专利名称：活性分子复合生物肥料及其生产方法
技术领域：
本发明涉及农业生物肥料领域，具体是一种活性分子复合生物肥料及其生产方法。
背景技术：
根瘤菌是豆科植物根系上生长的细菌，它能够在常温下，把从空气中吸收和固定的游离氮转化成自身可以直接利用的氮素。不同的豆科植物具有不同的根瘤菌，约有90％的豆科牧草根部都有根瘤菌，根瘤菌需要的水分、碳水化合物和矿物质由豆科植物发达的根系提供。早在1896年西欧各国已有商业化的豆科根瘤菌接种剂出现，为农民提供固氮能力较强的根瘤菌，增加农业产量。现在根瘤菌制剂已得到广泛应用，仅在美国就有大规模制作根瘤菌接种剂的工厂数十家之多，产品销往全国各地。我国对根瘤菌的研究与开发也十分重视，但由于各种原因，研究的水平和开发的效果仍大大落后于发达国家。
结瘤因子是一类由根瘤菌分泌的信号分子，它们在结瘤的起始阶段发挥重要作用。通过盆栽实验发现染料木黄酮可以提高大豆的结瘤数和大豆的固氮水平。研究发现经过染料木黄酮诱导，慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)产生的结瘤因子能增加大豆产量，提高大豆蛋白质含量，同时也是一种植物生长调节剂，结瘤因子对种子发芽率和幼苗生长速度都有提高，结瘤因子也有抗植物真菌病的效果。已经证明大豆分泌的木黄酮类物质和茉莉酸甲酯都可以诱导得到结瘤因子。为了降低成本，发明人用数种豆科植物和非豆科植物根浸提液作为诱导剂，结果发现大豆、玉米和小麦的根浸提液都可诱导B.japonicum产生结瘤因子。
微生物肥是植物生长发育过程中不可缺少的营养元素，把微肥稀释后作叶面肥喷施，花钱少、见效快、效益高。推广使用生物肥料是推进生态农业、绿色农业的重要途径，生物肥料具有改良土壤、保护生态环境等明显的生态效益。生物肥料在和化学肥料配合使用后可大大促进作物对磷、钾的吸收，同时吸收空气中的氮。它的这两种特性一方面提高了化学肥料利用率，固定空气中的氮素并使之转化为优质氮素养料，使作物生长更加茁壮、迅速，作物更加高产；另一方面对生态环境也起着积极作用。中国专利申请“高效多功能复合微生物肥及其工业制造方法”(专利申请号99111130.3)公开了一种含根瘤菌的微生物肥。但效果有待进一步提高。
发明人在研究共生固氮的基础上开发出一种高效生物制剂，即结瘤因子活性分子复合生物肥料，该活性分子复合生物肥料的开发为农业生产提供一个新型复合生物肥料品种。
发明内容
本发明的目的是提供一种结瘤因子活性分子复合生物肥料，本肥料含有根瘤菌、结瘤因子、微量元素和大量元素等，对农作物尤其豆科植物有明显的增产效果，可应用于苜蓿、三叶草、豌豆、菜豆、羽扁豆、大豆、豇豆等豆科作物。该制剂含有的结瘤因子和根瘤菌能够增强豆科植物固氮作用，同时为作物生长提供所需的微量元素和常量元素，保障作物的高产，而且不会污染周围的环境。
本发明所说的活性分子复合生物肥料，其特征在于由独立包装的根瘤菌菌体和独立包装的结瘤因子复合液组成，其中所说的结瘤因子复合液含有结瘤因子300ug/L、硫酸铜0.2-0.4％，硼砂或硼酸1-5％、钼酸铵0.4-1％、硫酸锌1-4％、硫酸锰1-2％、硫酸亚铁1-2％。
本发明的另一个目的是提供所说的活性分子复合生物肥料的制备方法，其步骤是①诱导剂制备每80g大豆根加入500mL水研磨后，用0.45μm滤膜过滤后得诱导剂；②种子液制备YEM培养基接种慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicum，28℃，150转每分(rpm)培养直至OD620值0.4-0.6(约4-6天)制成种子液；③扩大培养及诱导以5％比例将种子液接种到二级YEM培养液中，28℃，150rpm培养直至OD620值0.8-1.0，加入0.6％诱导物，再培养2天；④活性分子复合生物肥料制备离心发酵液，沉淀的菌体用已灭菌处理的吸附剂吸附，得到的根瘤菌菌体单独无菌包装；将上清液加入Fe、Mo、Mn、Zn和B等微量元素后，单独无菌包装；所说的的微量元素浓度为硫酸铜0.2-0.4％，硼砂或硼酸1-5％，钼酸铵0.4-1％，硫酸锌1-4％，硫酸锰1-2％，硫酸亚铁1-2％。
现有的慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicum都能用于本发明，但本发明优选慢生型大豆根瘤菌ACCC15055和慢生型大豆根瘤菌ACCC15063。
