专利名称：：慢病毒基因转移载体、其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种慢病毒基因转移载体，尤其涉及一种源于马传染性贫血病毒(EIAV)的缺陷型慢病毒基因转移载体及其构建方法、本发明还涉及慢病毒基因转移载体在体内与体外细胞的基因转移中的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
：目前所构建的EIAV基因转移载体，国外报道的主要来源于美国株，而美国株与中国株之间存在较大的差异，核苷酸同源性为78.4%—80%之间。国内尚无同类型相关报道，且在E]:AV基因转移载体上尚无人使用土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(W:PRE)和鸡!3-actin启动子(CAGp)来增强报告基因的表达。国内目前还没有商品化的EIAV基因转移载体，没有规范统一的技术，影响相关领域的研究和产品开发。
发明内容本发明首先所要解决的技术问题是提供--种新的慢病毒基因转移载体，该转移载体能够插入大片段的外源DNA序列，能够使外源基因在真核细胞中高水平的表达。本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的—种源于马传染性贫血病毒(E]:AV)的缺陷型慢病毒基因转移载体，该慢病毒基因转移载体以中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株基因为主要骨架,包含有启动子序列、多克隆位点、完整的EIAV3'LTR序列、抗性基因、poly(A)信号、cis作用序列元件等真核表达载体所必需的序列，其中，所述的启动子序列分别是CMV/R/U5启动子序列和CMVIEZ鸡e-actin启动子(CAGp)序列；CMV]:E/鸡13-actin启动子序列启动报告基因的表达；所述的CMV/R/U5启动子序列是将人巨细胞病毒的立即早期启动子/增强子(CMVIE)替换中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株基因5'LTR-U3区，使CMVIE与R和U5区串连而得；所述的多克隆位点位于CMVIE/鸡|3-actin启动子(CAGp)序列的上游和/或下游。优选的，上述慢病毒基因转移载体还含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE);上述慢病毒基因转移载体在CMV/R/U5启动子序列和CMVIE/'鸡e-act.in启动子(CAGp)序列之间含有EIAV非翻译区(UTR)的引导区序列、gag基因编码区的前334bp序列和EIAV的中央聚嘌呤序列(cPPT)和Rev反应元件(RRE);其中，中央聚嘌呤序列(cPPT)和EI:AV的Rev反应元件(:RRE)序列位于CMVIE/鸡P-actin启动子(CAGp)序列的上游;gag基因编码区的前334bp序列位于中央聚嘌呤序列(cPPT)和EIAV的Rev反应元件(RRE)序列上游；非翻译区(UTR)的引导区序列位于CMV/R/U5启动子序列和gag基因编码区的前334bp序列(gagA)之间。所述慢病毒基因转移载体的erw和pol基因区缺陷；所述的报告基因是增强绿色荧光蛋白基因(EGFP);所述的抗性基因是氨节抗性基因。更优选的，本发明慢病毒基因转移载体是pcPPTWCAG(其结构图见图1)，包含CMV/R/U5启动子序列，CMVIE/鸡actin启动子(CAGp)序列，EIAV非翻译区(UTR)的引导区序列，gag基因编码区的前334bp序列，中央聚嘌呤序列(cPPT)和EIAV的Rev反应元件(RRE)，增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，氨苄抗性基因，poly(A)信号序列和完整的EIAV3'LTR;其中，CMVIE/鸡|3-actin启动子序列启动报告基因的表达；所述的CMV/R/U5启动子序列是将人巨细胞病毒的立即早期启动子/增强子(CMVIE)替换中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株基因5'LTR-U3区，使CMVIE与R和U5区串连而得；所述的多克隆位点位于CMVIE/鸡P-actin启动子(CAGp)序列的上游和/或下游。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述慢病毒基因转移载体pcPPTWCAG的方法。本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的一种构建上述慢病毒基因转移载体pcPPTWCAG的方法，包括(1)在pCI真核表达载体(含有Arap抗性基因A,R)上插入EIAV完整的3'LTR、5'LTR-R和U5区，并用人巨细胞病毒的立即早期启动子/增强子(CMVIE)替换5'LTR-U3区，使之与R和U5区串连为载体的启动子(CMV/R/U5);(2)保留5，LTR与gag基因编码区之间非翻译区(UTR)的引导区序列和gag基因编码区前334bp序列；(3)插入报告基因及多克隆位点；(4)在多克隆位点中插入CMVIE/鸡|3-actin启动子(CAGp)，并在该启动子上游加入中央聚嘌呤序列(cPPT)和EIAV的Rev反应元件(RRE),在3，LTR和EGFP之间插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。所述的启动子CMV/R/U5中人巨细胞病毒的立即早期启动子/增强子(CMVIE)来自pCI真核表达载体，R和U5区克隆自中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株(EIAV-DLA)(全基因核苷酸序列GenBank号为AF327878);所述的5'LTR与gag基因编码区之间非翻译区(UTR)的引导区序列和部分gag基因编码区序列，中央聚嘌呤序列(cPPT)和EIAV的Rev反应元件(RRE)，以及3'LTR均克隆自中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株(EIAV-DLA)的感染性克隆(p0K8266)。