一种雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法
【专利摘要】本发明公开了一种雌雄同体紫菜的双单倍体群体组建的方法；取颜色差异明显的雌雄同体紫菜叶状体(配子体)作为杂交亲本；将已形成精子囊的双亲叶状体混合培养，收集果孢子；选取具萌发管的果孢子单独培养成丝状体(孢子体)；诱导并获取该丝状体的壳孢子，培养至肉眼可见的F1叶状体，如90％以上的叶状体是含有双亲颜色的嵌合体，则用于组建双单倍体群体；分离四色块嵌合体上的每个色块，获取每个色块的单孢子或单离体细胞培养至肉眼可见的叶状体，通过该叶状体单棵培养和自体受精获得每棵四色块嵌合体上每个色块的纯系丝状体，组成双单倍体群体。本发明解决了雌雄同体紫菜双单倍体群体的组建问题，为其遗传连锁图谱的构建奠定基础。
【专利说明】
一种雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法。【背景技术】[00〇2]雌雄同体紫菜中的条斑紫菜(Pyropia yezoensis)是一种营养价值很高的大型食用海藻，在我国的长江以北地区被广泛栽培，每年创造约50亿元的经济效益，同时条斑紫菜的大规模栽培可转移和固定大量的碳(防止海洋酸化)以及氮和磷(防止富营养化)等元素， 对保持近海生态平衡具有十分重大的意义。条斑紫菜的栽培历史长达40余年，目前已形成了育苗、栽培、加工和销售等完整的产业化体系，相反，对于其遗传学等基础理论研究一直处于相对不足的地步，目前仍未见条斑紫菜遗传连锁图谱和物理图谱的相关报道。遗传连锁图谱的构建是基因组研究中的重要环节，是基因定位与克隆、基因组结构与功能研究的基础。目前，我国已构建了一大批作物、林木及药用植物的遗传连锁图，如水稻、小麦、玉米等经济作物，为人们从分子水平认识和了解植物特性与生长发育规律，进行重要性状的遗传分析、分离和克隆重要基因等作出了重大贡献。
[0003]海藻遗传连锁图谱的相关研究起步较晚，目前已在海带(Laminaria japonica)、 坛紫菜(Pyropia haitanensis)、裙带菜(Undaria p innatifi da)和水云(Ec to carpus siliculosus)中有遗传连锁图谱构建的报道。
[0004]条斑紫菜遗传图谱构建过程中的难点就是杂交，因为条斑紫菜是雌雄同体的种类，在杂交的过程中，自体受精和异体受精同时进行，且自体受精的概率要远高于异体受精，故在鉴定异体受精形成的杂合丝状体时难度较大。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]本发明涉及一种雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，所述方法包括如下步骤:
[0008]S1、选取叶状体颜色差异明显的雌雄同体紫菜叶状体(配子体)作为杂交亲本；
[0009]S2、选取已形成精子囊的双亲叶状体混合培养，至双亲叶状体上开始有果孢子囊的形成时，将双亲叶状体分开单独培养，直至各自叶状体上的果孢子囊发育成熟，分别收集果孢子；[001 〇] S3、当果孢子形成萌发管时，取单个萌发的果孢子单独培养，使其萌发成一个单克隆的丝状体(孢子体)藻落；
[0011]S4、培养所述单克隆的丝状体藻落经诱导后放散的壳孢子，至肉眼可见的？:叶状体，在显微镜下观察Fi叶状体的颜色及色块数量(可随机选取1000棵以上的？:叶状体)，如 90%以上的Fi叶状体为含有双亲颜色的嵌合叶状体且色块数为2块、3块或4块，则该单克隆的丝状体藻落是由双亲杂交而成的杂合丝状体，其FHf中有四个色块的嵌合叶状体可用于构建双单倍体群体；[〇〇12]S5、从含有四个色块的嵌合叶状体上分离单个色块，取该色块经诱导后放散的单孢子或单离体细胞，培养至肉眼可见的叶状体，取单棵培养，最终通过该单棵叶状体自体受精获得每棵四色块嵌合叶状体上每个色块的纯系丝状体，从而组建成双单倍体群体。
