专利名称：瓠瓜品种甬瓠1号和甬瓠2号的鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物领域，特别涉及一种瓠瓜品种甬瓠1号和甬瓠2号的DNA指纹图谱鉴定方法。
背景技术：
瓠瓜〔Lagenaria siceraria(Molina.)Standl〕为葫芦科(Cucurbitaceae)一年生草本植物，原产于印度和热带非洲，别名瓠子、扁蒲、蒲瓜。其栽培史可上朔到新石器时代，7000年前西半球已有瓠瓜，瓠瓜主要分布在印度、斯里兰卡、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾、热带非洲、拉丁美洲等国家，我国有广泛分布，而以长江以南为主。
根据果实形状，瓠瓜分为五个变种，目前瓠瓜的栽培品种均属常规种，由于种子相互混杂、退化，且易感病，已经严重影响了瓠瓜的生产。因此，利用杂种优势来选育优良的杂交后代来解决瓠瓜生产问题已成为研究的焦点。
随着对瓠瓜需求日益加大，市场上各类假、劣杂交种的问题也越来越明显，种子纠纷的事例时有发生，对育种研究者进行品种保护提出了紧迫要求，快速、准确、可靠地进行品种鉴定的方法已成为当务之急。当前瓠瓜种子鉴定多运用形态学鉴定及种子蛋白电泳等方法，但上述方法耗时长、受环境影响大、准确性低等，面对品种繁多、品种间表型差异很少而遗传基础狭窄的物种的鉴定时难以奏效。
宁波瓠瓜新品种甬瓠1号(YH-1)和甬瓠2号(YH-2)是宁波农科院蔬菜所选育的新品种。具有商品性好，品质佳，综合抗性强、高产的的优势。至今只作了大田形态学纯度鉴定。对于品种保护还远远不够。
发明内容
针对以上问题，本发明提供一种瓠瓜品种甬瓠1号甬瓠2号的DNA指纹图谱鉴定方法。
为实现本发明的目的，发明者提供以下技术方案
一种瓠瓜甬瓠1号和甬瓠2号的鉴定方法，其包括以下步骤(1)甬瓠1号或甬瓠2号与其它瓠瓜品种，均长到5-7片真叶时，每份样品各取5-7个单株的混合叶片，每株采集新鲜叶片1-1.5g，-80℃保存；(2)DNA提取参照CTAB法，提取新鲜叶片总基因组DNA；(3)采用荧光标记引物组合E-ACG/M-CAA或E-AGC/M-CAT，选择MSE I和EcoR I双酶切，对基因组DNA进行AFLP反应程序，对扩增产物进行分析；(4)数据收集与分析采用GeneMapper V3.7收集电泳图谱，在50-500bp之间，荧光信号大于100cfu且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，所有种质中都出现的共有条带不予统计；(5)比较找出甬瓠1号或甬瓠2号各自的特征性谱带，作为甬瓠1号或甬瓠2号的分子鉴定特征。
所述步骤(3)的扩增产物用ABI PRISM 3100遗传分析仪进行分析，内标为GeneScan 500[Rox]。
本发明的优点与常规形态鉴定比较，本发明的鉴定结果更准确可靠；与种子蛋白电泳法比较，耗时短、不受环境影响、准确性更高等，可以同时鉴定多品种，更方便。
图1为本发明实施例的NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-ACG/M-CAA引物组合扩增AFLP图谱。
图1中自上而下分别为NC-15、YH-31、YH-1和YH-2。
图2为本发明实施例的NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-AGC/M-CAT引物组合扩增AFLP图谱。
图2中自上而下分别为NC-15、YH-31、YH-1和YH-2。
具体实施例方式
实施例11、YH-1和YH-2、NC-15、YH-31和杭州长瓜品种，均长到5-6片真叶时，每份样品各取5个单株的混合叶片，每株采集新鲜叶片1g，-80℃保存。亲本NC-15是从宁波地方品种与国外品种杂交后经多代回交、自交选择育成商品性好、早熟、优质的稳定自交系NC-15。亲本YH-31是利用地方品种宁波夜开花经多代自交选择出的自交系YH-31。
