争±地，不争生长空间，不争光照，玉米产量与单作 相当，绞股蓝亩产鲜叶1130kg-1315产叶片茶产品增收2000元-3000元/667m2,在甘味产区， 种植户每亩采摘的绞股蓝鲜叶及嫩茎叶产值，已超过15000元，实现了粮钱双丰收，极大提 高了±地利用率和提高单位面积经济效益。
[0083] 在不同生态区进行甜味绞股蓝高产高效生产模式研究，筛选出甜味绞股蓝立体搭 架、铺地等单作模式和与高杆农作物，例如：玉米，和经济林等间作套种模式的多种栽培模 式种植。可根据实际的情况进行选择。
[0084] 本发明利用组织培养技术建立株系圃，组织培养能够保持甘味绞股蓝的种性，组 织培养能够快速繁殖甘味绞股蓝，极大地增加了甘味绞股蓝的产量，同时通过组织培养能 够获得脱病毒的组培苗，再用运种苗进行繁殖，则种植的甘味绞股蓝就不会或极少发生病 毒病。有利于提高甘味绞股蓝的品质，同时降低种植成本，然后通过Ξ圃繁殖的建立，使组 织培养的组培苗得到很好的生长，将大田用种圃内的绞股蓝植株的根茎种植到大田，在大 田底施富砸生物有机肥和根外喷施富有机砸微生物菌剂。提高了甘味绞股蓝的品质和产 量，实现高产高效种植。经过本发明提供的种植方法种植的甘味绞股蓝的营养价值高，保健 功能更优。并且甘味绞股蓝茎叶总砸含量达0.2-5.Omg/kg，有机砸质量分数>80%，达到 DBS42/002-2014《富有机砸食品砸含量要求》的指标。
[0085] 实施例一
[0086] -种富有机砸甘味绞股蓝的种植方法，包括：
[0087] 组织培养:在溫度为24°C、光照时间llh/d、光照强度为15001X的条件下进行。将甘 味绞股蓝的外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，外植体上形成愈伤组织，接着将愈伤组 织转接到分化培养基中，并分化出丛生芽，当丛生芽的芽苗长至约2cm左右时，剪下单根芽 苗转接到生根培养基中，生长出根，形成组培苗。
[0088] 其中：愈伤组织诱导培养基按浓度计的组成为含Img/L 6-BA、0.2mg/L NAA、20g/L 薦糖和6g/L琼脂的MS培养基。
[0089] 分化培养基按浓度计的组成为含0.2mg/L NAA、0.2mg/L 2,4-D、0.5mg/L 6-BA、 20g/L薦糖和6g/L琼脂的MS培养基。
[0090] 生根培养基按浓度计的组成为含Img/L NAA、0.2mg/L PP333和90mg/L生根粉的1/ 2MS培养基。
[0091] Ξ圃繁殖建立:苗圃基质底肥拌腐熟有机肥3000kg/亩，富砸生物有机肥80kg/亩， 复合微生物菌剂肥4kg/亩，厢宽1.2m，株行距15cm X 15cm，厢沟宽0.3m，每穴1根，把每个当 选株系苗种植成1厢，建成株系圃。
[0092] 选择株系圃里生长1年的健壮无病的绞股蓝株系植株的根茎，用稀释1800倍的农 用链霉素浸润〇.4min拱出，按3-4个茎节为1段，截为种根，按株行距15cmX15cm种植，每穴1 根，建成扩繁圃。
[0093] 将扩繁圃生长1年的健壮无病的绞股蓝植株根茎，用稀释1800倍的农用链霉素浸 润0.4min拱出，按3-4个茎节为1段，截为种根，按株行距15cmX15cm种植，每穴1根，建成大 田用种圃，种植1年供大田生产用种。
[0094] 种植管理:选择合适的大田，在大田上作厢1.2m宽，厢沟宽0.3m，沟深0.25m。然后 对大田进行杀虫和施肥，大田的底肥每亩施用腐熟有机肥4500kg、复合微生物菌剂肥化g和 富砸生物有机肥70kg。然后再将大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎种植到大田。本 实施例中采用立体栽培模式，3个茎节的绞股蓝根茎每穴一根，种植规格为15cmX 15cm，种 植深度5cm。栽种后覆盖黑色地膜，待出苗后将地膜戳破，让绞股蓝苗露出地膜。然后对绞股 蓝进行管理，先働净杂草，接着在出苗时追施沼气肥20担/亩，绞股蓝苗高30cm趁晴天打顶， 每采摘1次喷施沼液1次，每次20担/亩。然后用复合微生物菌剂肥W稀释250倍的水溶液于 生长盛期灌根1次，用量为50kg/亩，W后用复合微生物菌剂肥W稀释500倍的水溶液间隔 30d再喷施1次，用量为50kg/亩，共两次。在茎叶采摘期，采摘茎叶前15d根外每亩喷施16kg 含砸量为〇.30mg/ml富有机砸液态肥，W后间隔30d再喷施1次，共两次;每次采摘茎叶后追 施沼气肥20担/亩。