[0013]本发明中，用于杂交的双亲的叶状体颜色必须差异较大，且用肉眼很容易区分的。 必须选择四色块嵌合体作为群体构建的材料，防止破坏DH群体的遗传结构，造成严重的偏分离现象。从嵌合叶状体上分离的单个色块不能直接用于双单倍体群体的构建，必须以该色块的单孢子萌发的叶状体或体细胞再生的叶状体为材料，防止该色块在从嵌合体上分离下来之前就可能与其它色块发生受精，导致获得的丝状体是杂合的丝状体。
[0014]上述步骤S2中，如一直混合培养至发育成熟，再收集果孢子则不可行，因为如果混合培养至发育成熟，则亲本a上的果孢子有可能释放后粘附在亲本b的叶状体上，这样在收集亲本b的果孢子的时候可能会混有亲本a的果孢子，导致错误的结果；因为条斑紫菜是雌雄同体的，杂交过程中每个亲本叶状体上既形成雄性配子，也能形成雌性配子，也就是说每个亲本叶状体既可以做父本也可以做母本，所以在放散果孢子之前就要把双亲叶状体分开，这样的话，某棵叶状体上放散的果孢子的母本就是该叶状体，另一棵则是父本。[〇〇15] 优选的，步骤S2中，已形成精子囊的双亲叶状体是通过如下步骤获得的:取亲本丝状体的藻段置于温度25±l°c、光子通量密度20-30wnol m—2 ? s—S光周期10L:14D的条件下静置培养，培养液为添加2 % (v/v)MES营养液的消毒海水，培养至50 %以上的营养藻丝发育成熟，形成壳孢子囊枝;取出一半含有壳孢子囊枝的藻丝在温度19土 1°C，光子通量密度40_ 50wii〇l nf2 ? jT1，光周期10L:14D的条件下培养，培养液为添加2%(v/v)MES营养液的消毒海水，至成熟壳孢子囊枝释放壳孢子到培养液中；将含有壳孢子的培养液(用200目筛絹过滤获得壳孢子悬浮液)，继续培养至该壳孢子萌发的小叶状体长大，且至叶状体稍部开始形成精子囊，即可。
[0016] 优选的，步骤S2中，所述混合培养的培养温度19±1°C，光子通量密度40-50WI1O1 nf2 ? jT1，光周期10L:14D，培养液为添加2%MES营养液的消毒海水。[〇〇17]优选的，步骤S2中，叶状体上的果孢子囊发育成熟后，将叶状体取出在室温下阴干，再将叶状体置于消毒海水中1.5?2.5h，刺激果孢子囊放散出果孢子;每天重复一次，直至收集到足够数量的果孢子。
[0018]优选的，步骤S3中，当果孢子形成萌发管且萌发管的长度达到果孢子直径的3-5倍时，取单个萌发的果孢子进行单独培养。在果孢子形成萌发管且萌发管的长度达到果孢子直径的3-5倍时进行单独培养，可极大提高获得杂合果孢子的概率。
[0019]优选的，步骤S4中，单克隆的丝状体藻落经诱导后放散壳孢子包括如下步骤:取单克隆的丝状体藻落的藻段进行扩大培养，25?35d后取少量丝状体，取该丝状体的藻段置于温度25±1°C、光子通量密度20-30圓〇1 m—2 ? s—S光周期10L:14D的条件下静置培养，培养至50%以上的营养藻丝发育成熟，形成壳孢子囊枝;取出一半含有壳孢子囊枝的藻丝在温度19±1°C，光子通量密度40-50圓〇1 m—2 ? s—S光周期10L:14D的条件下培养，至成熟壳孢子囊枝释放壳孢子到培养液中，将含有壳孢子的培养液(用200目筛絹)过滤掉杂质后，既得壳孢子。
[0020]优选的，所述扩大培养的过程为取丝状体藻落，在消毒的塑料垫板上用消毒的单面刀片切碎，切碎后的藻段长度以l-2mm为宜，将所有藻段转移到含有100ml培养液的三角烧瓶中扩大培养，条件为温度19±1°C、光子通量密度40-50wnol m—2 ? s—S光周期10L:14D，静置培养。
[0021]优选的，步骤S5中，挑选含有四个色块的嵌合叶状体单独培养，当某一色块长至 0.8?1.2cm长时，将其切下单独培养并诱导其放散单孢子，如该色块经诱导仍无单孢子放散，则将该色块用海螺酶液处理获得单离体细胞。
