专利名称：用于生产口蹄疫疫苗的油菜叶绿体转基因植物的获得方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生产口蹄疫多肽疫苗的油菜叶绿体转基因植物的获得方法。具体的说，该方法包括构建用于定点转化的油菜叶绿体相关DNA序列；合成口蹄疫多肽疫苗基因序列；将该序列与报告基因或具有强免疫源性蛋白的基因串联，使之成为融合疫苗基因；用此序列构建含口蹄疫多肽疫苗基因的油菜叶绿体定点转化载体；用该转化载体转化油菜，获得表达口蹄疫多肽疫苗的油菜叶绿体转基因植物。
由于叶绿体可超量表达外源蛋白，因此，植物的叶绿体有可能成为工业用酶或药用蛋白的“生物反应器”，现有工作表达通过叶绿体表达外源基因，其表达量通常是核表达的100以上，现有工作中最高表达量已达总可溶蛋白的46％，这充分表明利用叶绿体转化技术生产蛋白质药物或疫苗的可行性。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、烈性传染病，以直接接触方式传染，其危害对象是猪、牛、羊等家畜和几十种其它偶蹄类动物，其传染速度极快且易引发大流行，对畜牧业的危害极大，已被国际动物卫生法典列为18种A类疫病之首。由于口蹄疫一旦发生将直接影响一个国家或地区的畜产品的出口贸易和国际声誉，为此一些国家甚至采取将病畜销毁等强制性措施来阻止和防止疫情的扩大。预防口蹄疫是仍是防治口蹄疫的最有效方法，常用方法是注射口蹄疫疫苗。由于口蹄疫有较多的血清免疫类型，各型间的疫苗不能提供交叉保护，所以在预防口蹄疫发生时，多用与当地流行的病毒型相同的口蹄疫疫苗。如何能提供足够数量有效的疫苗，并能有效地进行免疫，是预防口蹄疫的关键。
常用的口蹄疫疫苗是利用BHK(鼠肾细胞系)传代细胞系方法来生产灭活疫苗，这类疫苗免疫效果好，但生产涉及动物细胞培养技术，不但生产投入大、成本高，且动物细胞培养易污染，所以只能在少数设备完备的实验室或生物产品工厂才有能力生产，另外在这种疫苗生产中要大量繁殖病毒，而该病毒又能通过空气传播，所以一旦失控将造成严重后果。为此需要大力开发安全性好的其它类型疫苗。现在研究较多的是合成肽疫苗、基因工程疫苗等。
合成肽是人工合成的具有保护作用的类似于天然抗原决定的小肽，由这种小肽制成的疫苗安全性好，然而合成的费用仍较高；基因工程疫苗则以病毒颗粒中的具有免疫源性亚单位蛋白或多肽的DNA序列作为目的基因，通过原核表达系统表达疫苗组份。由于这种方法生产疫苗不涉及病毒本身，所以的安全性好，不过它同合成肽疫苗一样仍有成本高的缺点，其原因是亚单位蛋白或多肽的免疫源性比普通灭活苗低，故需要大量注射从而增加了应用成本。
为降低基因工程疫苗的使用成本，利用植物作为生物反应器表达和生产疫苗是一个较好的选择，这方法的生产条件要求远比动物细胞培养低，只要有土地就能大规模生产；由于植物的内热源物质少，所以从植物中提取疫苗的纯化成本也很低，值得注意的是第一个利用转基因植物表达的病毒疫苗并使免疫动物全部获得保护的，正是口蹄疫方面的工作。另外，目前正在探索食用疫苗的应用，若这一设想能在口蹄疫疫苗上得以实现不但可能进一步降低疫苗成本，也利于运输和应用，对边远地区的口蹄疫防治工作极为有利。
本发明还涉及一种向油菜叶绿体定点转化外源DNA的方法，包括以下步骤(1)构建用于向油菜叶绿体定点转化外源基因的油菜叶绿体相关DNA片段；(2)将步骤(1)构建出的DNA片段与外源基因重组，使外源基因序列位于油菜叶绿体相关DNA序列的中间；(3)将步骤(2)重组得到的DNA片段插入到克隆载体的多克隆位点上，作为外源基因油菜叶绿体定点转化载体；和(4)用步骤(3)得到的转化载体转化油菜，使外源基因在油菜叶绿体中表达。
具体地讲，本发明所述的涉及一种用于向油菜叶绿体中定点转化外源DNA的序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列或其不小于1kb的片段，以及SEQ ID NO2所示的序列或其不小于1kb的片段。叶绿体定点转化载体上应含有上述两个定位片段的序列，从而实现油菜叶绿体定点转化。定位片段是用基因克隆技术从油菜叶绿体基因组中克隆出来的两段相邻的DNA片段(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)，将其构建在载体中使外源基因序列，即口蹄疫多肽疫苗基因序列位于两个片段的中间，当载体导入叶绿体时，这两DNA片段能以同源重组形式将片段间的序列整合到叶绿体基因组的序列上。在本发明中提供的适合整合位点是油菜叶绿体基因组中的rps7基因和ndhB基因之间的间隔区，即SEQ ID NO1的3’端到SEQ ID NO2的5’端区域。第一片段有1037个核甘酸，包含3’rps12基因、rps7基因及其边界序列；第二个片段共有2467个核甘酸，包含部分ndhB基因及基因间隔区。以此为定位片段构建的油菜叶绿体定点转化载体，将口蹄疫多肽疫苗与绿色荧光蛋白基因的融合基因点插入到油菜叶绿体基因组的rps7基因和ndhB基因之间的间隔区，即油菜叶绿体基因组中第一片段的3’端至第二片段的5’端之间。这两个片段的获得可利用已知烟草叶绿体DNA序列设计引物，用PCR的方法从油菜叶绿体基因组中分离相应的DNA片段。也可以从根据本发明提供的SEQID NO1和SEQ ID NO2序列设计引物进行扩增。rps7基因和ndhB基因之间的间隔区可以保证这一转化过程不引起原有叶绿体基因组重要序列的丢失，或干扰临近基因的正常功能，整合位点是在叶绿体基因组的非功能区或功能不重要区内。所谓基因组的非功能区是指植物基因组中不具编码蛋白质、调控基因复制、转录、翻译等一切生化反应功能的核苷酸序列，如基因之间的间隔区、假基因序列区、转录间隔区等。而功能不重要区是指植物基因组中的核苷酸序列，它所表达的产物在植物的正常生长发育和生理代谢中不起重要的作用，缺失后不影响植物的正常发育与代谢活动。
