一种细胞芯片在基因毒理和动物毒理上的应用的制作方法

专利名称：一种细胞芯片在基因毒理和动物毒理上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种细胞芯片在基因毒理和动物毒理上的应用。
背景技术：
目前国际上仅有美国少数的生物仪器公司和大学研究部门在开展细胞芯片 技术的研究，这些公司在细胞组织培养芯片仪器领域已经有一定的原型产品， 但是目前这些产品大多不是以人的细胞作为对象，而是以猪等非人类细胞为研 究材料的，而且目前产品的价格和效率无法满足实际需要，所以迫切需要开发 新一代的产品。肝脏的组织工程研究在美国和日本的实验室已经开展多年，国 内目前也有少数实验室从事这方面的研究，但是从事人类肝脏细胞研究的则还 没有.将二者结合实现在细胞芯片上的三维肝脏组织长期培养尚未有报道。
另外我国目前300万慢性乙型肝炎病人，其中有30万肝硬化患者，此外每 年约有2% ~3%的患者发展至肝硬化.肝硬化患者中每年肝癌的发生率约为3 %~10%.对于肝硬化和肝癌，肝脏移植手术是一种有效的治疗手段.但是肝 脏移植有许多条件的限制，并非所有的病患皆有等待换肝的机会；再者，肝脏 的供体缺乏，体外培养的肝脏组织可以作为的桥梁来帮助末期肝病的病人，让 病人延长生命以等待适当的肝脏捐增者，因此，开发一个成功的人工肝脏支持 系统将在临床上有重要意义.

发明内容
本发明针对解决的上述问题,本发明提供了 一种一种细胞芯片在基因毒理和动 物毒理上的应用，它利用三维细胞培养技术可以使体外培养的肝脏细胞具有与 体内肝脏组织具有类似的结构和恒温，稳定pH值等条件，同时结合细胞芯片技 术达到活性肝脏组织在体外长期存活，这对建立人工肝脏支持系统将致关重 要。
本发明釆用了以下技术方案细胞芯片在基因毒理和动物毒理上的应用。 所述的芯片中的三维细胞培养形成体内的结构和功能。所述的芯片中的细胞培 养芯片为提外细胞培养创造条件控制，从而实现细胞的长期存活。
采用了以上技术方案后，肝脏组织在细胞芯片上形成与体内类似的结构以
及相类似的PH值、营养，温度，和C02的浓度，这样肝脏组织在细胞芯片上存活 时间达到一个月以上，肝细胞功能基因，如Albumin, HNF4,的表达达到与体 内相似水平，实现肝细胞芯片的大规模培养，量化人造肝脏在毒理、药理上的 反应，还可以比较人造肝脏、动物实验及离体肝脏、肝细胞之体外试验对药物 的反应。