[0022]优选的，步骤S5中，所述单孢子或单离体细胞在萌发至0.8?1.2cm时，进行单棵培养。
[0023]优选的，所述雌雄同体紫菜为条斑紫菜。
[0024]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0025]1、本发明解决了雌雄同体的条斑紫菜叶状体的杂交及杂合丝状体的鉴定等细节问题，并在此基础上构建了条斑紫菜遗传图谱的作图群体一双单倍体群体；
[0026]2、目前没有公开资料报道雌雄同体紫菜一条斑紫菜遗传连锁图谱的构建，而作图群体的构建是遗传图谱构建的基础，通过本发明构建雌雄同体紫菜双单倍体群体，从而为构建雌雄同体紫菜(如，条斑紫菜)遗传连锁图谱奠定基础。[〇〇27]3、遗传连锁图谱能指导基因组的大规模组装，同时也能定位重要经济性状的QTLs位点，为克隆重要功能基因奠定基础，故本发明是条斑紫菜基因组学研究的基础。
[0028]4、目前无公开资料报道条斑紫菜全基因组的完整图谱，本发明的成果将为全基因组的大规模组装提供有力工具。【附图说明】[〇〇29]图1为条斑紫菜野生色品系PY-LS及红色突变品系PY-HT的叶状体(日龄30d，标尺 5cm)；
[0030]图2为条斑紫菜果孢子沉底后萌发成的丝状体藻落；
[0031]图3为条斑紫菜具有双亲颜色组合的嵌合叶状体幼苗；
[0032]图4为条斑紫菜嵌合叶状体四个色块的丝状体；
[0033]图5为条斑紫菜四色块颜色嵌合体。【具体实施方式】[〇〇34]下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0035]实施例
[0036]1.1条斑紫菜杂交亲本叶状体(配子体)的选择和培养[〇〇37]作为杂交亲本的条斑紫菜应具有明显的形态学标记，一般选择具有肉眼可明显区分的颜色不同的藻体，本方案以条斑紫菜野生色品系PY-LS(图1，左图)及红色突变品系PY-HT(图1，右图)为例进行说明。除此以外，在考虑亲本间多态性差异与可育性的同时，应尽量选取亲缘关系相对较远、遗传差异性大和分子标记多态性强的材料作为杂交亲本，以利于开展优良性状基因的定位和克隆。
[0038]称取100mg湿重的亲本丝状体(孢子体)，置消毒的塑料垫板上，用消毒的单面刀片切碎成短的藻段，长度在1mm左右，转移至直径为90mm的玻璃培养皿中培养，以画十字的方式摇勾，使藻段在皿内均勾分布。将含有藻段的培养皿置于温度25± 1°C、光子通量密度20-30wii〇l nf2 ? jT1，光周期10L:14D的条件下静置培养。每隔5d检查发育情况，约30d左右，可见50 %以上的营养藻丝发育成熟，形成壳孢子囊枝。[〇〇39]用镊子从培养皿中取出一半的藻丝，放入含有200ml消毒海水的充气瓶中培养，另外放入一股维尼纶绳(长3-4cm)供壳孢子附着，培养温度19土 TC，光子通量密度40-50mi〇1 nf2 ? s'光周期10L:14D。在较低温度的刺激下，成熟壳孢子囊枝进一步形成双分孢子，释放到培养液中即壳孢子，壳孢子在水流的作用下附着到维尼纶绳上。取出附着壳孢子的维尼纶绳移至新的充气瓶内培养。壳孢子在维尼纶绳上萌发，约30d时长至lcm左右的小叶状体，将其从维尼纶绳上摘下继续充气培养，至40d时选取健康完整且未成熟的叶状体进行单棵培养，培养至叶状体稍部开始形成精子囊。所用培养液均为富含MES营养盐的消毒海水 (王素娟，张小平，徐志东，等.坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究.海洋与湖沼， 1986.17(3): 217-221 ?)，每5d更换一半的培养液。