2、DNA提取参照CTAB法(见Doyle J J，Doyle J L.Isolation ofplant DNA from fresh tissue.Focus，1990，1213～15)提取新鲜叶片总基因组DNA。
3、采用荧光标记引物组合E-ACG/M-CAA，进行AFLP反应程序基因组DNA的MSE I和EcoR I双酶切、连接、预扩增及选择性扩增反应程序具体参照Applied Biosystems AFLPTM Plant Mapping Kit(PE，UK)。PCR产物上样ABI PRISM 3100遗传分析仪进行分析。内标为GeneScan 500[Rox]。
4、数据收集与分析采用GeneMapper V3.7收集电泳图谱，50-500bp之间清晰可见、荧光信号大于100cfu且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，所有种质中都出现的共有条带不予统计。寻找特征性谱带，作为甬瓠1号甬瓠2号的分子鉴定特征。NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-ACG/M-CAA引物组合扩增AFLP图谱(图1)。
5、引物组合E-ACG/M-CAA对瓠瓜品种的鉴定将YH-1，YH-2，双亲NC-15与YH-31)及在种子外形上与YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜杂交种安吉长瓜AJ在同一大田中分块种植，记录标记后，撤去标记。采用引物组合E-ACG/M-CAA分别对甬瓠1号YH-1和甬瓠2号YH-2，双亲NC-15与YH-31及安吉长瓜AJ进行AFLP分析。E-ACG/M-CAA鉴别效果则很好，有9条差异带，九条差异带能够将YH-1、YH-2与亲本NC-15、YH-31及AJ区分十分显著(表1)实施例21、甬瓠1号和甬瓠2号、亲本NC-15、亲本YH-31和安吉长瓜品种，均长到7片真叶时，每份样品各取7个单株的混合叶片，每株采集新鲜叶片1.5g，-80℃保存。
2、DNA提取参照CTAB法提取新鲜叶片总基因组DNA。
3、采用荧光标记引物组合E-AGC/M-CAT，进行AFLP反应程序基因组DNA的MSE I和EcoR I双酶切、连接、预扩增及选择性扩增反应程序具体参照Applied Biosystems AFLPTM Plant Mapping Kit(PE，UK)。PCR产物上样ABI PRISM 3100遗传分析仪进行分析。内标为GeneScan 500[Rox]。
4、数据收集与分析采用GeneMapper V3.7收集电泳图谱，50-500bp之间清晰可见、荧光信号大于100cfu且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，所有种质中都出现的共有条带不予统计。寻找特征性谱带，作为甬瓠1号甬瓠2号的分子鉴定特征。图2为NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-AGC/M-CAT引物组合扩增AFLP图谱。
5、引物组合E-AGC/M-CAT对瓠瓜品种的鉴定将YH-1，YH-2，双亲NC-15与YH-31及在种子外形上与YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜杂交种杭州长瓜HZ在同一大田中分块种植，记录标记后，撤去标记。采用引物组合E-AGC/M-CAT分别对YH-1，YH-2，双亲及杭州长瓜HZ进行AFLP分析。E-AGC/M-CAT鉴别效果则很好，有9条差异带，九条差异带能够将YH-1、YH-2与亲本NC-15、YH-31及HZ区分十分显著(表1)。
实施例31、甬瓠1号和甬瓠2号、亲本NC-15、亲本YH-31和杭州长瓜品种，均长到6片真叶时，每份样品各取6个单株的混合叶片，每株采集新鲜叶片1.25g，-80℃保存。
2、DNA提取参照CTAB法提取新鲜叶片总基因组DNA。
