一种井冈霉素在制备几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种井冈霉素在制备几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的应用，井冈霉素能够导致昆虫发生畸形甚至死亡，并导致褐飞虱几丁质的相对含量显著降低，有效浓度范围为0.1～10μg/μl，本发明能够应用于害虫防治中新型杀虫剂的开发。
【专利说明】
一种井冈霉素在制备几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的 应用 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及一种海藻糖酶抑制剂对昆虫几丁质代谢相关蛋白的调控作用，特别涉 及Va I i damy C i η对昆虫几丁质代谢相关蛋白的调控作用及其效果评价。 (二)
【背景技术】
[0002] 我国是世界上农作物有害生物发生最为严重的国家之一。农作物生物灾害发生频 繁、为害严重、损失巨大。害虫一直严重威胁全球农作物的安全生产(植物保护工程建设规 划（2006-2010年），据报道全球约有植物重要害虫6000多种，其中，在我国有发生的比例达 到30%，为1800多种。据估计，全球每年仅害虫危害造成的产量损失已达总产量的18%，经 济损失达1000亿美元，其中仅每年用于植食性害虫防治的费用就达75.6亿美元。且目前至 少有30种农作物害虫对40种杀虫剂产生了不同程度的抗药性，采用传统的单一农药控制害 虫的为害将会越来越困难。由此，害虫防治的指导思想也已从"杀死害虫"转变为"调控害 虫"。通过调控害虫的生长发育将成为害虫控制的重要手段，关键在于要找到能够起调控作 用的靶标基因和开发出合适的生物农药。
[0003] 海藻糖作为一种应激代谢产物，其含量可随环境条件的变化而变化，其在各种逆 境条件下能够起到保护作用，并且还能作为信号分子调控了糖酵解过程。海藻糖不但是昆 虫血淋巴中的重要糖类物质，也是昆虫的"血糖"，广泛存在于幼虫、蛹和成虫阶段。海藻糖 不仅可以作为能量物质为昆虫的生长发育和生命活动提供所需能量，而且在冷冻和干旱等 逆境下可以大量合成，保护机体免受环境胁迫，从而提高昆虫的生命力和活动能力。
[0004] 海藻糖酶作为昆虫能量代谢必不可少的一类酶，也是昆虫体内合成几丁质途径的 第一个酶。研究发现海藻糖酶的表达被抑制后，通过调控昆虫的内部代谢能够杀死害虫。由 于海藻糖酶及其基因的重要性，其已经成为害虫控制的重要靶标之一，具有实际农药意义 的有效新型海藻糖酶抑制剂产品正在开发。各类海藻糖酶抑制剂相继出现，效果较好的有 井冈霉素(Validamycin)、井冈霉亚基胺A、Trehazolin等，抑制作用主要是通过与海藻糖酶 活性位点上的氨基酸相互结合形成复合物，竞争性地抑制海藻糖酶的活性来实现的。这些 以海藻糖酶作为害虫控制靶标的潜在杀虫剂的杀虫机理以及杀虫效果的研究对开发出新 型杀虫剂具有十分重要的意义。 (三)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种Validamycin对昆虫几丁质代谢相关蛋白的调控作用， \%11(^1117〇;[11使昆虫几丁质合成酶以及几丁质酶在1]11?嫩水平的表达下降，导致昆虫发生畸 形甚至死亡，并导致昆虫几丁质相对含量显著降低。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种井闪霉素在制备几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的应用。
[0008] 进一步，所述几丁质代谢相关蛋白为几丁质合成酶或几丁质酶。
[0009] 进一步，所述几丁质合成酶为下列基因之一编码蛋白：CHSUCHSla或CHSlb。
[0010] 进一步，所述几丁质酶为下列基因之一编码蛋白：Chtl、Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、 Cht7或Cht9〇
[0011] 进一步，所述抑制剂中井闪霉素有效浓度为O.l-lOyg/yl。
[0012] 进一步，所述有效浓度优选为5-10ygAU。
[0013]进一步，所述几丁质代谢相关蛋白来自水稻褐飞虱(Nilaparvata lugens)。