[0040] 1.2条斑紫菜叶状体的杂交及果孢子的收集[〇〇411挑选健康的已形成精子囊的双亲叶状体(PY-LS和PY-HT)各1棵，置含有500ml消毒海水的充气瓶中混合培养，使二者杂交，培养温度19±1°C，光子通量密度40-50wii〇l nf2 ? s<，光周期10L:14D。条斑紫菜叶状体的雌性生殖细胞果胞的形成稍晚于精子囊的形成，且二者混合发育，故作为杂交亲本的条斑紫菜叶状体同时能够释放精子作为父本，同时也能接受精子作为母本，即自体受精和异体受精同时发生。同时，果胞常在成片精子囊的边缘形成，故自体受精的概率要远高于异体受精。[〇〇42]混合培养的过程中，每隔2天观察双亲叶状体上果孢子囊的形成，当发现有大量果孢子囊形成时，将双亲叶状体分开，分别用不同的充气瓶单独培养，直至各自叶状体上的果孢子囊发育成熟。将叶状体取出用吸水纸吸干表面水分，在室温下阴干叶状体约30min，再将叶状体置于含有50ml消毒海水的培养皿中，刺激果孢子囊放散出果孢子，2h后将叶状体放回充气瓶中培养。将培养皿置倒置显微镜下检查是否有果孢子放散，当发现有果孢子放散时，用吸管吹打使放散的果孢子在培养皿内均匀分布，并静置培养。每天重复一次，直至收集到足够数量的果孢子。
[0043] 1.3条斑紫菜果孢子和丝状体的培养
[0044]在果孢子的培养过程中，每天镜检其萌发情况，当观察到果孢子形成萌发管且萌发管的长度达到果孢子直径的3-5倍时，用自制的玻璃毛细管(管径30-50M1)将单个萌发的果孢子吸出并在含有15ml消毒海水的玻璃试管(15 X 200mm)中单独培养，使其萌发成一个单克隆的丝状体藻落。为了确保每次只吸出一个萌发的果孢子，可将吸出的液体吹到载玻片上，在显微镜下检查。同时为了防止交叉污染，每吸一次应更换新的玻璃毛细管，确保每个试管中长成的丝状体藻落是单克隆的。将含有萌发果孢子的试管放在试管架上静置培养，培养条件同1.2,期间不更换培养液。培养30d左右仔细观察可见果孢子在萌发形成的分枝丝状体，继续培养至50d时会形成一个直径3-5mm的藻落。丝状体藻落在试管中的生长有三种类型，包括贴壁、沉底(图2)或漂浮在液面上。
[0045]1.4条斑紫菜杂合丝状体的分离与鉴定
[0046]自体受精后放散的果孢子和异体受精后放散的杂合果孢子在形态和大小方面均无法用肉眼区分，故用玻璃毛细管吸取单个果孢子的时候只能随机取样。两种果孢子萌发成的丝状体在颜色上会出现区别。如果杂交亲本为野生色的PY-LS和红色的PY-HT，因为野生色相对于红色是显性，那么从PY-HT叶状体上放散的杂合果孢子会萌发成野生色的杂合丝状体(颜色同PY-LS的丝状体)，而纯合果孢子会萌发成红色的纯合丝状体(颜色同PY-HT 的丝状体)；如果从PY-LS叶状体上收集的果孢子，无论是杂合的还是纯合的，均萌发成野生色的丝状体藻落。[〇〇47]为了进一步验证，需将待验证的杂合丝状体藻落从试管中取出，用镊子轻轻将藻落撕碎，并转移到含有50ml培养液的三角烧瓶中扩大培养，培养条件同1.2，约30d左右取少量丝状体，按照1.1的方法获得待验证杂合丝状体的壳孢子。不同之处在于，仅放一根长约 lcm的维尼纶绳，其目的是为了检测是否放散壳孢子。当壳孢子开始放散时，每天早上11: 00-11:30分将培养液用200目的筛絹过滤，壳孢子会通过筛絹上的微孔，而丝状体则被阻挡在筛絹上。将过滤收集到的壳孢子在直径90mm的培养皿中静置培养，使壳孢子基部附着在皿底生长。筛絹上的丝状体则被放回至充气瓶中，继续刺激其放散壳孢子。[0〇48]壳孢子在培养皿中静置培养，培养条件同1.2,期间每周更换一半培养液。培养30d 左右肉眼可见壳孢子萌发的叶状体，长度约5mm。挑出叶状体置于载玻片上用显微镜检查， 记录嵌合体的类型及数量。如果发现90%以上的叶状体为含有双亲颜色的嵌合叶状体(图 3)，则说明该丝状体为杂合丝状体，可用于双单倍体群体的构建。
[0049]1.5条斑紫菜双单倍体群体的构建