3、采用荧光标记引物组合E-ACG/M-CAA，进行AFLP反应程序基因组DNA的MSE I和EcoR I双酶切、连接、预扩增及选择性扩增反应程序具体参照Applied Biosystems AFLPTM Plant Mapping Kit(PE，UK)。PCR扩增产物上样ABI PRISM 3100遗传分析仪进行分析。内标为GeneScan 500[Rox]。
4、数据收集与分析采用GeneMapper V3.7收集电泳图谱，50-500bp之间清晰可见、荧光信号大于100cfu且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，所有种质中都出现的共有条带不予统计。寻找特征性谱带，作为甬瓠1号甬瓠2号的分子鉴定特征。NC-15、YH-31、YH-1、YH-2的E-ACG/M-CAA引物组合扩增AFLP图谱与实施例1的相同(图1)。
5、引物组合E-ACG/M-CAA对瓠瓜品种的鉴定将YH-1，YH-2，双亲NC-15与YH-31及在种子外形上与YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜杂交种杭州长瓜HZ、安吉长瓜AJ在同一大田中分块种植，记录标记后，撤去标记。采用引物组合E-ACG/M-CAA分别对YH-1，YH-2，双亲及杭州长瓜HZ，安吉长瓜AJ进行AFLP分析。E-ACG/M-CAA鉴别效果则很好，有9条差异带，九条差异带能够将YH-1、YH-2与亲本NC-15、YH-31及HZ、AJ区分十分显著(表1)。
对照例将YH-1，YH-2，双亲NC-15与YH-31及两个在种子外形上与YH-1，YH-2均十分相似的瓠瓜杂交种杭州长瓜HZ，安吉长瓜AJ在同一大田中分块种植，记录标记后，撤去标记。生长期及结实后，根据形态观察鉴定各种植品种。结果，均不能正确区分6个品种。
表1 引物对E-AGC/M-CAT、E-ACG/M-CAA对瓠瓜6个品种的扩增结果
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种瓠瓜甬瓠1号和甬瓠2号的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤(1)甬瓠1号或甬瓠2号与其它瓠瓜品种，均长到5-7片真叶时，每份样品各取5-7个单株的混合叶片，每株采集新鲜叶片1-1.5g，-80℃保存；(2)DNA提取参照CTAB法，提取新鲜叶片总基因组DNA；(3)采用荧光标记引物组合E-ACG/M-CAA或E-AGC/M-CAT，选择MSE I和EcoR I双酶切，对基因组DNA进行AFLP反应程序，对扩增产物进行分析；(4)数据收集与分析采用GeneMapper V3.7收集电泳图谱，在50-500bp之间，荧光信号大于100cfu且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，所有种质中都出现的共有条带不予统计；(5)比较找出甬瓠1号或甬瓠2号各自的特征性谱带，作为甬瓠1号或甬瓠2号的分子鉴定特征。
2.根据权利要求1所述的瓠瓜甬瓠1号和甬瓠2号的鉴定方法，其特征在于所述步骤(3)的扩增产物用ABI PRISM 3100遗传分析仪进行分析，内标为GeneScan 500[Rox]。
全文摘要
本发明公开了一种瓠瓜甬瓠1号和甬瓠2号的鉴定方法，其包括以下步骤(1)甬瓠1号或甬瓠2号与其它瓠瓜品种，取单株的混合叶片保存；(2)DNA提取；(3)对基因组DNA进行AFLP反应程序，对扩增产物进行分析；(4)数据收集与分析，做条带统计；(5)比较找出甬瓠1号或甬瓠2号各自的特征性谱带，作为甬瓠1号或甬瓠2号的分子鉴定特征。本发明的优点与常规形态鉴定比较，本发明的鉴定结果更准确可靠；与种子蛋白电泳法比较，耗时短、不受环境影响、准确性更高等，可以同时鉴定多品种，更方便。
文档编号C12Q1/68GK101033492SQ200710067940
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月10日 优先权日2007年4月10日
发明者竺锡武, 应泉盛, 张 杰, 王毓洪, 皇甫伟国, 陈集双 申请人:宁波市农业科学研究院