一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法
【专利摘要】本发明涉及一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。该具体包括如下步骤：亲本材料的播种；花期杂交授粉；考种；组织培养获得杂种苗；无菌苗驯化；杂种形态学鉴定；杂种的细胞学鉴定方法。本发明根据萝卜和芸薹属远缘杂交，受精前障碍较严重，而授粉后障碍较轻的特点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度甘氨酸到母本柱头上的方法，来改善属间杂交的亲和性，授粉后，采取的是自然结荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获得了杂种苗并对其进行了形态学和细胞学的鉴定，确定是真实的属间三倍体杂种。
【专利说明】
一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。
【背景技术】
[0002] 萝卜是十字花科植物中芸薹属(Brassica)的近缘属，自上个世纪20年代以来，通过 人工杂交、组织培养和体细胞融合等技术，成功合成了萝h甘蓝、萝h白菜两个双二倍体新 物种并被命名为新的物种，以及一系列的附加系。由于远缘杂交的生殖隔离、种间杂种的不 亲和性、杂种败育以及杂种不育等共性问题，为了获得有性杂交的杂种，人们采用了多种技 术和方法，包括嫁接、混合授粉、切柱头、化学药物处理等，但这些技术和方法对芸薹属与萝 卜的远缘杂交，效果不大。房相佑在研究萝卜与芸苔野生种属间杂交时发现:萝卜与芸苔种杂 交时，芸苔种的花粉能较好地萌发，但是花粉管伸长受到很大妨碍，只有少数花粉管到达胚 珠，受精后障碍相对较轻，母体内杂种胚很多能发育成熟。在授粉前，使用不同的浓度激素 处理萝卜的柱头，增加芜菁花粉在萝卜柱头上的伸长，完成受精作用，对于其杂交成功的角果 采用组织培养的技术手段，获得杂种后代。这些新型材料，一方面，可作为新型蔬菜和饲料 作物，另一方面，萝卜中有利的性状导入到芸薹属植物中，创造出特异的遗传研究材料，用于 细胞学和分子学研究。再一方面，作为桥梁，可以显著提高芸薹属和萝卜属的杂交亲和性。
[0003] 梅时勇等公开的发明专利授权公告号为CN 102210259 B，发明名称为:一种萝卜与 芜菁属间远缘杂交获得离体胚的方法，该方法采用了花期重复授粉以及对授粉后荚果内种 胚进行离体胚培养的方法，获得了一定的成苗率，但未对杂种的真实性进行鉴定。
【发明内容】
[0004] 本发明解决的技术问题是:提出一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是:一种创制萝卜和芜菁属间杂种 的方法，具体包括如下步骤：
[0006] (1)亲本材料的播种:为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月 份播种芜菁材料；
[0007] (2)花期杂交授粉:次年3-4月份，以萝卜为母本，以芜菁为父本，采用人工去雄、蕾 期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；
[0008] (3)考种:6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；
[0009] (4)组织培养获得杂种苗:9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、 生长；
[0010] (5)无菌苗驯化;待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖 进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑 料大棚中，进行常规管理；
[0011] (6)杂种形态学鉴定:采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及 游标卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、 雌蕊长，花粉情况，每次测量重复3次；
[0012] (7)杂种的细胞学鉴定方法:取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。
[0013]优选的，所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60 X 80cm;每穴播种2~3粒种子，出苗后，待植株长至5~10cm，进行间苗，每穴保留一株;常规田 间管理。
[0014]优选的，所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：
[0015] (1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保 留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；
[0016] (2)使用质量浓度为100mg/L的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸；
[0017] (3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组 合、授粉时间。
[0018] 优选的，所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：
[0019] (1)种子首先进行70%乙醇处理lmin;
[0020] (2)6%次氯酸钠溶液处理15min;
[0021] (3)无菌水冲洗4~5次；
[0022] (4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；
[0023] (5)接种于1 /2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子；
[0024] (6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为:室温25°C，光照时间为16h/d，光 照强度为20001UX条件下培养，获得无菌苗。
[0025] 优选的，所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：
[0026] (1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇:氯仿：乙酸=5:2: 3进行固定，一 天后更换新的固定液，于4°C冰箱保存备用；
[0027] (2)制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至 70 %乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；
[0028] (3)使用4 %的纤维素酶RS和4 %的果胶酶Y-23混合溶液，37 °C酶解2h 1 Omin;
[0029] (4)水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。
