一种端粒酶活性检测方法

专利名称：：一种端粒酶活性检测方法
技术领域：
：本发明属生物工程技术和分子检测
技术领域：
，是一种端粒酶(Telomerase)活性检测方法。端粒酶是一种核糖核酸蛋白，具有逆转录酶的活性，可以用自身的RNA组分作为模板，合成端粒重复DNA序列。永生细胞和复制活跃的细胞，以及绝大多数的恶性肿瘤具有端粒酶活性，而正常的体细胞和组织没有该活性。端粒酶活性的检测对于研究细胞衰老、癌变，及肿瘤病理和诊治，有很重要的意义。大量的研究发现，端粒酶活性检测，可以作为癌症的早期检测和预后手段，并可作为对病人监测的一种标记。许多从细胞或组织病理学观察属于癌前的病灶，可检测到端粒酶活性，这表明这些看似良性的病灶，可能已经包含少量的恶变细胞。对于前列腺组织，当前的标记不能区分良性增生与前列腺癌，而端粒酶活性明显能够区分。因为缺乏有效的细胞学标记，大约50％的早期膀胱癌病例错过早期确诊，而采用损害少的活体检查技术在大多数(约90％)的膀胱癌能够检出端粒酶活性。这些发现说明，结合常规的细胞学方法，端粒酶活性的检测可能是一种重要的早期癌症诊断方法。另外一些研究提出端粒酶活性的检出，预示临床治疗效果不佳手术上认为是正常组织的癌旁组织，可检出端粒酶的比率超过10％。这因为原发性肿瘤能侵入周围的正常组织，虽然由于其中只有很少量的癌细胞而在病理上没有表现。在一些可供检测的标记很少的肿瘤，比如脑膜瘤(meningiomas)，端粒酶活性可能给临床提供其病程进展的一种客观参照，而在胃癌、结肠癌、膀胱癌、神经母细胞瘤和甲状腺癌，都发现端粒酶可能分辨癌症的不同阶段。另外，取样的容易与否是临床诊断应用必须考虑的。端粒酶活性可以从非常少的样品中检出增加了其作为标记的实用性。细胞学取样的常用方法适用于端粒酶检测。比如病人组织穿刺活检、来源于口腔清洗液、尿液、肺或肠灌洗液等的脱落细胞。通过检测其端粒酶活性，可以监测和判断癌变进程。(KimNW,etal.Science,1994,266:2011～2015;HiyamaE,etal.CancerRes,1995,55:3258～3262;ShayJW,WrightWE.CurrOpinOncol,1996,8:66～71;YoshidaK,etal.Cancer,1997,79:362～369;UmbrichtCB,etal.CancerRes,1997,57:2144～2147;LangfordLA,etal.HumPathol,1997,28:416～420;JongHS,etal.Cancer,1999,86:559～565)。检测细胞内端粒酶活性需要有灵敏准确的测定方法。1994年，Kim等发明了TRAP法(Telomericrepeatamplificationprotocol，端粒重复扩增方法)，利用端粒酶活性，在可用作端粒酶引物的非端粒重复序列寡核苷酸(以下简称端粒酶引物)的3’端，连续合成端粒重复序列单元(TelomericRepeats)，得到端粒酶引物延长，然后以端粒酶引物延长链作模板，再用TP和另一个端粒重复序列的互补引物(CX)进行PCR扩增，扩增产物为长度大致相差6bp的短片段系列，PAGE电泳结果形成梯状图谱(KimNW,etaLScience,1994,266:2011～2015)。TRAP大大提高了端粒酶活性检测灵敏度，迅速开拓了端粒酶研究和应用的局面。随之，一系列的TRAP改进研究相继报道。主要有(1)TRAP引物改进，以减少非特异扩增出现的机会；(2)结果检测改用非放射性方法，并进行定量。如结果检测采用电泳染色，使用SYBR绿、EB、银染或荧光；或者杂交显色如Roche公司的端粒酶PCR～ELISA法。在定量方面，建立了以内标准对照模板共扩增为基础的半定量方法；(3)简化和优化操作。包括使用AmpliGOLDTaq酶免蜡封；使用4.5％MetaPhor琼脂糖凝胶电泳取代PAGE电泳分离等(WrightWE,etal.NucleicAcidsRes,l995,23:3794～3795;KruppG,etal.NucleicAcidsRes,1997,25:919～921;FongD,etal.Biotechniques,1997,23:1029～1032;KimNW,WuF.NucleicAcidsRes,1997,25:2595～2597;FalchettiML,etal.NucleicAcidsRes,1998,26:862～863;HiroseM,etal.ClinChem,1998,44:2446～2452;GelminiS,etal.ClinChem,1998,44:2133～2138;LorynN,etal.Biotechniques,1998,24:726～727)。