[00巧]实施例二
[0096] -种富有机砸甘味绞股蓝的种植方法，包括：
[0097] 外植体选择:在本实施例中，在组织培养步骤之前，还包括外植体选择:将经过消 毒处理的待选外植体放入筛选培养基中培养筛选出外植体，待选外植体包括茎尖、茎段和 叶片;外植体为茎尖。
[0098] 其中，筛选培养基按浓度计的组成为含lmg/L6-BA，0.1 mg/L NAA，30g/L薦糖和7g/ L琼脂的MS培养基。
[0099] 消毒是将外植体用洗洁精或浓度为5%的洗衣粉漂洗5min后，用流水冲洗Ih，接着 用75%乙醇浸泡30s，无菌去离子水冲洗5遍，接着放入浓度为0.1%化C12溶液中振荡消毒 8min，接着用无菌去离子水冲洗5次。
[0100] 在用流水冲洗洗化之后，在用75%乙醇浸泡30s之前，需要用滤纸吸去外植体上多 余的水分，并将外植体移入超净工作台，进行后续操作。
[0101] 当外植体消毒处理完成后，将消毒后的外置体置于灭菌培养皿中，然后将外植体 切小段，接着将切段后的外植体接种到筛选培养基中。
[0102] 组织培养：本实施例的组织培养是在溫度为25°C、光照时间12h/d、光照强度为 18001X的条件下进行。
[0103] 其中：筛选培养基按浓度计的组成为含Img/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30g/L薦糖和 7g/L的MS培养基；
[0104] 愈伤组织诱导培养基按浓度计的组成为含1.5mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、30g/L薦 糖和7g/L的MS培养基。
[0105] 分化培养基按浓度计的组成为含O.lmg/L NAA、0.1mg/L 2,4-D、lmg/L 6-BA、30g/ L薦糖和7g/L的MS培养基。
[0106] 生根培养基按浓度计的组成为含1.5mg/L NAA、0.3mg/L PP333和lOOmg/L生根粉的 1/2MS培养基。
[0107] Ξ圃繁殖建立:本实施例中的Ξ圃繁殖建立与实施例一提供的Ξ圃繁殖建立步骤 基本相同，不同之处在于：
[0108] 本实施例中优选在将株系圃里生长1年的健壮无病的绞股蓝株系植株的根茎和扩 繁圃里生长1年的健壮无病的绞股蓝植株根茎进行种植之前，先用稀释2000倍的农用链霉 素浸润，并且均在0.5min后拱出。
[0109] 种植管理:本实施例中的种植管理与实施例一提供的种植管理步骤基本相同，不 同之处在于：
[0110] 本实施例中采用铺地栽培模式对大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎进行 种植，且大田的底肥每亩施用腐熟有机肥5000kg、复合微生物菌剂肥化g和富砸生物有机肥 80kg〇
[01川实施例兰
[0112] -种富有机砸甘味绞股蓝的种植方法，其步骤包括：
[0113] 外植体选择:本实施例中提供的外植体选择步骤与实施例二中提供的基本相同， 不同之处在于:本实施例中进行外植体选择的筛选培养基按浓度计的组成为含1.5111邑/16- BA，0.3mg/L NAA，40g/L薦糖和8g/L琼脂的MS培养基。
[0114] 组织培养：本实施例的组织培养是在溫度为26°C、光照时间13h/d、光照强度为 20001X的条件下进行。
[0115] 愈伤组织诱导培养基按浓度计的组成为含2mg/L 6-BA、0.4mg/L NAA、40g/L薦糖 和8g/L琼脂的MS培养基。
[0116] 分化培养基按浓度计的组成为含0.3mg/L NAA、0.3mg/L 2,4-D、1.5mg/L 6-BA、 40g/L薦糖和8g/L琼脂的MS培养基。
[0117] 生根培养基按浓度计的组成为含2mg/L NAA、0.4mg/L PP333和llOmg/L生根粉的1/ 2MS培养基。