[0014]所述的Val idamycin对昆虫几丁质代谢相关蛋白的调控作用的效果评价，所述的 效果评价为:利用超微量显微注射的方法将浓度为〇. 1、〇. 5、1、5、IOygAU的Val idamycin分 别注射到昆虫体内，于注射后48h观察其在变态发育过程中的形态变化，然后统计其死亡率 和畸形率并测定昆虫几丁质的相对含量，进一步，所述的Validamycin对昆虫几丁质代谢相 关蛋白的调控作用的效果评价为:将浓度为0.1、〇. 5、1、5、10yg/yl的Val idamycin注射到褐 飞虱体内，于注射后48h观察其在变态发育过程中的形态变化，然后统计其死亡率和畸形率 并测定昆虫体内几丁质的相对含量，结果显示0.1、〇 . 5、1、5、lOyg/yl的Validamycin注射 48h后褐飞虱出现三种主要的畸形形态，分别为蜕皮困难、翅型异常以及蜕皮困难且翅型异 常。三种畸形的所占的比例不同，其中蜕皮困难和蜕皮困难且翅型异常所占的畸形百分比 较高。0.1、0.5、1、5、IOygAU的Validamycin注射48h后褐飞虱体内几丁质含量均显著下降。 [0015]本发明设置VaI idamyciη的高、中、低三个浓度，采用超微量显微注射的方法对褐 飞虱进行显微注射，于注射后48h统计褐飞虱的死亡率(结果见表1)，根据高、中、低浓度的 Val idamycin注射48h后褐飞虱的死亡率，获得Val idamycin的有效浓度范围为0.1~lOyg/y 1，然后设置〇. 1、〇.5、1、5、1(^8/^1这5个浓度的\%1丨(^1115^;[11对褐飞虱进行显微注射，于注 射后48h测定昆虫体内海藻糖酶活和几丁质合成酶、几丁质酶及几丁质酶复合体基因的相 对表达量。具体方法如下：
[0016] 本发明设置高、中、低三个浓度的Validamycin，分别为15、2.5和0. lyg/μL，采用显 微注射的方法将其注射到5龄第一天的活体褐飞虱若虫体内，于注射后48h统计褐飞虱的死 亡率。高、中、低三个浓度的Validamycin注射后48h褐飞虱的死亡率分别为70%、30%和 10%，根据这一结果，获得Validamycin的有效浓度范围为0 · 1~IOygAU，并确定0 · 1、0· 5、 1、5、lOyg/yl 这5个有效的Validamycin 浓度。
[0017] 利用超微量显微注射的方法将浓度为〇 · 1、〇· 5、1、5、IOygAU的Validamycin分别 注射到昆虫体内，于注射后48h测定昆虫体内海藻糖酶活性，并测定几丁质合成酶基因和几 丁质酶及几丁质酶复合体的相对表达量。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了井闪霉素在制备 几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的应用，Val idamycin能够导致昆虫发生畸形甚至死亡， 并导致褐飞虱几丁质的相对含量显著降低，有效浓度范围为0.1~ioyg/μL，本发明能够应 用于害虫防治中新型杀虫剂的开发。 (四）【附图说明】
[0019] 图1褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后的海藻糖酶酶活性变化:海藻糖酶 包括可溶性海藻糖酶和膜结合海藻糖酶;*表示P〈〇. 05，差异显著，**表示P〈0.01，差异极显 著，下同；
[0020] 图2褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h几丁质合成酶的相对表达情况:CHSl 及其两个可变剪接体CHSla和CHSlb的相对表达量；
[0021] 图3褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h几丁质酶及几丁质酶复合体的相对 表达情况：1〇个几丁质酶及成虫盘生长因子（Imaginal Disc Growth Factor,IDGF)基因和 β-Ν_乙酰葡糖胺内切酶(endoU-acetylglucosaminidase ,ENGase)基因的相对表达量 (A-L);
[0022]图4褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后的表型:A表示注射48h后褐飞虱的 畸形形态，B表不注射48h后褐飞虱三种畸形百分比，C表不注射48h后褐飞虱的死亡率和畸 形率；
[0023]图5褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后几丁质的相对含量。 (五)【具体实施方式】
[0024] 下面具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0025] 褐飞虱是水稻上的重要害虫，全世界各地都有分布，该虫具有繁殖速度快、生命周 期短、内禀增长率高、环境适应性强等特点，在外界环境适宜时极易暴发成灾，给水稻生产 造成巨大的损失。在下述实施例中以褐飞虱为例对本发明进行了详细说明。