[0050]挑选含有4个色块的？:嵌合叶状体，每棵嵌合叶状体用单独的一个充气瓶培养，条件同1.2。当嵌合叶状体上的某一色块长至约lcm长时，将其切下单独培养，同时放入一股 3cm长的维尼纶绳供单孢子附着。如果该色块不放散单孢子，则将其叶状体用海螺酶液处理获得单离体细胞(严兴洪，刘新轶，张善霹.条斑紫菜叶状体细胞的发育与分化.水产学报， 2004(02): 145-154.)。将上述单孢子或单离体细胞在其萌发至lcm左右时，再次单棵培养， 最终通过自体受精获得每棵嵌合叶状体上每个色块的纯合丝状体(品系)，方法同1.3，从而构建成双单倍体群体(图4)。
[0051]选择4色块嵌合叶状体作为构建双单倍体群体的原因:条斑紫菜的丝状体是二倍的孢子体，放散的壳孢子也是二倍体，壳孢子最初的两次分裂是减数分裂，形成四个减数分裂子细胞不分离的四分子体，条斑紫菜叶状体则是由四个单倍体细胞继续分裂形成的嵌合叶状体，但是在实际的发育过程中，四个细胞不一定都能够正常发育形成4色块的嵌合体， 故组成F1嵌合叶状体的色块数量从1-4不等。只有选择4色块的嵌合体，才能将减数分裂产生的不同基因型全部包含在双单倍体群体中，选择少于4个色块的嵌合体会导致某些不能正常发育的基因型的消失，从而破坏双单倍体群体的遗传结构，有可能造成严重的偏分离现象，影响遗传作图的准确性。在坛紫菜遗传连锁图谱的构建过程中，偏分离的分子标记高达29.3 %，其原因可能是没有选择4色块嵌合体作为构建群体的材料(从50个F1嵌合叶状体上分离到166 个色块)(Xie，C.，C.Chen，Y.Xu,等.Construct1n of a genetic linkage map for Porphyra haitanensis(Bangiales,Rhodophyta)based on sequence-relatedamplified polymorphism and simple sequence repeat markers.Journal of Phycology，2010 ? 46(4): 780-787 ?)，平均每个嵌合体有3 ? 3个色块。
[0052]双单倍体群体各品系的命名原则:嵌合体编号+色块编号+色块颜色，嵌合体编号为1-50或以上，表示含有4个色块的F1嵌合体的编号;色块编号按照嵌合叶状体上4个色块从基部到稍部的线性排列顺序，编号1-4,色块1位于嵌合叶状体的基部，色块4位于嵌合叶状体的稍部;色块颜色用字母表示，W为与PY-LS—样的野生色，R为与PY-HT—样的红色，W’ 和R’分别为重组后形成的重组色。如果某个品系的编号为36-3R，则表示该品系来自挑选的第36棵4色块嵌合叶状体，该色块在嵌合体上的位置位于从下往上数的第3块，R代表该色块的颜色为红色(图5)。
【主权项】
1.一种雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:51、选取叶状体颜色差异明显的雌雄同体紫菜叶状体作为杂交亲本；52、选取已形成精子囊的双亲叶状体混合培养，至双亲叶状体上开始有果孢子囊的形 成时，将双亲叶状体分开单独培养，直至各自叶状体上的果孢子囊发育成熟，分别收集果孢 子；53、当果孢子形成萌发管时，取单个萌发的果孢子单独培养，使其萌发成一个单克隆的 丝状体藻落；54、培养所述单克隆的丝状体藻落经诱导后放散的壳孢子，至肉眼可见的？:叶状体，显 微镜下观察Fi叶状体的颜色及色块数量，如90%以上的Fi叶状体为含有双亲颜色的嵌合叶 状体且色块数为2块、3块或4块，则该单克隆的丝状体藻落是由双亲杂交而成的杂合丝状 体，其^代中有四个色块的嵌合叶状体可用于构建双单倍体群体；55、从含有四个色块的嵌合叶状体上分离单个色块，取该色块经诱导后放散的单孢子 或单离体细胞，培养至肉眼可见的叶状体，取单棵培养，最终通过该单棵叶状体自体受精获 得每棵四色块嵌合叶状体上每个色块的纯系丝状体，从而组建成双单倍体群体。2.