此外，本发明所述的还涉及编码口蹄疫多肽疫苗基因含有SEQ IDNO3及SEQ ID NO4所示序列，其获得是将口蹄疫病毒蛋白中有免疫源性部分的序列从新设计，使其适合于原核表达，然后进行人工合成。发明中所提供的口蹄疫免疫源性的氨基酸序列，来自国内O型58和86株系病毒口蹄疫VP1蛋白上第140-160和200-213氨基酸序列，这两段序列是公认具有免疫源性的病毒组份，是经过比较优选出来的。同时，其DNA序列是参考大肠杆菌偏爱的密码子重新设计并合成的。大肠杆菌密码子使用偏爱情况的数据可以从因特网相关网站上获得。
本发明中还提供了一种口蹄疫多肽序列的拼接方式，即发明中DNA片段上编码多肽序列的拼接有两种方式，一为O58株系的第140-160氨基酸接上O58株系第200-213氨基酸，再串联上O86株系的第140-160氨基酸和第200-213氨基酸的肽链；另一为O86株系的第140-160氨基酸接上第200-213氨基酸，再串联上O58株系的第140-160氨基酸接和第200-213氨基酸的肽链。
由于上述所述的多肽DNA序列编码蛋白分子量小，不利于积累，所以本发明中还将上述多肽的DNA序列再与其它分子量较大的蛋白串联，本发明中采用与绿色荧光蛋白基因的DNA序列串联，从而构建为具免疫源性的多肽-绿色荧光蛋白的融合蛋白形式的疫苗基因。虽然如此，本发明中与口蹄疫疫苗基因串联的基因也不限于绿色荧光蛋白基因，还可以使用其它形式串联的基因，如口蹄疫病毒VP1蛋白基因序列或其它有同样功能的多肽片段，特别是一些有强免疫源性的蛋白基因，如乙肝核心蛋白基因等。
本发明所述的油菜叶绿体转化载体是在普通克隆载体基础上构建的，其中所述的普通克隆载体可以是现有技术中已知的任何一种克隆载体，例如SK质粒，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119等由于在于本发明中，油菜叶绿体转化载体上的口蹄疫疫苗基因将在叶绿体中表达，所以在基因的上游连接有叶绿体表达启动子，它具有在叶绿体基因组中的启动功能，使构成口蹄疫疫苗基因的叶绿体表达框。在本发明所使用的启动子为来自烟草的核糖体RNA基因rrn的启动子，终止子为烟草psbA基因的终止子。虽然如此，其它具有相同作用的叶绿体启动子和终止子也适用于本发明中，特别是来自十字花科植物的相应叶绿体基因启动子和终止子。上述疫苗基因的叶绿体表达框与一个同样由叶绿体启动子启动表达的筛选标记基因叶绿体表达框一起作为本发明中油菜叶绿体的定点转化载体上的外源基因。在载体构建方面，要考虑有筛选标记基因以便于转化个体的筛选。本发明所使用的是抗生素标记基因，即壮观霉素基因。但也可应用其它可用于植物叶绿体转化选择的标记基因，特别是甜菜碱醛脱氢酶基因，即BADH，这时在培养基上加入甜菜碱醛以筛选转化体。
油菜叶绿体表达多肽疫苗的转基因植物的获得是本发明的最终产品。应用油菜叶绿体转化载体将多肽疫苗基因导入油菜或其它十字花科植物叶绿体，建立高效表达多肽疫苗的体系，需要进行一系列的工作，包括转化方法建立、获得同质化转化体，用GFP基因产物在长波紫外光下激发绿色荧光来检测和分析疫苗基因的表达等。在载体的导入方面，常用的基因枪法、微束激光穿刺法、原生质体融合法均适合于本发明所述的油菜叶绿体转化。在叶绿体转化个体的筛选方面，本发明使用了壮观霉素筛选标记基因，只要在培养基中加入适当浓度的壮观霉素便可得到转化个体。本发明所谓适当的抗生素浓度为8-15mg/L，若采用BADH基因作为转化载体上的筛选标记时，培养基中的甜菜碱醛浓度在5-10mg/L。
本发明提供的方法可以将口蹄疫疫苗基因导入油菜叶绿体基因组中，并将转化植株用于口蹄疫疫苗的生产，与目前使用的口蹄疫疫苗生产方法相比，它具有如下的优点整个生产过程通过种植转化油菜即可，不涉及到病毒的培养和繁殖，具有极高的安全性；表达效率高，可比植物的核基因转化的表达效率提高至少10倍，甚至高出100倍；使生产成本大大降低。因此，本发明为口蹄疫疫苗生产提供了全新的方法，对其预防有重要意义，同进对其它疫苗的生产方法的改良也具有普遍的参考意义。
实施例1.口蹄疫多肽疫苗融合基因制备1.序列设计口蹄疫多肽疫苗基因序列主要是采用国内病毒株系的序列，并根据将来基因表达的受体对密码子偏爱的情况进行了重新设计。
所采用的口蹄疫多肽疫苗基因序列从国际基因数据库(GeneBank)中获得，主要选取来自中国的O型病毒的O58和O86株系，利用目前公认具有疫苗作用的编码VP1蛋白第140-160氨基酸的20个氨基酸多肽(以下称20肽)和第200-213氨基酸的14个氨基酸多肽(以下称14肽)序列，作为多肽疫苗基因中起免疫源作用的多肽序列。
由于合成的多肽疫苗基因将主要用于原核及原核性的叶绿体中表达，所以在设计时尽可能采用原核性偏爱密码子代替原有的密码子。替换主要是参考大肠杆菌对密码子偏爱情况确定的为尽可能使用原核性密码子，在本工作在确定最终多肽疫苗基因序列时主要根据用作疫苗成分的病毒VP1蛋白上的氨基酸序列，直接采用大肠杆菌偏爱密码子。比如亮氨酸，就直接用大肠杆菌中利用率最高的CTG作为相应的核苷酸序列。
虽然设计好的多肽片段的核苷酸序列不是很长，但仍很难直接合成全长序列，故将其分段合成，上、下链分成几段合成，上链为4段，编码的分别为病毒O58株系VP1蛋上有免疫源性的的20肽、14肽和O86株系的20肽和14肽(说明见前文)，其核苷酸长度为60bp和42bp两种，上链5’端全部磷酸化；下链为了合成的方便，设计了多个链，其中不仅有与上链完全对应片段，而且还有与同株系或不同株系不同上链有互补关系的片段。另外还根据多肽疫苗基因的序列设计了引物，用以扩增合成好的片段，而且在引物上加上了限制性内切酶的识别序列。设计好的多肽基因及引物交由DNA合成公司合成。