国际上Oncor公司和Roche公司等已经分别推出了基于TRAP的商品化试剂盒。但TRAP存在固有的缺陷(1)由于新合成的端粒重复序列单元数没有限定，端粒酶引物延长的长度不一致，而且下游引物在端粒酶引物延长链上的结合位置也不一致，导致扩增片断长度不一致，扩增效率不高，因而降低了灵敏度，不利于定量统计分析；(2)由于产物片断长度短且不一致，很难根据条带位置分辨特异扩增产物与扩增赝物，而且引物聚合体及非特异扩增等PCR扩增赝物，PAGE电泳结果往往也形成梯状图谱，这都给结果的判断分析造成了困难。本发明的目的在于提供一种能使扩增产物片段长度单一特定，因而检测灵敏度高，且便于定量统计分析的端粒酶活性检测方法。本发明提出的端粒酶活性检测方法，其步骤为在一定的反应体系和反应条件下，利用端粒酶活性，限定端粒酶引物延长，以端粒酶引物延长链作引导中间复制的引物，对一预定的、不能被端粒酶引物扩增的DNA片段(简记为TESL)。进行复制，把端粒酶引物的完整序烈引入到这一TESL子链的5’端，然后以端粒酶引物作为扩增引物，以TESL子链作扩增模板，进行PCR扩增，得到为一条较长的、能反映端粒酶活性水平的特异DNA片段，从而能方便地、准确地分析端粒酶活性。本发明是一种端粒酶引物延长介导的单一片段扩增方法，英文名称为Single-fragmentamplificationmediatedbytelomeraseprimerelongation，简写为SAPE。本发明中所述的TESL，其5’端的核苷酸组成依次为端粒酶引物除去的3’末端的2个核苷酸外的全部序列的核苷酸+2个独有核苷酸+3个端粒重复序列单元。由于PCR要求引物的3’末端必须与模板序列完全匹配，因此，TESL不能被端粒酶引物扩增；TESL可以通过以SLP5’-AATCCGTCGATAAGATCCGGTTAGGGTTAGGGTTAGTACT-3’为单引物，以质粒pUC118DNA(购自上海生工生物工程公司)为模板，进行PCR扩增，切胶回收而制备。下面对上述步骤进一步说明如下1．在适宜条件下，端粒酶活性介导的端粒酶引物延长是限定长度的，绝大多数只延长1～3个端粒重复序列单元，得到的端粒酶引物延长链可描述为端粒酶引物+(TR)1～3。2．端粒酶引物延长链的3’末端是端粒重复序列单元，与TESL5’端的对应序列完全匹配，原先不匹配的序列移至中间，由于3’末端以外的个别不匹配序列不影响PCR扩增，因此能够作为引物，引导以TESL为模板的扩增(复制)反应，得到的TESL子链的5’端已是完整的端粒酶引物全序列。3．因为在TESL子链的5’端，原来用来阻碍端粒酶引物的2个独有核苷酸已被端粒酶引物3’末端序列取代，所以能以TESL子链为模板，以端粒酶引物作引物，进行PCR扩增。扩增产物反映端粒酶活性，其长度是特定一致的(等于TESL)。以上反应步骤可在一个反应体系中，置于热循环仪上连续进行反应体系Tris-HCl:pH8.2～9.1,20～50mmol/L;KCl:50～80mmol/L;MgCl2:1.0～2.0mmol/L;Tween20:0.01％～0.1％;EGTA:0.5～2.0mmol/L;BSA:0.05～0.2mg/ml;DTT:0.5～2.0mmol/L;dNTP:0.05～0.2mmol/L;RNasin0.01～0.05U/μl;TESL:0.01～0.05μg/μl;端粒酶引物:3.0～8.0μmol/L:Taq酶:0.05～0.1U/μL；细胞或组织裂解液总蛋白浓度1.0～6.0μg/μl。反应程序(以MJ-PTC200热循环仪为例，下同)在35℃～37℃下，保温10s～4min后，进行下面的循环反应先在92℃～95℃温度条件下，保温10s～2min，然后在55℃～60℃，保温10s～2min，再在68℃～74℃下，保温30s～2min，如此反复进行28～35个循环；最后在68℃～74℃保温2～7min。本发明的优点本发明的方法与TRAP的根本不同在于TRAP以长度不等的端粒酶引物延长链为模板进行长度不一的扩增，而本发明的SAPE方法是利用限定长度的端粒酶引物延长链作中间复制引物，从而能够以端粒酶引物为引物，以特定长片段为模板进行特异扩增。因为特异扩增的效率高，提高了灵敏度，而且产物片断在电泳图谱上的位置可确定，便于判断分析。