[0118] 炼苗:本发明实施例在将组培苗移栽到苗圃之前，先对组培苗进行炼苗。当组培苗 生根数达10条、苗高5cm时，进行炼苗:在遮荫网下将瓶盖或封口膜打开，适时在培养基表面 补加薄层的无菌水，适应5d后将苗移出，小屯、洗尽残余培养基后移栽到装有营养±的营养 鉢中培养。培养鉢置于遮荫棚内，保持溫度15°CW上，湿度90%左右，成活率平均达到98%， 栽后7d恢复正常生长，15d后植株达10cm左右，1个月后，株高可达20畑1。
[0119] Ξ圃繁殖建立:将经过炼苗后的组培苗移栽到苗圃中建成株系圃；将株系圃里生 长1年的绞股蓝株系植株的根茎进行种植建成扩繁圃;将扩繁圃生长1年的绞股蓝植株的根 茎进行种植建成大田用种圃。
[0120] 本实施例中的Ξ圃繁殖建立与实施例一提供的Ξ圃繁殖建立步骤基本相同，不同 之处在于：
[0121] 本实施例中优选在将株系圃里生长1年的健壮无病的绞股蓝株系植株的根茎和扩 繁圃里生长1年的健壮无病的绞股蓝植株根茎进行种植之前，先用稀释2200倍的农用链霉 素浸润，并且均在0.6min后拱出。
[0122] 种植管理:本实施例中的种植管理与实施例一提供的种植管理步骤基本相同，不 同之处在于：
[0123] 本实施例中采用玉米间套作种植模式对大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根 茎进行种植，且大田的底肥每亩施用腐熟有机肥5500kg、复合微生物菌剂肥3kg和富砸生物 有机肥90kg。
[0124] 经本发明实施例提供的富有机砸甘味绞股蓝的种植方法种植制得的甘味绞股蓝 进行分析，包括对甘味绞股蓝的有效成分分析、甘味绞股蓝全茎叶卫生指标分析W及总砸 和有机砸含量分析，具体数据参见表1、表2和表3。
[0125] 表1.甘味绞股蓝的有效成分；
[01 %]表2.甘味绞股蓝全茎叶卫生指标；
[0127] 表3.甘味绞股蓝全茎叶砸含量
[0128] (一)甘味绞股蓝的有效成分分析
[0129] 根据农业部食品质量监督检验测试中屯、(武汉）的检测结果，甘味绞股蓝的有效成 分如下：
[0130] 表1.甘味绞股蓝的有效成分
[0131]
[0132] 从W上结果看："恩屯叶甜"、"恩五叶蜜"中的人参皂武、维生素 Bl、维生素 E及氨基 酸总量均高于原变种。
[0133] (二)甘味绞股蓝全茎叶卫生指标分析
[0134] 根据农业部食品质量监督检验测试中屯、（武汉）的检测结果，甘味绞股蓝全茎叶卫 生指标如下：
[01巧]表2.甘味绞股蓝全茎叶卫生指标
[0136]
[0137] 甘味绞股蓝全茎叶检测结果符合绿色产品的相关指标。
[0138] (Ξ)甘味绞股蓝全茎叶砸含量分析
[0139] 根据国家富砸产品质量监督检验中屯、(恩施)的检测结果，甘味绞股蓝全茎叶总砸 和有机砸含量如下：
[0140] 表3甘味绞股蓝全茎叶砸含量
[0141]
[0142] 甘味绞股蓝全茎叶检测结果总砸和有机砸含量符合DBS42/002-2014《富有机砸食 品砸含量要求》的指标。
[0143] W上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实 施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
【主权项】
1. 一种富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，包括： 组织培养:将甘味绞股蓝的外植体接种到培养基上，进行组织培养，获得组培苗，所述 组织培养包括愈伤组织诱导培养、丛生芽分化培养和生根培养； 三圃繁殖建立:将所述组培苗移栽到苗圃中建成株系圃；将所述株系圃里生长1年的绞 股蓝株系植株的根茎进行种植建成扩繁圃；将所述扩繁圃生长1年的绞股蓝植株的根茎进 行种植建成大田用种圃；以及 种植管理:将所述大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎种植到大田。2. 根据权利要求1所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，还包括在所述 组织培养之前进行外植体选择，将经过消毒处理的待选外植体放入筛选培养基中培养筛选 出所述外植体，所述待选外植体包括茎尖、茎段和叶片;所述筛选培养基是在MS培养基中加 入0.5~1.5mg/L 6_ΒΑ、0· 1~0.3mg/L NAA、20~40g/L鹿糖和6~8g/L琼脂制成；所述外植 体为所述茎尖，所述甘味绞股蓝为恩五叶蜜或恩七叶甜。