图1为上皮细胞在三维组织培养中形成类似体内组织的结构
具体实施例方式
本发明为一种细胞芯片在基因毒理和动物毒理上的应用，细胞芯片也称人 造肝脏，本发明中所述的芯片中的三维细胞培养形成体内的结构和功能。所述 的芯片中的细胞培养芯片为提外细胞培养创造条件控制，从而实现细胞的长期 存活。
一、器件的设计和制作流程 1、首先制作一种配备有温控和流控集成部件的微流体器件。它大致由两 部分组成，第一部分由高分子聚合材料PDMS做成，PDMS是一种光学透明材料 而且可以永久性的沾粘到光滑的硅片表面。微流体通道和表面电极通过光刻蚀 方法做在芯片的表面。PDMS芯片中心部分被移除来作为一个个小的细胞培养 皿。这些微流体通道为向微型细胞培养皿中输送培养液和其它液体提供了通道。 这些金属接触电极将会与外部的温度和流速控制电路相连。第二部分由丙烯酸 聚酯做成而且和第一部分相连。铂电极和银电极将被做在第二部分上。蜿蜒的 铂电极将用来测量局部的温度。在第一和第二部分合在一起后，所有的电极将 被密闭到细胞培养皿内 第一部分
第一部分用光刻蚀的方法做成.首先微型脊梁样板用标准光刻蚀法做在4英尺 的硅片上.硅片表面镀上一层防粘分子，然后l到2亳米厚的液体pdms会灌注 在硅片上，随后放在平桌上在室温下固化.Pdms的上表面在固化以后会很平滑. 一层50到100纳米厚的金属层用金属蒸镀法镀在pdms表面。然后一层2微米
厚的正光刻胶旋转到pdtns表面，然后用光刻蚀排版。排好版的光刻胶作为下一 步的金腐蚀掩膜。腐蚀后金属电极保留在pdms表面而且光刻胶用丙酮溶解。 最后pdms从硅片上揭下来切成小芯片，在微流通道两端打孔作为入口和出口。 第二部分
第二部分会用激光切割技术制造。首先超平且透明的丙烯酸聚酯被切成直径为 4英尺的薄片，然后用于感温的铂电极和银电极将会用标准的光刻蚀方法，电 子束金属蒸镀和溶剂协助抬离法排版在4英尺的丙烯酸聚酯薄片上。接下来用 激光切割方法4英尺的丙烯酸聚酯片被切成小芯片并且在小芯片上钻孔。最后 第二部分被用热扩散的方法与第一部分结合在一起，所后进一步的用液体的 PDMS或胶水粘和。
2、 微型流体器件集成和试验装置
微流细胞培养皿将与另外的电路芯片集成在一起。电路芯片是一个硅材料器件 而且表面有一层很薄的二氧化硅作为隔离层。二氧化硅可以通过氧离子修饰与 pdms表面永久性连结在一起。随后微型细胞培养皿将被封闭起来并且通过微 流通道与入口和出口相连。管道和连结器被装在入口和出口然后与外部的真空 泵连接。培养液和洗涤液将通过外部的真空泵控制输入到微型器件内。下图显 示了第一代的细胞培养芯片和各种细胞。
3、 肝脏组织在细胞芯片上体外重建
我们将首先从小鼠肝脏中分离出肝细胞，然后将单个细胞种植在胞外基质形成 的三维胶体中.在合适的条件下，这些细胞一周后可以成长为具有功能组织细 胞团(organoids).我们将实验不同的胞外基质组合，目标是摸索出一种最适合 肝细胞的三维培养环境.通过荧光标记和激光共聚焦显微技术，可以确定这些 组织细胞团是否具有正确的结构.利用定量PCR技术，我们将在长期培养过程 中检测几种肝细胞功能基因，如Albumin, HNF4.这些基因的表达量可以做为 肝细胞活性的指标. 二、前临床药物筛检
(l)动物实验检查肝脏毒性可分为长期和短期试验，这些试验均常用大、小 鼠来进行。由于狗对大多数毒物较敏感，故有时也被釆用。受试化学物给予动
物的途径应与人实际暴露的途径相同。但吸入试验较困难。
检验方法有
A、 病理检查
B、 显微镜检查光学显微镜下可观察到许多组织学变化，电子显微镜可检查各 种次细胞结构的变化。观察次细胞结构改变，结合生化变化，有助于了解毒物 作用机转。
C、 生化检查许多血清酶可作为肝损伤的指标，由于肝受损，酶从细胞液体和 细胞结构(如粒腺体、溶酶体和核)内释放入血。
(2 )体外试验
1、 的广泛作用。
2、 离体肝细胞从大鼠和人体分离的或经过培养的肝细胞，已用于各类生化研 究。常用新分离的肝细胞，但它们仅能保存2-6小时，若置与培养液内，能存 活l-5天。正常的肝细胞很少或没有有丝分裂活性。为了研究对分裂期肝细胞 的影响，可用于幼龄动物的肝细胞或肝瘤细胞。 分离的肝细胞可用于测定各类毒物作用的性质
A、 可用于显微镜或生化试验以检查膜损伤。生化方法包括测定细胞摄取辅助因 子(如MDPH),极性染料(如锥蓝)以及酵解物(如琥珀盐酸)的能力，测定 漏逸出的胞浆酶。
B、 检查大分子的改变，如抑制蛋白和RNA合成以及增加DM合成。
C、 其它包括中间代谢物、肝细胞活性和生长的变化。 (3)人造肝脏(肝细胞芯片)
2.肝脏组织在细胞芯片上体外重建。 (4 )量化人造肝脏在毒理、药理上的反应
将药物投注至人造肝脏后，观察芯片及纪录其毒理、药理上之反应，并利用统 计分析之方法将实验结果予以量化。
(5 )比较人造肝脏、动物实验及离体肝脏、肝细胞之体外试验对药物的反应将 比较三种不同之前临床药物检验方法，亦即分别将药物投注至三种不同药物检 验模式，比较其实验结果之差异性，进而找出其彼此间关联性，以期三维肝脏组织能够辅助甚至取代传统前临床药物检验方法。
根据图l，下面为一实施例我们将首先从小鼠肝脏中分离出肝细胞，然后
将单个细胞种植在胞外基质形成的三维胶体中.在合适的条件下，这些细胞一
周后可以成长为具有功能组织细胞团(organoids).我们将实验不同的胞外基 质组合，目标是摸索出一种最适合肝细胞的三维培养环境.通过荧光标记和激 光共聚焦显微技术，可以确定这些组织细胞团是否具有正确的结构.利用定量 PCR技术，我们将在长期培养过程中检测几种肝细胞功能基因，如Albumin， HNF4.这些基因的表达量可以做为肝细胞活性的指标.
权利要求
1、细胞芯片在基因毒理和动物毒理上的应用。
2、 根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的芯片中的三维细胞培养 形成体内的结构、功能和环境。
3、 根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的芯片中的细胞培养芯片 为人体外细胞的培养创造条件，从而实现细胞在体外的长期存活。
4、 根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的条件包括PH值、营养， 温度和C02的浓度。
全文摘要
本发明公开人造肝脏在基因毒理和动物毒理的应用。它可以使肝脏组织在细胞芯片上形成与体内类似的结构以及相类似的pH值、营养，温度，和CO₂的浓度等条件，这样肝脏组织在细胞芯片上长时间存活，肝细胞功能基因，如Albumin，HNF4的表达达到与体内相似水平，实现肝细胞芯片的大规模培养，量化人造肝脏在毒理、药理上的反应，还可以比较人造肝脏、动物实验及离体肝脏、肝细胞之体外试验对药物的反应。从而替代现有的活体动物实验。
文档编号C12M3/00GK101186876SQ20071002284
公开日2008年5月28日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者韧 徐, 徐景宏, 黄金麟 申请人:泰州伯克利生物技术有限公司;中国医药城(泰州)国际生物芯片研发中心