其具体序列如表1所示表1.设计的寡核苷酸片段
2.片段拼接合成的寡核苷酸片段用双蒸水溶解，其中用于合成基因的均稀释到约800ng/μl，用作引物的合成片段溶解并稀释到80ng/nl。然后按图2所示方式进行拼接。
在图2中，片段A和B分别代表O58株系的20肽和14肽的上链，C和D分别代表O86的20肽和14肽的上链寡核苷酸片段，1代表的是一个人工设计的上链寡核苷酸片段，主要是提供酶切序列和作引物用，同样它的5’端磷酸化，2、3、4、5、6、7、8、9、10代表的分别是合成的下链寡核苷酸片段，其中有些链能同时与不同的上链相互补，以便用于拼接不同株系的上链，其中片段1、6、10还将用作引物来扩增合成链。
按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因拼接操作分别将片段A、2、3为一组；片段B、4、5为一组；片段C、D、3、8、10、1为一组，按等摩尔混合。混合好的片段溶液10μl放于已升温到95℃的水浴锅中，断电后自然冷却10小时。
按O86(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)多肽顺序的基因拼接操作分别将片段C、7、3为一组，片段D、8、9为一组，片段A、B、3、4、6、1为一组按等摩尔混合。混合好的片段溶液10μl于已升温到95℃的水浴锅中，断电后自然冷却10小时。3.片段连接按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因拼接操作的三组拼接产物各取适量混合，取5μl加入等量的连接缓冲液I(大连宝生生物公司产品)，于16℃连接16小时以上。70℃灭活10分钟后，用TE缓冲液稀释100倍，-20℃保存。
按O86(20肽-14肽)-O58(20肽-14肽)多肽顺序的基因拼接产物处理同上。
连接后的片段实际上是一环形DNA链。即按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段。
第一种情况的合成链，即按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段，由于片段上链寡核苷酸链5’端磷酸化，所以连接成一完整的环形DNA单链。下链在寡核苷片段间仍是缺口，但不影响利用片段1、10作为引物，通过PCR可对其进行的扩增。第二种情况的合成方式相似。4.合成片段的PCR扩增利用引物序列对上述连接产物进行PCR扩增，PCR在PE480 PCR仪上进行。
PCR反应体系10XPCR缓冲液5μl，10mM dNTP 4μl，Pfu DNA聚合酶2U，引物1(80ng/μl)2μl，引物2(80ng/μl)2μl，连接产物1μl，加水到总体积50μl，上述成份均加入到0.5mL PCR管，混均后覆盖一层无菌石蜡油(20-30μl)。
其中扩增按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段用片段1、10作为引物，扩增按O58(20肽-14肽)-O86(20肽-14肽)多肽顺序的基因片段用片段1、6作为引物。
PCR程序为95℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟，65℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，循环30次。反应结束后取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。其余用酚/氯仿抽提法纯化。-20℃保存。实施例2.口蹄疫多肽疫苗融合基因的油菜叶绿体定点表达和转化载体构建1.叶绿体定点重组片段的克隆rps7基因的扩增和克隆参照烟草叶绿体rps7基因两端的序列，设计并由上海生工公司合成如下两个引物，每个引物的5‘端分别添加了特定的酶切位点和保护碱基5’GCGGGTACCGCCCTTATAAAAAGAA 3’(SEQ ID NO5)KpnI5’CGCGGGCCCCTTCTCTCCATCGG 3’(SEQ ID NO6)ApaI
以油菜叶绿体DNA为模板，用上述引物扩增油菜的rps7基因。反应液组成为10×Taq buffer 5μl，dNTPs(各2.5mmol/L)2μl，引物(10pmol/μl)各2μl，油菜叶绿体DNA(20-50ng/μl)2μl，高保真DNA聚合酶(3-5U/μl)1μl，加灭菌双蒸水至50μl。PCR扩增程序为95℃预变性5min→95℃变性30s，48℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环→72℃延伸10min。
扩增后得到一条1.0kb的DNA片段，其大小与来自烟草和水稻的相应DNA片段相一致，因此，我们推测该片段可能包含着油菜叶绿体的rps7基因。将这一片段连接进pGEM-T vector，转化大肠杆菌共得到72个白色菌落。对其中10个菌落的质粒进行酶切，发现有8个菌落含有1.0kb的插入片段，我们将这些重组质粒定名为pTR(1-8)。