[0026] 井闪霉素 （Validamycin ,technical)购自德国Dr .Ehrenstorfer公司。
[0027] 实施例1 =Validamycin有效浓度的筛选
[0028] 1.实验材料:褐飞虱(Nilaparvata Iugens)来自本实验室饲养种群，供试虫源来 自浙江农科院杭州种群。褐飞虱的饲养条件为：温度25土 TC，光照比16L:8D，相对湿度为 70%。褐飞虱饲养水稻品种为TNl。
[0029] 2.褐飞虱Validamycin的显微注射：用无菌水配制高、中、低三个不同浓度的井冈 霉素注射液，分别为15μ〖/μ1、2.5μ〖/μ1、0.1μ〖/μ1。注射前首先用标准毛细管定量每次注射 器栗出的井闪霉素注射液的体积，并通过调整氮气压来调整井闪霉素注射液的体积使其符 合注射量。将5龄第一天活体褐飞虱用CO 2气体麻醉后放至注射盘上，使其腹部朝上，注射腹 面口器末端，注射量为IOOnl/头，注射后将其放至装有新鲜水稻苗的试管中，于注射后48h 观察死亡率，结果见表1所示。
[0030] 表1高、中、低三个浓度梯度Validamycin注射后的死亡率
[0032] 注:数据为平均数土标准差，对照组为无菌水注射组。
[0033] 表1的结果表明注射15、2.5、0.1以8/^1三个浓度梯度的￥&1丨(1 &11^(^114811后褐飞虱 的死亡率依次为70%、30%和10%，为了便于后续实验海藻糖酶活的测定，预期褐飞虱的死 亡率为1〇%_50%，确定0· 1、0·5、1、5、lOyg/yl这5个Validamycin的注射浓度。
[0034] 实施例2:褐飞虱注射有效浓度的Validamycin48h后海藻糖酶活性的变化
[0035] 1.根据实施例1得到的Validamycin有效浓度的筛选结果，设置Validamycin的5个 有效浓度梯度（用无菌水配制），分别为O. I、〇. 5、I、5、10yg/yl，对5龄第一天的活体褐飞虱 若虫进行超微量显微注射，方法同实施例1，于注射后48h取材进行后续定量实验。
[0036] 2.褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后海藻糖酶活性的测定：取30头褐飞 虱，加入1ml PBS冰浴超声破碎30min; 4°C，1000 g，离心20min;取350μ1上清4°C，20800g，超 离心lh;吸出超离心后的上清用于可溶性海藻糖酶活性和蛋白浓度的测定;沉淀用PBS洗两 次并用PBS悬浮，该悬浮液用于膜结合型海藻糖酶活性和蛋白浓度的测定。利用葡萄糖分析 试剂盒(Sigma)进行海藻糖酶浓度的测定，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)进行蛋白 浓度的测定，酶活性单位为mmol glucose/yg protein/minute，结果如图1所示。
[0037] 图1的结果表明，注射0.1、0.5、I、5、IOygAU这5个浓度的Validamycin48h后褐飞 虱体内可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶的活性均显著低于对照组(等量无菌水），表明 0.1、0.5、1、5、IOygAil这5个Validamycin注射浓度能有效抑制褐飞虱海藻糖酶活性。
[0038] 实施例3:褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后几丁质合成酶、几丁质酶及 其复合体基因的相对表达情况
[0039] 1.褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后几丁质合成酶基因的相对表达情况
[0040] 对实施例2方法注射0.1、0.5、1、5、1(^/^1的￥&11(1&11^(^114811后的褐飞虱分别进 行液氮研磨，抽提RNA，取总量Iyg的RNA进行cDNA单链合成，取反转录产物ΙμL用于qRT-PCR 的模板。qRT-PCR反应体系为20μ1，具体如下：正、反向引物各ΙμL，cDNA ΙμL，SYBR Premix ExTaq(Takara)IOyl，灭菌超纯水补至20μ1，引物序列如下：
[0041 ] CHSlF:5 '-CCGCAAACGATTCCTACAGA-3 '
[0042] CHSIR:5 '-AGGTCCTTGACGCTCATTCC-3 '
[0043] CHSIaF:5 '-TGTTCTTGCTACAACTCAATAAA-3 '
[0044] CHSlaR:5 '-ACACCAATCCGATAGGCTC-3 '