3. 根据权利要求2所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，所述消毒处理 包括将所述外植体用洗洁精或浓度为5 %的洗衣粉漂洗3~8min后，用流水冲洗0.5~Ih，接 着用75%乙醇浸泡25~35s，无菌去离子水冲洗4~6遍，接着放入浓度为0.1 ^HgCl2溶液中 振荡消毒7~IOmin或用次氯酸钠消毒22~27min，接着用无菌去离子水冲洗5~6次。4. 根据权利要求1所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，所述组织培 养，在温度为24~26°C、光照时间为11~13h/d、光照强度为1500~20001x的条件下进行。5. 根据权利要求4所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，所述愈伤组织 诱导培养包括将所述外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，所述外植体上形成愈伤组织， 所述愈伤组织诱导培养基是在MS培养基中加入1~2mg/L 6-BA、0.2~0.4mg/L NAA、20~ 40g/L蔗糖和6~8g/L琼脂制得。6. 根据权利要求5所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，所述丛生芽分 化培养包括将所述愈伤组织转接到分化培养基中，并分化出丛生芽，所述分化培养基是在 MS培养基中加入0.1 ~0.3mg/L ΝΑΑ、0·1 ~0.3mg/L 2,4-D、0.5~1.5mg/L 6-BA、20~40g/L 蔗糖和6~8g/L琼脂的。7. 根据权利要求6所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，所述生根培养 包括将所述丛生芽转接到生根培养基中，生长出根，形成所述组培苗，所述生根培养基是在 1/2MS培养基中加入1~2mg/L ΝΑΑ、0·2~0..4mg/L PP333和90~110mg/L生根粉的。8. 根据权利要求1所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，在建立所述扩 繁圃和所述大田用种圃时，分别将所述株系圃生长1年的绞股蓝株系植株的根茎和所述扩 繁圃生长1年的绞股蓝株系植株的根茎用稀释2000倍的农用链霉素浸润0.5~Imin捞出，按 3-4个茎节为1段，截为种根，按株行距15cmX 15cm种植，每穴1根，分别建立所述扩繁圃和所 述大田用种圃。9. 根据权利要求1所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，所述种植管理 中，在将所述大田用种圃内生长1年的绞股蓝植株的根茎种植到大田时，先对大田进行施 肥，所述施肥包括每亩施用腐熟农家肥4500~5500kg、复合微生物菌剂肥1~3kg和硒含量 300mg/kg的富硒生物有机肥70~90kg。10. 根据权利要求9所述的富有机硒甘味绞股蓝的种植方法，其特征在于，在生长盛期 施用复合微生物菌剂肥，在茎叶采摘期施用富有机硒液态肥，所述富有机硒液态肥是通过 将枯草芽孢杆菌接种到试管复壮培养基中培养形成试管种，接着将所述试管种接种到发酵 罐中进行发酵制得;其中，所述试管复壮培养基的组成包括:6g/L葡萄糖、5g/L蔗糖、5g/L牛 肉膏、5g/L蛋白胨、4g/L氯化钠、18g/L琼脂;所述发酵罐内包括:6g/L葡萄糖、5g/L鹿糖、5g/ L牛肉膏、I Og/L蛋白胨、4g/L氯化钠，生物发酵消泡剂I g/L。
【文档编号】A01H4/00GK105875412SQ201610271020
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】郑威, 刘金龙
【申请人】湖北省农业科学院农业经济技术研究所, 刘金龙