ndhB基因的扩增和克隆参照烟草叶绿体ndhB的基因序列，设计并合成了如下两个引物，每个引物的5’端分别添加了特定的酶切位点和保护碱基5’GCGGCGGCCGCCCATGGAATAAGGTTTGAT 3’(SEQ ID NO7)NotI5’CGCCCGCGGGAATGTATATAACCCTATTC 3’(SEQ ID NO8)SacII以油菜叶绿体DNA为模板扩增油菜的ndhB基因，反应液体系中除引物不同外其它同前。扩增后得到一条大约2.4kb的DNA片段，扩增产物经纯化回收后，用NotI和SacII双酶切，然后连接于经同样酶切的pBluescriptSK质粒上，再转化感受态大肠杆菌DH5α。对LB(Amp100mg/L)平板上长出的菌落进行酶切鉴定。结果表明这10个菌落均含有2.4kb的插入片段。这些重组质粒定名为pSN(1-10)。2.油菜叶绿体定点转化中间载体构建用以上克隆的rps7基因和ndhB基因作为同源重组片段，构建油菜叶绿体的定点转化载体。首先将包含rps7基因的1.0kb DNA片段(在构建过程中简称rps7)用KpnI和ApaI从pTR4上切下，插入到经同样酶切的pBluescript SK(+)上，获得质粒pSR21。再用KpnI和XhoI将rps7从pSR21上切下，插入到经同样酶切的pSN上，得到质粒pSNR4。用XhoI和NotI切割质粒pSZB8，得到筛选标记基因aadA的表达盒(Prrn-aadA-psbA3’)，此表达盒插入到经同样酶切的pSNR4上，得到中间载体pNRA8。3.口蹄疫多肽疫苗的融合基因及其叶绿体表达框的构建质粒p16SP和pT393分别含有叶绿体基因启动子Prrn和终止子psbA3’，经适当酶切、连接可得到既包含启动子、又包含终止子的质粒pTP4。将合成片段经NocI酶切、补平，再经EcoRI酶切，与用EcoRI和SalI酶切的GFP基因片段一同插入到质粒pTP4的启动子和终止子之间，得到包含抗源多肽-GFP融合疫苗基因的表达盒的中间载体pTPFG1。由于该中间体上疫苗基因位于原核性叶绿体启动子下，所以疫苗基因可以在大肠杆菌中表达，即克隆该质粒的菌体可以在长波紫外或荧光显微镜下用兰光激发出绿色荧光。4.最终载体的构建pTPFG1经XhoI酶切、补平、NotI酶切，可回收疫苗基因表达盒，然后插入到经SpeI酶切、补平、NotI酶切的pNRA8上，得到最终的叶绿体转化载体pNRAFG1。该载体包含融合基因形式的口蹄疫疫苗基因表达盒和aadA筛选标记基因的表达盒，在它们的两侧分别是来自油菜叶绿体的同源DNA片段rps7和ndhB。pNRAFG1经酶切验证表明构建正确(见
图1)。实施例3.口蹄疫多肽疫苗融合基因的油菜叶绿体转化植株的获得1.材料植物受体为甘蓝型双低(低芥酸、低硫苷)油菜(Brassica napusL.)品种H165。
采用的培养基为MSMS基本成分+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH5.8
MB6MS+6-BA 6mg/L，pH5.8MB1MS+6-BA 1mg/L，pH5.8MNMS+NAA 0.1mg/L，pH5.8BSB5+6-BA 6mg/L+NBA 0.45mg/L+AgNO3 10μM，pH5.8质粒pNRAFG1的大量制备参照《Molecular cloning》(Sambrook等，1989)介绍的方法进行。提取的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测纯度及浓度，并将浓度调至1μg/μl。
基因枪子弹的制备制备金粉悬液60mg金粉加1ml无水乙醇；振荡混合1-2min，离心弃乙醇；重复A、B步骤三次；10,000rpm离心1min，去上清，加入1ml无菌水，重悬；10,000rpm离心1min，去上清，加入1ml无菌水，重悬。
制备子弹取50μl金粉悬液，依次加入5μl质粒pNRAB(1μg/μl)，50μl 2.5mol/L CaCl2，20μl 0.1mol/L亚精胺；振荡混合3min，10,000rpm离心1min，去上清；加入250μl无水乙醇，振荡混合，离心10s，去上清；加入60μl无水乙醇，重悬。轰击时每枪取5-10μl。2.基因枪转化以培养4-5天的油菜子叶柄作为转化的受体材料。
材料预处理将油菜子叶柄放在MS附加0.5mg/L甘露醇(或山梨醇)的高渗培养基上，进行4h前高渗。然后将子叶柄排列在新培养基的受轰击区域内(事先已在培养皿底部圈定了轰击范围)，尽量使子叶柄排列紧密，并且子叶柄稍向上立起，以便增加子叶柄切口处被击中的几率。
基因枪轰击过程基因枪置于超净工作台上，用70％乙醇擦净真空室，将可裂圆片、微弹载体、阻挡网浸泡在70％乙醇中消毒15min并吹干。取5-10μl包被DNA的金粉悬液，均匀涂在微载体中部并吹干。打开电源、真空泵及氦气瓶阀，将被选择压力的可裂圆片装入固定盖旋紧，将载有微弹的微载体及阻挡网装入发射装置。将装有子叶柄的培养皿放进真空室所选定的位置上，拿开培养皿上盖露出靶组织。抽真空，选择适当压力(1100psi)进行轰击。每皿轰击两次。之后将子叶柄放平，贴在高渗培养基上进行后高渗16h。前后几批共轰击子叶柄1000个左右。3.转化植株的筛选经过后高渗处理的子叶柄转入MB6培养基培养2-3天，然后转入MB6附加壮观霉素(Spe)8mg/L的筛选分化培养基中。三周后将得到的绿色芽丛转入MB6附加Spe 10mg/L的筛选分化培养基，在此培养基上连续继代两次，每次三周。然后将获得的绿芽转入MB1附加Spe 10mg/L的分化培养基。在此培养基上长大的再生苗是转化植株的T0代。4.转化植株的同质化由于T0代的叶绿体转化植株很难达到同质化，即所有叶绿体DNA分子均被转化，所以在本发明中还要对再生的芽体要进行同质化筛选培养，其具体操作为切取1cm见方T0代的真叶叶片，放于附加壮观霉素(Spe)10mg/L的BS培养基上诱导培养至产生再生芽，即T1代，若通过检测发现没有达到同质化，则继续将T1代的真叶叶片切成1cm见方小块，放于附加壮观霉素(Spe)10mg/L的BS培养基上诱导培养至产生再生芽，此为T2代，同理检测达不到同质化要求的继续进行类似的筛选培养，真至获得的再生芽达到同质化的要求。