[0045] CHSIbF:5 '-GCTGTCTTTGCTTTCTTCAT-3 '
[0046] CHSlbR:5 '-ACACCAATCCGATAGGCTC-3 '
[0047] 18SF:5 '-CGCTACTACCGATTGAA-3 '
[0048] 18SR:5 '-GGAAACCTTGTTACGACTT-3 '
[0049] 褐飞虱几丁质合成酶基因 CHSl (包括CHSla和CHSlb)以及18S序列为公知序列。具 体的PCR程序为:94°C预变性5min，94°C变性15s，60°C退火30s，60°C延伸30s，40个循环。采 用2^ ΛΛΤ方法和STATISTICA6.0中的ANOVA进行数据分析，结果见图2所示。
[0050] 2.褐飞虱注射有效浓度的Validamycin48h后几丁质酶及其复合体基因的相对表 达情况
[0051 ] 对实施例2方法注射0.1、0.5、1、5、1(^8/^1的￥&1丨(1 &11^(^114811后的褐飞虱进行几 丁质酶及其复合体的qRT-PCR检测，方法同上，引物如下：
[0052] ChtlF:5 '-AGGTGGTTAGGGACGAGGAG-3，
[0053] ChtlR:5 '-TGCGCTTGACATAGTTGGACT-3 '
[0054] Cht2F:5 '-GCAGATTTCTGGACAGGGAA-3 '
[0055] Cht2R:5，-TGACGCACAAGCGGGAAG-3 '
[0056] Cht3F:5 '-CTACACCTCTGGCTAAACTCGG-3 '
[0057] Cht3R:5 '-AACTTGTCCTTGCGGCTGAT-3 '
[0058] Cht4F:5 '-TTGAGGAGGTTCACGGGTCT-3 '
[0059] Cht4R:5 '-CCTTACTGGAAACGAGGTTGG-3 '
[0060] Cht5F:5 '-AAAGCGTTCGTGATGAAATAGC-3 '
[0061 ] Cht5R:5 '-GATCCTTTGCCTCAATCCAAT-3 '
[0062] Cht6F:5 '-GCTGGTAAGGAGATGCTATTCG-3 '
[0063] Cht6R:5 '-GTGGTTCTAAGGCTGGCTGTC-3 '
[0064] Cht7F:5 '-CTACTCTGCCATCCCATTCCT-3 '
[0065] Cht7R:5 '-GTCTGGGTTTCTTCACTTCCTG-3 '
[0066] Cht8F:5 '-GAACAAAGTGCAAACTCAGTCC-3 '
[0067] Cht8R:5 '-CACCTTCTGTGGCTTCTGG-3 '
[0068] Cht9F:5 '-GTGCGGTATTGGTTGAAGAGG-3 '
[0069] Cht9R:5 '-GGTATAACGTGATTCCGAGCC-3 '
[0070] ChtlOF:5-CAAGCCAATACCCAACAAAC-3 '
[0071] ChtlOR:5 '-ACAGCAAATCCATAGAGCACA-3 '
[0072] IDGFF:5，-AAAAGAACGAGGAGGAGGG-3，
[0073] IDGFR:5 '-TTGCTTGAGGATGGGGTAC-3 '
[0074] ENGaseF:5 '-TGTGGCAAGACTTCGTTA-3 '
[0075] ENGaseR:5 '-ATGGGAGGGTTGGGATAG-3 '
[0076] 褐飞虱几丁质酶及几丁质酶复合体基因Chtl、Cht2、Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、Cht7、 Cht8、Cht9、ChtlO、IDGF和ENGase的序列为公知序列。
[0077]结果如图3所示。
[0078] 图2和图3的结果显示，注射0 · I、0 · 5、1、5、IOygAU的Val idamycin48h后褐飞虱体 内CHSl及其两个剪接体CHSla和CHSlb的相对表达量均显著低于对照组(等量无菌水），且随 着Validamycin注射浓度的升高CHSl (包括CHSla和CHSlb)基因的相对表达量越低。Chtl、 Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、Cht7和Cht9这7个基因的相对表达量均显著低于对照组，表明 Validamycin能有效的抑制几丁质合成酶及几丁质酶基因的表达。
[0079] 实施例4: Validamycin对昆虫几丁质代谢相关蛋白的调控作用的效果评价
[0080] 1.褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后的变态发育情况