本发明制得的活性分子复合生物肥料的使用方法是将结瘤因子复合液液体加水稀释20倍，混匀后加入根瘤菌菌体，混合均匀后使用。该稀释液用于喷洒苗期豆科植物的根际土壤，或先用于浸种，待播种后再喷洒至根际土壤。
本发明的活性分子复合生物肥料，含有结瘤因子活性成分，为增强其效果辅以部分微量元素及常量元素，此外伴随一定量的根瘤菌制剂共同使用。其中根瘤菌单独包装，只是在使用前才与稀释后的结瘤因子和营养元素液体混合，属新型活性分子复合生物制剂，对农作物尤其豆科植物有明显的增产效果。本发明产品稀释后可以用于豆科植物或非豆科植物播种前拌种、浸种或在苗期喷洒豆科植物的根际土壤。具有制作工艺简单、成本低、适用范围广、使用方便等特点，对提高豆科作物产量效果明显。
本发明的活性分子复合生物肥料具有制作工艺简单、成本低、适用范围广、使用方便等优点，对提高豆科作物质量和产量效果明显。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明活性分子复合生物肥料生产流程图。
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1如图1所示，按10亩地豆科植物所需产品的制作方法诱导剂制备16g大豆根加入100mL水研磨10min后用0.45μm滤膜过滤，滤液作为后续工作使用的诱导剂。
种子培养基制备1LYEM培养基配方甘露醇10g，K2HPO40.5g，MgSO40.1g，NaCl 0.1g，酵母浸出汁0.4g，蒸馏水1L，pH6.8。
种子液发酵用500mL种子液接种慢生型大豆根瘤菌ACCC15063后，28℃，150rpm培养直至OD620值0.5(约4-6天)，制成种子液。
10LYEM培养基制备甘露醇100g，K2HPO45g，MgSO41g，NaCl 1g，酵母浸出汁4g，蒸馏水10L，pH6.8。
扩大培养及诱导以500mL种子液接种到二级YEM培养液10L中，28℃，150rpm培养直至OD620值0.8-1.0(约5-7天)，加入60mL诱导剂，再继续培养2天。
诱导得到的样品经高效液相色谱仪(HPLC)检测、生物检测证明含结瘤因子。
活性分子复合生物肥料制备离心发酵液，沉淀的菌体用已灭菌处理的吸附剂(草碳)吸附，然后平均分为10小包(1亩地用量一小包，约250-400g)，无菌包装(袋1)。然后上清液中加入Fe、Mo、Mn、Zn和B等微量元素，按每包1L的量进行无菌包装(袋2)。各种微量元素加入量分别为NH4MoO420g，FeSO4·7H2O 20g，MnSO4·7H2O 50g，H3BO324g，ZnSO435g。以上2袋(袋1及袋2)装入一个大的包装袋中。
使用方法先将袋2中液体加水稀释20倍，再将袋1中的菌体加入稀释液中，混匀后使用。20L上述发酵液可稀释至200L，够10亩地所需(约10L/亩)。该稀释液用于喷洒苗期豆科植物的根际土壤，或先用于浸种，待播种后再喷洒至根际土壤。增产明显。
实施例2根据土壤元素背景调整微量元素种类及浓度(按10亩地计算)诱导剂制备16g大豆根加入100mL水研磨10min后用0.45μm滤膜过滤，滤液作为后续工作使用的诱导剂。
种子培养基制备1L YEM培养基配方甘露醇10g，K2HPO40.5g，MgSO40.1g，NaCl 0.1g，酵母浸出汁0.4g，蒸馏水1L，pH6.8。
种子液发酵用500mL种子液接种慢生型大豆根瘤菌ACCC15055后，28℃，150rpm培养直至OD620值0.5(约4-6天)，制成种子液。
10L YEM培养基制备甘露醇100g，K2HPO45g，MgSO41g，NaCl 1g，酵母浸出汁4g，蒸馏水10L，pH6.8。
扩大培养及诱导以500mL种子液接种到二级YEM培养液10L中，28℃，150rpm培养直至OD620值0.8-1.0(约5-7天)，加入60mL诱导剂，再继续培养2天。
活性分子复合生物肥料制备离心发酵液，沉淀的菌体用已灭菌处理的吸附剂(草碳)吸附，然后平均分为10小包(1亩地用量一小包，约250-400g)，无菌包装(袋1)。然后上清液中分别加入Cu、Fe、Mo、Mn、Zn等微量元素，按每包1L的量进行无菌包装(袋2)。各种微量元素加入量分别为CuSO4·5H2O 120g，NH4MoO410g，FeSO4·7H2O 20g，MnSO4·7H2O 50g，ZnSO435g。以上2袋(袋1及袋2)装入一个大的包装中。