达到同质化的转化基因芽体转入MN附加Spe 8mg/L生根培养基，根系发育良好的植株栽入盆土中，实施例4.转基因油菜的检测1.GFP荧光鉴定用长波紫外灯照射所(国产的三波长紫外检测仪上的长波即可)得到的绿苗，能发出绿色荧光的为转基因个体。或利用荧光显微镜的兰光激发条件下观察转植株的叶片，有绿色荧光的为转化植株，而且也表明在绿色荧光蛋白基因上游的口蹄疫免疫源性多肽也一定表达了。2.叶绿体转化的同质化PCR方法检测PCR引物的设计为了使PCR扩增结果能够说明外源基因是否定点插入在两个同源片段之间以及纯合化的程度，在设计引物时特意将一个引物rps7同源片段上游第65bp处，将另一个引物选定在ndhB基因起始密码下游第267bp处。使用这两个引物，如果叶绿体转化体达到同质化，则只能扩增出4kb DNA片段一条带；如果为杂合体，则能扩增出约4kb和1.1kb两条带；如果为非转化体，则只能扩增出1.1kb的一条带。
由于油菜的叶绿体基因组全序列目前还不清楚，一个引物使用了烟草相应部位的DNA序列，而另一个引物则采用油菜ndhB基因本身的序列。两个引物的序列如下5’GAGATCCACCCTACAATATG 3’(SEQ ID NO9)5’TCCTGAAAAGCTAATCATAGG 3’(SEQ ID NO10)PCR反应取以转化植株的总DNA作为模板，按标准反应程序进行PCR扩增。由于扩增产物中可能存在4kb的大DNA片段，本实施例中选用了TaKaRa公司生产的适于扩增大片段的LA Taq酶。反应液组成为油菜总DNA(20-50ng/μl)2μl；10×LA buffer 5μl；dNTPs(各2.5mmol/L)5μl；引物1(10pmol/μl)1μl；引物2(10pmol/μl)1μl；TaKaRa LA Taq酶1μl；加灭菌双蒸水至50μl。
具体扩增条件为95℃预变性5min；然后95℃1min→47℃1min→72℃8min，共循环30次最后72℃延伸10min。反应结束后取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
第一次转化再生的植株检测结果一般是非同质化植株，即通过PCR检测扩增出约4kb和1.1kb两条带，其中1.1kb条带较重，而4kb条带很弱。但将再生植株的切成小块再进行一轮筛选培养，PCR检测的结果仍会有1.1kb条带，但弱一些，而两4kb条带强一些，经过几次筛选培养，最终的植株检测时，只有4kb条带，这时才能判定转化植株的叶绿体转化达到纯质化。3.口蹄疫疫苗基因表达产物的检测阳性抗源制备将原核表达载体质粒pET28a利用NcoI和SalI酶切，回收切开的质粒片段，将其与NcoI和EcoRI酶切的多肽疫苗基因片段、EcoRI和SalI酶切的GFP基因片段一同进行连接，连接产物转化受体菌BL21的感受态，获得的含多肽疫苗融合基因的载体质粒的转化子，参照相关pET产品说明书将转化子菌体进行诱导培养，收集菌体，分离产物经SDS蛋白电泳检测纯度后为阳性抗源。另外蛋白还可从SDS-PAGE胶上切下，干燥粉碎后注射动物(如兔)获得相应的抗血清。
植物蛋白的提取取100mg植物材料，加研磨缓冲液(10mM Tris.Cl，0.02 NaN3，0.001％PMSF，pH8.0)200μl，冰浴中研成匀浆，5000rpm室温下离心10分钟，取上清。
酶联免疫测定按标准的酶联免疫方法进行测定，其中检测样品为从原核表达分离的阳性蛋白样口，从转化的植物分离的蛋白，并未转化植物分离出的蛋白作为阴性蛋白样品。
取一定量样品加入到反应板中包被，其阳性抗源蛋白按梯度加于反应板的孔中。
洗掉多余的抗原。
加入测试抗体—兔抗口蹄疫抗血清(利用阳性蛋白注兔子产生的，或直接用中国兰州兽医所生物所的兔抗口蹄疫血清)。
洗掉多余的抗体。
加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔1gG。
洗去未结合之二抗。
加入NBT/BCIP显色液。
显色酶标仪测定吸光值(OD值)，根据从植物中分离抗源的有色终产物含量和阳性抗源有色产物梯度即可测量带测抗原的含量。
一般地讲，同质化的转化植物中多肽疫苗融合蛋白可占总可溶蛋白的1％以上。
序列表<110>甘肃亚盛集团中国科学院遗传研究所<120>用于生产口蹄疫疫苗的油菜叶绿体转基因植物的获得方法<130>I2001666<160>24<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1037<212>DNA<213>油菜<400>1aactgattct tgaccccctt tcacgctcat gtcacgtcga ggtactgcag aagaaaaaac 60tgcaaaatcc gatccaattt atcgtaatcg attagttaac atgttggtta accgtattct 120gaaacacgga aaaaaatcat tggcttatca aattatctat cgagccttga aaaagattca 180acaaaagaca gaaacaaatc cactatctgt tttacgtcaa gcgatacgtg gagtaactcc 240cgatatagca gtaaaagcaa gacgtgtagg cggatcaact catcaagttc ccattgaaat 300aggatccacg caaggaaaag cacttgccat tcgttggtta ttaggggcat cccgaaaacg 360tccgggtcga aatatggctt tcaaattaag ttccgaatta gtggatgctg ccaaagggag 420tggcgatgcc atacgcaaaa aggaagagac tcatagaatg gcagaggcaa atagagcgtt 480tgcacatttt cgttaatcca