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，步骤S2 中，已形成精子囊的双亲叶状体是通过如下步骤获得的:取亲本丝状体的藻段置于温度25 ±1°C、光子通量密度20-30wii〇l m—2 ? s—S光周期10L:14D的条件下静置培养，培养液为添 加2 %MES营养液的消毒海水，培养至50 %以上的营养藻丝发育成熟，形成壳孢子囊枝;取出 一半含有壳孢子囊枝的藻丝在温度19±1°C，光子通量密度40-50wii〇lm—2 ? s—I光周期10L: 14D的条件下培养，培养液为添加2 %MES营养液的消毒海水，至成熟壳孢子囊枝释放壳孢子 到培养液中；将含有壳孢子的培养液继续培养至该壳孢子萌发的小叶状体长大，且至叶状 体稍部开始形成精子囊，即可。3.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，步骤S2 中，所述混合培养的培养温度19±1°C，光子通量密度40-50mi〇1 m—2 ? s—S光周期10L:14D， 培养液为添加2 % MES营养液的消毒海水。4.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，步骤S2 中，叶状体上的果孢子囊发育成熟后，将叶状体取出在室温下阴干，再将叶状体置于消毒海 水中1.5?2.5h，刺激果孢子囊放散出果孢子;每天重复一次，直至收集到足够数量的果孢 子。5.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，步骤S3 中，当果孢子形成萌发管且萌发管的长度达到果孢子直径的3-5倍时，取单个萌发的果孢子 单独培养。6.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，步骤S4 中，单克隆的丝状体藻落经诱导后放散壳孢子包括如下步骤:取单克隆的丝状体藻落的藻 段进行扩大培养，25?35d后取少量丝状体，取该丝状体的藻段置于温度25 ± 1°C、光子通量 密度20-30圓〇1 nf2 ? jT1，光周期10L:14D的条件下静置培养，培养至50%以上的营养藻丝 发育成熟，形成壳孢子囊枝;取出一半含有壳孢子囊枝的藻丝在温度19±1°C，光子通量密 度40-50wi1l nf2 ? s'光周期10L:14D的条件下培养，至成熟壳孢子囊枝释放壳孢子到培 养液中，过滤除杂后既得壳孢子。7.如权利要求6所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，所述扩大 培养的过程为取丝状体藻落，在消毒的塑料垫板上用消毒的单面刀片切碎，切碎后的藻段 长度以l-2mm为宜，将所有藻段转移到含有100ml培养液的三角烧瓶中扩大培养，条件为温 度19±1°C、光子通量密度40-50wnol m—2 ? s—S光周期10L:14D，静置培养。8.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，步骤S5 中，挑选含有四个色块的嵌合叶状体单独培养，当某一色块长至0.8?1.2cm长时，将其切下 单独培养并诱导其放散单孢子，如该色块经诱导仍无单孢子放散，则将该色块用海螺酶液 处理获得单离体细胞。9.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，步骤S5 中，所述单孢子或单离体细胞在萌发至0.8?1.2cm时，进行单棵培养。10.如权利要求1所述的雌雄同体紫菜双单倍体群体组建的方法，其特征在于，所述雌 雄同体紫菜为条斑紫菜。
【文档编号】A01H1/02GK106069717SQ201610429722
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】黄林彬, 严兴洪
【申请人】上海海洋大学