使用方法先将袋2中液体加水稀释20倍，再将袋1中的菌体加入稀释液中，混匀后使用。20L上述发酵液可稀释至200L，够10亩地所需。该稀释液用于喷洒苗期豆科植物的根际土壤，或先用于浸种，待播种后再喷洒至根际土壤。增产明显。
实施例3按100亩地的豆科植物所需产品的生产方法(肥料生产后不包装，直接使用)诱导剂制备160g大豆根加入1L水磨成浆状，沉淀取上清用0.45μm滤膜过滤，滤液作为后续工作使用的诱导剂。
种子培养基制备5L YEM培养基配方甘露醇50g，K2HPO42.5g，MgSO40.5g，NaCl0.5g，酵母浸出汁2g，蒸馏水5L，pH6.8。
种子液制备用5L种子培养基接种慢生型大豆根瘤菌ACCC15055后，28℃，150rpm培养直至OD620值0.5(约4-6天)制成种子液。
100L YEM培养基制备甘露醇1Kg，K2HPO450g，MgSO410g，NaCl 40g，酵母浸出汁40g，蒸馏水100L，pH6.8。
扩大培养及诱导以5L种子液接种到二级YEM培养液100L中，28℃，150rpm培养直至OD620值0.8-1.0(约5-7天)，加入6L诱导剂，再培养2天。
肥料配制及施用将上述发酵液稀释20倍后加入Fe、Mo、Mn、Zn和B等微量元素，各种微量元素加入量分别为NH4MoO4200g，FeSO4·7H2O 200g，MnSO4·7H2O 500g，H3BO3240g，ZnSO4350g。以上过程完成后将肥料直接喷洒于苗期豆科植物的根际土壤，或先用于浸种，待播种后再喷洒至根际土壤。增产明显。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。
权利要求
1.一种活性分子复合生物肥料，其特征在于由独立包装的根瘤菌菌体和独立包装的结瘤因子复合液组成，其中所说的结瘤因子复合液含有结瘤因子300ug/L、硫酸铜0.2-0.4％、硼砂或硼酸1-5％、钼酸铵0.4-1％、硫酸锌1-4％、硫酸锰1-2％、硫酸亚铁1-2％。
2.一种制备权利要求1所说的活性分子复合生物肥料的方法，其步骤是①诱导剂制备每80g大豆根加入500mL水研磨后，用0.45μm滤膜过滤后得诱导剂；②种子液制备YEM培养基接种慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicum，28℃，150转每分(rpm)培养直至OD620值0.4-0.6制成种子液；③扩大培养及诱导以5％比例将种子液接种到二级YEM培养液中，28℃，150rpm培养直至OD620值0.8-1.0，加入0.6％诱导物，再培养2天；④活性分子复合生物肥料制备离心发酵液，沉淀的菌体用已灭菌处理的吸附剂吸附，得到的根瘤菌菌体单独无菌包装；将上清液加入Fe、Mo、Mn、Zn和B等微量元素后，单独无菌包装；所说的的微量元素浓度为硫酸铜0.2-0.4％，硼砂或硼酸1-5％，钼酸铵0.4-1％，硫酸锌1-4％，硫酸锰1-2％，硫酸亚铁1-2％。
3.如权利要求2所说的活性分子复合生物肥料的制备方法，其特征在于所说的慢生型大豆根瘤菌是慢生型大豆根瘤菌ACCC15055或慢生型大豆根瘤菌ACCC15063。
全文摘要
本发明涉及农业生物肥料领域，具体是一种活性分子复合生物肥料及其生产方法。本发明所说的活性分子复合生物肥料，其特征在于由独立包装的根瘤菌菌体和独立包装的结瘤因子复合液组成，其中所说的结瘤因子复合液含有结瘤因子300ug/L、硫酸铜0.2－0.4％，硼砂或硼酸1－5％、钼酸铵0.4－1％、硫酸锌1－4％、硫酸锰1－2％、硫酸亚铁1－2％。所说的活性分子复合生物肥料是通过配制培养基、种子液培养、扩大培养、结瘤因子诱导、微量元素添加等步骤制成。本发明的活性分子复合生物肥料具有制作工艺简单、成本低、适用范围广、使用方便等优点，对提高豆科作物质量和产量效果明显。
文档编号C12R1/41GK101070256SQ20071002330
公开日2007年11月14日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者连宾, 侯卫国 申请人:南京师范大学