tgaacaggat ctatatagac acatagatcc gtggatccat 540acatctcgat ccgaaaagaa tcaatagaaa aagaaaaaat cggaattgat cgatctcttt 600ctcgaaacaa acgaaaagga aagaaaagac gaaacataaa tcatggatca actaagccct 660ctcggggact tgcttaagaa taagaaagag caatctcatg taaataccat ggaataaggt 720tttaacctat tcatggggat tccgtaaata ttccattcaa aaaaaaaaaa attggttttt 780ttttggagat tggatgcagt tactaattca tgatctggca tgtacagaat gaaaatttca 840ttctcgattc tacgagaatt tttatgaaag cctttcattt gcttctcttc gatggaagtt 900ttattttccc agaatgtatc ctaatttttg gcctaatcct tcttctgatg atcgattcaa960cctctgatca aaaagatata ccttggttat atttcatctc gtcaacaagt ttcgtaatga1020gcataacggc cctattg 1037<210>2<211>2467<212>DNA<213>油菜<400>2cctattcatg gggattccgt aaatattcca ttcaaaaaaa aaaaaattgg tttttttttg60gagattggat gcagttacta attcatgatc tggcatgtac agaatgaaaa tttcattctc120gattctacga gaatttttat gaaagccttt catttgcttc tcttcgatgg aagttttatt180ttcccagaat gtatcctaat ttttggccta atccttcttc tgatgatcga ttcaacctct240gatcaaaaag atataccttg gttatatttc atctcgtcaa caagtttcgt aatgagcata300acggccctat tgttccgatg gagagaagaa cctatgatta gcttttcagg aaatttccaa360acgaacaatt tcaacgaaat ctttcaattt cttattttac tatgttcaac tctctgtatt420cctctatccg tagagtacat tgaatgtaca gaaatggcta taacagagtt tctgttattc480gtattaacag ctactctagg aggaatgttt ttatgtggtg ctaacgattt aataactatc540tttgtagctc cagaatgttt cagtttatgc tcctacctat tatctggata taccaagaaa600gatgtacgat ctaatgaagc tactatgaaa tatttactca tgggtggggc aagctcttct660actctggttc atggtttctc ttggctatat ggttcatccg ggggagagat tgagcttcaa720gaaatagtga atggtcttat caatacacaa atgtataact ccccaggaat ttcaattgcg780cttatattca tcactgtagg aattgggttc aagctttccc tagccccttc tcatcaatgg840actcctgacg tataccaagg agtgcggttc gtttgagaaa ttcctacctc tctatctatc900tctgagatgt ttggattttt caaaactcca tggacatgca gaagagaaat gctatcccca960cgcagaccaa gacagaactt tgacttgttc aaataacaat taatgtgaag cagggtcagg1020aacaacgaat ctctttatga taaacggatc cattttgcaa gtttgttatt acgggtagtt1080cctacaaagg atcggactaa tgacgtatac aagaaagact tgaattctcg atgtagatgc 1140tacatagttg gttctcatcc ttcagagact acgagtgtaa taggagcatc cgtcgacaaa 1200aggatcaccc taagatgatc atctcatggc tattgagaac gaatcaaatc agatggttcc 1260atttctcaat ctttcggacg tgctcctacg gaaccaaggt cgaaacgatt gagaaaaatc 1320agtcattcac aaccactgat gaaggattcc tcgaaaagtt aaggattagt catccgtttt 1380agaaaggatt cgatcttaac atacgcgagg aaagtaatca aaaaagaaag aagatgagtt 1440cttctttact tttatcactt aggagccgtg cgagatgaaa gtctcatgca cggttttgaa 1500tgagagaaag aagtgaggaa tcctcttttc gactctgact ctcccactcc agtcgttgct 1560tttctttctg ttacttcgaa agtagctgct