另一个重要区别在于SAPE只需很短的端粒酶引物延长链(1～3个端粒重复序列单元)，而TRAP需要较长的端粒酶引物延长链(一般需要几十个以上的端粒重复序列单元，5单元以下的端粒酶引物延长链作为模板的扩增产物，完全无法与引物聚合体区分)，较短的端粒酶引物延长比较容易得到，而较长的端粒酶引物延长则需要严格的反应条件及操作要求。通过与TRAP法比较可以看出，本发明方法具有耗时少、操作简便、可重复性好、结果易于分析判断、实现定量容易等优点(详见表1)。表1SAPE(本发明)与TRAP的对比<tablesid="table1"num="001"><table>项目TRAPSAPE反应方式借助蜡模或高温启动的Taq酶，能实现一管一步法无须特殊设置或试剂，即可实现一管一步法端粒酶引物延长一般需10个单元以上，延长15～30min(25℃～30℃)只需1～3个单元，延长10s～4min(35℃～37℃)可重复性要求的端粒酶引物延长长度长，延长反应时间长，反应条件和操作要求严格，可重复性较差端粒酶引物延长长度很短，反应时间短，反应条件和操作要求不很严格，可重复性较好全部操作所需时间从反应到PAGE电泳出结果，至少4～5小时从反应到琼脂糖电泳出结果，只需2～3小时最终产物很多短片段，长度不一单一较长片段，长度特定扩增效率和特异性较低(低于特异PCR)易产生引物聚合体和非特异扩增，且因下游引物序列必须与(TTAGGG)。互补，优化余地很小较高(与特异PCR相当)特异性好，不易产生引物聚合体和非特异扩增。单引物优化余地大。</table></tables><tablesid="table2"num="002"><table>结果检测PAGE，梯状电泳图谱放射自显影或银染操作繁琐，费时长琼脂糖电泳，特异带EB染色操作简便，省时PCR循环数一般不能超过30个(否则扩增赝物出现的几率大大增加)因为特异性好，PCR循环数可以到35个可靠性因为PCR扩增赝物也会形成类似的PAGE-梯状电泳图谱，所以结果分析容易被干扰特异带的在电泳图上的位置可确定，因此结果分析不易被PCR扩增赝物干扰定量能，但条带多，统计难能，统计容易</table></tables>实施例1K562细胞的端粒酶活性检测端粒酶引物MAG(5’-AATCCGTCGAGCAGATAG-3’)；TESL:375bpDNA片段，以单引物SLP，以质粒pUC118DNA为模板，进行PCR扩增，切胶回收得到；细胞培养、裂解及总蛋白量测定按常规方法进行。SAPE的反应体系和程序如下反应体系Tris-HClpH8.220mmol/L,KCl:63mmol/L,MgCl2:2mmol/L,Tween20:0.05％,EGTA:1mmol/L,BSA:0.1mg/ml,DTT:1mmol/L,dNTP:0.1mmol/L,RNasin0.01U/μl,TESL:0.01μg/μl,MAG:4.0μmol/L,Taq酶:0.05U/μl，细胞裂解液总蛋白量0.1μg/μl；反应程序先在37℃保温20s，然后进行32个循环94℃20s，55℃20s，72℃40s，最后，72℃保温5min。反应结束后，于1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)电泳，100V30min，紫外检测仪上观察分析，能见到375bp特异带，同时进行的阴性对照，不能见到375bp特异带(参见附图1)。实施例2肺癌样品端粒酶活性的检测端粒酶引物、TESL同前。手术分离的肺癌组织及癌旁组织，剪碎，称重。以PBS和Hepes洗涤缓冲液分别洗涤一遍，按300μl/100mg加入CHAPS裂解缓冲液，于冰上捣匀，放置40min，每个样品稀释到总蛋白浓度约为3μg/μl。然后，按K562的方法进行。然后分别进行TRAP和SAPE检测。从电泳结果可以看到，5例肺癌组织样品均有明亮的特定片段扩增带出现，表明检测到较强的端粒酶活性，3例癌旁组织只有1例有弱的特定片段扩增带，表明检测到较弱的端粒酶活性，另外2例无产物，表明没有检测到端粒酶活性(参见附图2)。实施例3SAPE-竞争PCR定量采用竞争PCR定量系统对以2倍梯度稀释的k562细胞裂解液(10000个/2μl～157个/2μl)，在实施例1的反应体系中，增加1ng/μl的竞争对照模板(457bp，制备方法略)，利用相同的程序进行反应。反应结束后，于1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mlEB)电泳，100V30min，电泳结果用FR980生物电泳图象分析系统观察分析(参见附图3)，扫描记录并计算375bp与457bp带的光密度比值，取对数，采用MicrocalQrigin5.0系统分析作图，拟合标准曲线(参见附图4)。