[0030] 有益效果：
[0031 ]本发明根据芸薹属和萝卜远缘杂交，受精前障碍较严重，而授粉后障碍较轻的特 点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度甘氨酸到母本柱头上的方法，来改善属间杂交 的亲和性，而授粉后，采取的是自然结荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获 得了杂种苗并对其进行了形态学和细胞学的鉴定，确定是真实的属间三倍体杂种。
[0032]本发明采用人工去雄的方式进行蕾期杂交授粉，人工授粉中采用甘氨酸（Gly: 100mg/L)溶液涂抹柱头的方法，促进了受精及子房和胚的发育，对改善属间杂交的亲和性， 克服萝卜与芜菁杂交的授粉前障碍有较好效果。收获的种子采用组织培养的方式进行无菌 培养。获得了萝卜(2n = 18)和芜菁(2n = 20)的异缘三倍体的属间杂种(染色体数2n = 28)，本 发明一方面创造出了新型遗传材料，有助于探明物种间的种属进化关系;培育异附加系，在 促进物种之间的基因渐渗和分子细胞遗传研究有着重要的作用；另一方面，培育的种间杂 种，作为桥梁物种，有助于增加萝卜属和芸薹属的杂交亲和性，同时有助于转移萝卜属中的优 异性状到芸薹属作物中，丰富作物的育种基础。在特异新品种的培育方面，具有较高的实用 价值。
【附图说明】
[0033]下面结合附图对本发明的作进一步说明。
[0034]图1是萝卜-芜菁亲本及杂种形态图（从左至右，依次为：14R9、萝卜-芜菁杂种、13W9) [0035]图2是萝卜-芜菁亲本及杂种花形态图（从左至右，依次为：14R9、萝卜-芜菁杂种、 13W9)
[0036]图3是萝卜-芜菁属间杂种的染色体图
【具体实施方式】 [0037] 实施例1
[0038] -种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，具体包括如下步骤：
[0039] 1、亲本材料的播种:为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份 播种芜菁材料;播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60 X 80cm;每穴播种2~3粒种子， 出苗后，待植株长至5~10cm，进行间苗，每穴保留一株;常规田间管理。
[0040] 2、花期杂交授粉:次年3-4月份，以萝卜为母本，以芜菁为父本，采用人工去雄、蕾期 采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交;具体为：
[0041] (1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保 留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；
[0042] (2)使用质量浓度为100mg/L的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸；
[0043] (3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组 合、授粉时间。
[0044] 3、考种:6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；
[0045] 4、组织培养获得杂种苗:9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生 长;具体步骤为：
[0046] (1)种子首先进行70%乙醇处理lmin;
[0047] (2)6%次氯酸钠溶液处理15min;
[0048] (3)无菌水冲洗4~5次；
[0049] (4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；
[0050] (5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子。
[0051 ] (6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为:室温25°C，光照时间为16h/d，光 照强度为20001UX条件下培养，获得无菌苗；
[0052] 5、无菌苗驯化;待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖 进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑 料大棚中，进行常规管理；
[0053] 6、杂种形态学鉴定:采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及 游标卡尺，分别统计其株高(cm)、叶形、叶片大小(长X宽，cm)、花色、花蕾大小(长X直径， mm)、花萼大小（长X宽，mm)、花瓣大小(mm)、雄蕊长(mm)、雌蕊长(mm)，花粉情况，每次测量 重复3次；
[0054] 7、杂种的细胞学鉴定方法:取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。具体步骤 为：
[0055] (1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇:氯仿：乙酸=5:2: 3进行固定，一 天后更换新的固定液，于4°C冰箱保存备用；
[0056] (2)制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至 70 %乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；
[0057] (3)使用4 %的纤维素酶RS和4 %的果胶酶Y-23混合溶液，37 °C酶解2h 1 Omin;
[0058] (4)水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。
[0059] 图1，母本萝卜分枝性较弱，叶片宽大;杂种分枝性较母本弱，叶片较少且大;父本芜 菁，分枝性强，叶片较小;结合表2的表型数据，叶形、叶片大小、花色，杂种处于偏亲表现;花 蕾大小，杂种表现介于双亲之间；而株高、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊长，杂种表现出 超亲优势;杂种微粉，是杂种不育的典型表现；
[0060] 图2,母本萝卜14R9的花色为白色，边缘浅粉，花型蜻蜓状，对称花夹角大;萝卜-芜菁 杂种同母本萝卜花色相似为白色，花型与父本相似，为蝴蝶状，对称花夹角较小；父本芜菁 13W9，花色为黄色，花型为蝴蝶状，对称花夹角较小；
[0061] 图3,染色体条数，共计为28条，证明我们获得了萝卜（2n=18)和芜菁(n=10)的异 缘三倍体的属间杂种(染色体数2n = 28);
[0062] 表1萝卜-芜菁属间杂种的获得
[0063]
[0064]表2杂种的形态学鉴定
[0065]
[0066] 实施例2
[0067] 实施例2的一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，具体步骤同实施例1的创制萝卜和 芜菁属间杂种的方法，不同之处在于：