tcagctttag ccactcgaat tttcgatatt 1620cctttttatt tctcatcaaa tgaatggcat cttcttctgg aaatcctagc tattcttagc 1680atgatattgg ggaatctcat tgctattact caaacaagca tgaaacgtat gcttgcatat 1740tcgtccatag gtcaaatcgg atatgtaatt attggaataa ttgttggaga ctcaaatggt 1800ggatatgcga gcatgataac ttatatgctg ttctatatct ccatgaatct aggaactttt 1860gcttgcatta tattatttgg tctacgtacc ggaactgata acattcgaga ttatgcagga 1920ttatacacaa aagatccttt tttggctctc tctttagctc tatgtctctt atccctagga 1980ggtcttcctc cactagcagg tttttttgga aaacttcatt tattctggtg tggatggcgg 2040gcaggcctat atttcttggt ttcaatagga ctccttacga gcgttctttc tatctactat 2100tatctaaaaa taatcaagtt attaatgact ggacgaaacc aagaaataac ccctcacgtg 2160cgaaattata gaatatcccc tttaagatca accaattcca tcgaattgag tatgattgta 2220tgtgtgatag catctactat accaggaata tcaatgaacc cgattattgc gattgctcag 2280gatagccctt tttagcttct agaatctatt tcttagttca agatccctct tactaactgg 2340aatcaaagaa ttagtagatc ggttccgccc aaaatgggaa tggactaagg ttatgaactt 2400ataatctata atctgatgat cgagtcgatt ccatgattat aagttcattc cataccggac 2460caggccg 2467<210>3<211>204<212>DNA<213>口蹄疫疫苗<400>3gtgaccaaag tgagaggcga tctgcaggtg ctggcgcaga aagcggcacg ctctctgccg60agacataaac agaagattgt ggcaccaggc aaacgcctgc tggtgagcaa cgtgagaggc120gatctgcgag tgctggcgca gaaagcggaa agagcgctgc cgagacataa acagaagatt180gtggcaccag caaaacaact gctg 204<210>4<211>204<212>DNA<213>口蹄疫疫苗<400>4gtgagcaacg tgagaggcga tctgcgagtg ctggcgcaga aagcggaaag agcgctgccg60agacataaac agaagattgt ggcaccagca aaacaactgc tggtgaccaa agtgagaggc120gatctgcagg tgctggcgca gaaagcggca cgctctctgc cgagacataa acagaagatt180gtggcaccag gcaaacgcct gctg 204<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gcgggtaccg cccttataaa aagaa 25<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6cgcgggcccc ttctctccat cgg 23<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7gcggcggccg cccatggaat aaggtttgat30<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8cgcccgcggg aatgtatata accctattc 29<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gagatccacc ctacaatatg 20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10tcctgaaaag ctaatcatag g 21<210>11<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>11gtgaccaaag tgagaggcga tctgcaggtg ctggcgcaga aagcggcacg ctctctgccg60<210>12<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>12agacataaac agaagattgt ggcaccaggc aaacgcctgc tg 42<210>13<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>13gtgagcaacg tgagaggcga tctgcgagtg ctggcgcaga aagcggaaag