[0081 ] 对实施例2方法注射0.1、0.5、1、5、IOygAU的Validamycin 48h后褐飞虱进行表型 观察，并统计其畸形率和死亡率，结果如图4所示。
[0082] 2.褐飞虱注射有效浓度的Validamycin 48h后的几丁质相对含量的测定
[0083] 首先将实施例2方法注射0.1、0·5、1、5、IOygAU的Validamycin 48h后的30头褐飞 虱用清水冲洗干净，置于滤纸上，50°C烘箱内烘干，约4d;然后将烘干的褐飞虱研磨成粉末， 在电子分析天平上称重，记为Wl;之后将已知质量的褐飞虱粉末倒入消化管中（自制消化 管:取试管一根，配以橡皮塞，在橡皮塞上钻5mm孔，插上玻璃管，橡皮塞外端的玻璃管上再 接一根橡皮管，长30-50cm，橡皮管的另一端再接一根玻璃管，并将开口的玻璃管通入水槽 内，以防止加热时碱液溅出），向消化管中加入5ml饱和氢氧化钾，160°C甘油浴15-20min;再 用滤纸过滤残渣，然后用缓慢的流水冲洗干净，将残渣置于50°C烘箱中烘lh，在分析天平称 重，计为W2;最后结果计算，几丁质的相对含量=^χ1.26χ100 (%)(其中！.26-转换 π 1 系数，转换系数=乙酰氨基相对分子质量/氨基葡萄糖相对分子质量）。
[0084] 结果如图5所示，0.1、0.5、l、5、10ygAU这5个浓度的Validamycin注射组的褐飞虱 几丁质相对含量分别为16.3%、10.33%、9.50%、8.70%和8.20%，而对照组的褐飞虱几丁 质相对含量为21.36%，0.1、0.5、1、5、IOygAU这5个浓度的Validamycin注射组的褐飞虱几 丁质相对含量均显著低于对照组。
[0085] 图4和图5的结果表明，Validamycin能够导致褐飞虱畸形甚至死亡，畸形率和死亡 率随着Validamycin浓度的增加而增加，在Validamycin注射浓度为0. lyg/yl时褐飞虱的畸 形率和死亡率最低，分别为13.33%和10%，在Validamycin注射浓度为IOygAU时褐飞虱的 畸形率和死亡率最高，分别为37.78%和56.67%。其次，在Validamycin注射浓度为5yg/yl 时褐飞虱的畸形率和死亡率分别为32.22%和37.63%，与Validamycin注射浓度为IOygAU 时的死亡率相差较大，但畸形率相差不大，表明Validamycin注射浓度为5ygAU和IOygAU 均能导致褐飞虱高畸形率，Validamycin对昆虫几丁质代谢相关蛋白的调控作用的有效浓 度优选为5_10yg/yl之间的浓度。褐飞虱注射0.1、0.5、1、5、10yg/yl的Validamycin48h后均 出现三种主要的畸形形态，分别为蜕皮困难、翅型异常以及蜕皮困难且翅型异常。三种畸形 形态的表现程度不同，蜕皮困难且翅型异常所占的比例较高，其次为蜕皮困难。此外，注射 0.1、0.5、1、5、1(^8/^1这5个有效浓度的\^11(1&11^(^11还能够导致褐飞虱的几丁质相对含量 降低，且随着Validamycin注射浓度的升高，几丁质的相对含量越低。
【主权项】
1. 一种井闪霉素在制备几丁质代谢相关蛋白活性抑制剂中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述几丁质代谢相关蛋白为几丁质合成酶或 几丁质酶。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述几丁质合成酶为下列基因之一编码蛋白： CHSl、CHSla或CHSlb〇4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述几丁质酶为下列基因之一编码蛋白： Cht 1、Cht3、Cht4、Cht5、Cht6、Cht7 或 Cht9。5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述抑制剂中井闪霉素有效浓度为0.1-10yg/ μ1〇6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述有效浓度为5-10ygAU。7. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述几丁质代谢相关蛋白来自水稻褐飞虱。
【文档编号】A01N43/16GK105961393SQ201610312281
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】唐斌, 杨萌萌, 沈祺达, 王世贵
【申请人】杭州师范大学