[0068] 所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，每穴播种2~3粒种子，出苗后，待植株 长至一定大小，进行间苗，每穴保留一株;常规田间管理。
[0069] 所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：
[0070] (1)首先对母本花序进行整理，对合适大小的花蕾，进行剥蕾、去雄；
[0071] (2)使用一定质量浓度的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸；
[0072] (3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组 合、授粉时间。
[0073] 所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：
[0074] (1)种子首先进行70 %乙醇预处理；
[0075] (2)消毒处理；
[0076] (3)无菌水冲洗4~5次；
[0077] (4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；
[0078] (5)接种于1 /2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子；
[0079 ] (6)放置在组织培养室内进行培养，获得无菌苗。
[0080] 所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：
[0081] (1)取花序中间小花蕾，卡诺固定液进行固定，一天后更换新的固定液，于4°C冰箱 保存备用；
[0082] (2)制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至 70 %乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；
[0083] (3)使用混合溶液进行酶解；
[0084] (4)水洗、固定，制片，显微镜下统计染色体数并拍照。
[0085]本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术 方案均为本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，具体包括如下步骤： (1) 亲本材料的播种:为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播 种宪菁材料； (2) 花期杂交授粉:次年3-4月份，以萝卜为母本，以芜菁为父本，采用人工去雄、蕾期采 用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交； (3) 考种:6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号； (4) 组织培养获得杂种苗:9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长； (5) 无菌苗驯化;待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行 练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大 棚中，进行常规管理； (6) 杂种形态学鉴定:采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标 卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊 长，花粉情况，每次测量重复3次； (7) 杂种的细胞学鉴定方法:取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。2. 根据权利要求1所述创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤1中亲本 材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60 X 80cm;每穴播种2~3粒种子，出苗后， 待植株长至5~10cm，进行间苗，每穴保留一株;常规田间管理。3. 根据权利要求1所述创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤2中的花 期杂交授粉具体为： (1) 首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花 序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄； (2) 使用质量浓度为100mg/L的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸； (3) 取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、 授粉时间。4. 根据权利要求1所述创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤4中的组 织培养获得杂种苗的具体步骤为： (1) 种子首先进行70 %乙醇处理lmin; (2) 6%次氯酸钠溶液处理1511^11; (3) 无菌水冲洗4~5次； (4) 无菌滤纸吸干种子上残存水分； (5) 接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10~15粒种子； (6) 放置在组织培养室内进行培养，培养条件为:室温25°C，光照时间为16h/d，光照强 度为20001UX条件下培养，获得无菌苗。5. 根据权利要求1所述创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，其特征在于:所述步骤7中的杂 种的细胞学鉴定方法的具体步骤为： (1) 取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇:氯仿：乙酸= 5:2:3进行固定，一天后 更换新的固定液，于4 °C冰箱保存备用； (2) 制片，从花序上挑取直径为0.5~1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70 %乙 醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药； (3) 使用4%的纤维素酶RS和4%的果胶酶Y-23混合溶液，37°C酶解2h lOmin; (4) 水洗、固定，制片、制片后加 DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。
【文档编号】A01H4/00GK105993912SQ201610339065
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】娄丽娜, 苏小俊, 娄群峰, 许园园
【申请人】江苏省农业科学院