据此，可得到下列方程X=3.39Y+3.72其中，X为端粒酶活性的相对值(以157个K562细胞的端粒酶活性=1)；Y为SAPE特异扩增量与对照扩增量比值的对数，可根据电泳扫描结果计算得出。附图1为SAPE对K562细胞端粒酶活性检测的电泳结果。M:DNALadder，购自MBI公司，片段大小(bp)分别为1031,900,800,700,600,500,400,300,200,100,80；0阴性对照电泳结果无条带；1阳性对照TESL375bp带；2以端粒酶引物MAG为引物，以TESL为模板，体系中加入用Rnase预处理后的K562细胞裂解液，进行的SAPE，电泳结果为阴性；3以端粒酶引物MAG为引物，以TESL为模板，体系中加入用65℃保温预处理后的K562细胞裂解液，进行的SAPE，电泳结果为阴性；4以端粒酶引物MAG为引物，人DNA为模板，进行的SAPE，电泳结果为阴性；5以端粒酶引物MAG为引物，以质粒pUC118DNA为模板，进行的SAPE，电泳结果为阴性；6以端粒酶引物MAG为引物，以TESL为模板，体系中加入K562细胞裂解液，进行的SAPE，电泳结果为阳性。附图2为SAPE对肺癌样品的端粒酶活性检测的电泳结果。M:DNALadder；1阳性对照；2-4癌旁组织样品，2为弱阳性，3,4为阴性；5-9肺癌组织样品，全为阳性。附图3为SAPE-竞争PCR定量电泳结果，457bp带为竞争对照带。MDNALadder；0阴性对照；1-7K562细胞裂解液2倍梯度，1相当于157个细胞，7相当于10000个细胞。附图4SAPE-竞争PCR定量标准曲线，R为拟合度，157个K562细胞端粒酶活性相对值为1。权利要求1．一种端粒酶活性检测方法，其特征在于在一定的反应体系和反应条件下，利用端粒酶活性，限定端粒酶引物延长，以端粒酶引物延长链作引导中间复制的引物，对一预定的、不能被端粒酶引物扩增的DNA片段-TESL进行复制，把端粒酶引物的完整序列引入到TESL子链的5’端，然后以端粒酶引物作为扩增引物，以TESL子链作扩增模板，进行PCR扩增，得到为一条较长的、能反映端粒酶活性水平的特异DNA片段，从而能方便地、准确地分析端粒酶活性。2．根据权利要求1所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于所述的TESLTESL的5’端的核苷酸组成依次为端粒酶引物除去的3’末端的2个核苷酸外的全部序列的核苷酸+2个独有核苷酸+3个端粒重复序列单元；TESL可以通过以SLP5’-AATCCGTCGATAAGATCCGGTTAGGGTTAGGGTTAGTACT-3’为单引物，以质粒pUC118DNA为模板，进行PCR扩增，切胶回收而获得。3．根据权利要求1所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于反应体系为Tris-HCl:pH8.2～9.1,20～50mmol/L;KCl:50～80mmol/L;MgCl2:1.0～2.0mmol/L;Tween20:0.01％～0.1％;EGTA:0.5～2.0mmol/L;BSA:0.05～0.2mg/ml;DTT:0.5～2.0mmol/L;dNTP:0.05～0.2mmol/L;RNasin0.01～0.05U/μl;TESL:0.01～0.05μg/μl；端粒酶引物3.0～8.0μmol/L;Taq酶:0.05～0.1U/μL;细胞或组织裂解液总蛋白浓度1.0～6.0μg/μl。4．根据权利要求1所述的端粒酶活性检测方法，其特征在于反应程序为在35℃～37℃下，保温10s～4min后；进行下面的循环反应先在92℃～95℃温度条件下，保温10s～2min，然后在55℃～60℃，保温10s～2min，再在68℃～74℃下，保温30s～2min，如此反复进行28～35个循环；最后在68℃～74℃保温2～7min。全文摘要本发明是一种端粒酶活性检测方法。主要步骤是:利用端粒酶活性限定端粒酶引物延长,以端粒酶引物延长链为引物,引导一不能被端粒酶引物扩增的DNA的扩增,把端粒酶引物的完整序列引入到该DNA子链的文档编号C12Q1/25GK1298951SQ0012758公开日2001年6月13日申请日期2000年11月28日优先权日2000年11月28日发明者陈燃,毛裕民申请人:复旦大学