agcgctgccg60<210>14<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>14agacataaac agaagattgt ggcaccagca aaacaactgc tg 42<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>15gaattctaat agctcgaggt cgacaagctt accatg 36<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>16tttggtcacc atggtaagct tgtcgac27<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>17cgctttctgc gccagcacct gcagatcgcc tctcac 36<210>18<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>18tggtgccaca atcttctgtt tatgtctcgg cagagagcgt gc 42<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>19gttgctcacc agcaggcgtt tgcc24<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>20ctcgagctat tagaattcca gcaggcgttt gcc 33<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>21gttgctcacc atggtaagct tgtcgac 27<210>22<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>22tggtgccaca atcttctgtt tatgtctcgg cagcgctctt tc42<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>23tttggtcacc agcagttgtt ttgc 24<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>24ctcgagctat tagaattcca gcagttgttt tgc 3权利要求
1.一种用于生产口蹄疫多肽疫苗的油菜叶绿体转基因植物的获得方法，包括以下步骤(1)构建用于向油菜叶绿体中定点转化外源基因的油菜叶绿体相关DNA序列；(2)合成编码口蹄疫多肽疫苗的基因序列，使该序列与报告基因或具有强免疫源性蛋白的基因串联得到融合的口蹄疫多肽疫苗基因；(3)将步骤(1)构建出来的DNA序列与步骤(2)合成的融合的口蹄疫多肽疫苗基因重组，使融合的疫苗基因序列位于油菜叶绿体相关DNA序列的中间；(4)将步骤(3)中重组得到的DNA片段插入到克隆载体的多克隆位点上，作为口蹄疫多肽疫苗基因油菜叶绿体定点转化载体；和(5)用步骤(4)得到的转化载体转化油菜，获得叶绿体表达口蹄疫多肽疫苗的转基因植物。
2.按照权利要求1的方法，其中步骤(1)中所述的用于向油菜叶绿体中定点转化外源基因的DNA序列含有SEQ ID NO1所示序列或其不小于1kb的片段和SEQ ID NO2所示序列或其不小于1kb的片段。
3.按照权利要求1的方法，其中步骤(2)中所述的编码口蹄疫多肽疫苗的基因含有SEQ ID NO3及SEQ ID NO4所示序列。
4.按照权利要求3的方法，其中步骤(3)中所述融合的疫苗基因位于SEQ ID NO1和SEQ IN NO2的中间。
5.按照权利要求1的方法，其中步骤(2)所述的报告基因是绿色荧光蛋白基因，所述具有强免疫源性蛋白的基因选自口蹄疫病毒VP1蛋白基因或乙肝核心蛋白基因。
6.一种向油菜叶绿体定点转化外源DNA的方法，包括以下步骤(1)构建用于向油菜叶绿体定点转化外源基因的油菜叶绿体相关DNA片段；(2)将步骤(1)构建出的DNA片段与外源基因重组，使外源基因序列位于油菜叶绿体相关DNA序列的中间；(3)将步骤(2)重组得到的DNA片段插入到克隆载体的多克隆位点上，作为外源基因油菜叶绿体定点转化载体；和(4)用步骤(3)得到的转化载体转化油菜，使外源基因在油菜叶绿体中表达。
7.按照权利要求6的方法，其中步骤(1)所述的油菜叶绿体相关DNA片段含有SEQ ID NO1所示序列或其不小于1kb的片段和SEQ IDNO2所示序列或其不小于1kb的片段。
8.按照权利要求7的方法，其中步骤(2)所述外源基因位于SEQID NO1和SEQ IN NO2所示序列的中间。
全文摘要
本发明涉及一种用于生产口蹄疫多肽疫苗的油菜叶绿体转基因植物的获得方法。方法包括克隆油菜叶绿体基因组同源重组片段SEQ ID NO1所示序列，以及SEQ ID NO2所示序列，并用这两个DNA片段构建油菜叶绿体定点转化载体，在载体上这两个片段之间，插有口蹄疫多肽疫苗基因(即SEQ ID NO3及SEQ ID NO4所示序列)与绿色荧光蛋白或其它报告基因串联而得的融合疫苗基因。并将融合基因插入一种克隆载体中。通过转基因技术，使该基因的同源重组序列与油菜叶绿体发生定点整合。再经对油菜细胞的筛选与植株诱导与培育，最终获得表达口蹄疫多肽疫苗的油菜叶绿体转基因植物。
文档编号C12N15/82GK1429907SQ0114516
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月31日 优先权日2001年12月31日
发明者周长生, 陈正华, 杜若甫, 胡赞民, 石锐 申请人:甘肃亚盛集团, 中国科学院遗传研究所