所述的报告基因——增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)及多克隆位点克隆自pEGFP-Nl载体。所述的CMVIE/鸡P-actin启动子(CAGp)根据GenBank公布(AF334827和AJ575208)的序列以pCAGG-MCS质粒(pCAGG-MCS质粒的构建可按照以下文献进行HitoshiNiwa，Ken-ichiYamamuraandjun-ichiMiyazaki，隨.Efficientselectionforhigh—expressiontransfectantswithanoveleukaryoticvector,Gene,Volurae108，Issue2，15December1991，pages193-199)为模板扩增而得，其序列为SEQIDNO:1所示。所述的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)是参考土拨鼠肝炎病毒(Woodchuckh印atitisvirus,WH:V)基因组序列(GenBank登录号J04514和NC004107)以土拨鼠肝炎病毒为模板扩增而得。本发明慢病毒转移载体可以应用于表达外源基因，包括将外源基因插入到慢病毒基因转移载体的多克隆位点中；导入到真核细胞或病毒中，诱导外源基因表达；用于基因治疗。逆转录病毒载体的有效性、安全性和长期稳定的基因表达，使它们一直是用于临床基因转移的载体。慢病毒载体除了具有逆转录病毒载体共性的优点外，还具有能够感染非分裂细胞的特性。本发明载体具有慢病毒载体的共有优点，缺少所有野生型病毒辅助基因，并可以携带一个或多个选定基因以传送给靶细胞。根据想要获得的效应来选择所述的选定基因。因此，本发明的载体在基因治疗、药用制剂(诸如疫苗)的开发、生物反应器的制备方面有着巨大的潜力。图1是pcPPTWCAG结构示意图;cPPT-RRE与CAGp之间和CAGp与EGFP之间为多克隆位点。图2是pcPPTWCAG转染细胞流式细胞仪检测峰图；A区域细胞数量占全部细胞的百分比占閼值内的百分比X平均数Y-平均数全部1730386.52100.00131鹏检测区722136.1041.73311鹏A为HEK293细胞空白对照；[画]B为载体质粒转染HEK293细胞；B区域细胞数量占全部细胞的百分比占閼值内的百分比平均值Y-平均值全部1883094.15100.000.97###检测区170.090.0915.7###6C为DF-1细胞空白对照；<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>D为载体质粒转染DF-1细胞。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>具体实施例方式以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1.pcPPTWCAG的构建。1、PCR扩增EIAV驴白细胞弱毒疫苗株(根据中国兽药监查所公布的"马传染性贫血防治技术规范"以及出售的兽医生物制品"3413马传染性贫血琼脂扩散试验抗原与阴、阳性血清"、"34140马传染性贫血酶联免疫吸附试验抗原、酶标记抗体"、"34141马传染性贫血补体结合试验抗原"和"34142马传染性贫血病毒单克隆抗体_酶结合物"等试剂分离病毒，基因组序列参照"杨志彪，王柳，童光志，孔宪刚，仇华吉，马传染性贫血病病毒驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组核苷酸序列分析，中国预防兽医学报,2001，23(3)，16H66")的3'LTR和邻近的聚嘌呤序列；PC:R引物为VDLA-F5:5'-ATATGCG(;CCGCTAGAAAAACAAGGGGGCAAC-3，和VDLA-R4:5'-GCCCGGATCCATCGATTGTTAGATCTTGAAAAC—3，，扩增条件为94。C预变性5min，然后进入循环94°C30sec，55。C30sec，72。Clmin，共35个循环，最后72。C延伸10min。2、上述PCR产物经过Not:[和BamHI:酶切后，T4DNALigase连接插入同样酶切处理后的pCI质粒(pCI质粒购自Promega公司)。再用Sacl和Nhel酶切，T4DNALigase连接使同样酶切处理后的扩增(PCR引物为VDLA-F3:5'-AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCAAACGCTCAGATTCTGCGGTC-3，和VDLA-R3:5'-CGGCTAGCTAGCAATAGTACTTGTTTTTGTCCTGCTTGTCC-3'，扩增条件为94。C预变性5rain，然后进入循环94°C30sec，55°C30sec，72。Clmin，共35个循环，最后72。C延伸10min)自EIAV基因组的5'末端序列(包括部分gag序列)插入其中。然后，用Nhel和Not.I分别处理该质粒和pEGFP-Nl载体(pEGFP-Nl载体购自Clontech公司)，将pEGFP-NI载体上的多克隆位点和增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)连接插入到其中；3、Kpnl单酶切载体，并用碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，将同样酶切处理后的以pCAGG-MCS(pCAGG-MCS质粒的构建可按照以下文献进行IIitoshiNiwa,Ken-ichiYama腿raandJun-ichiMiyazaki，國Efficientselectionforhigh-expressiontransfectantswithanoveleukaryoticvector,Gene，volume108,Issue2，15December1991，pages193-199)为模板PCR(引物为3U28:5'-GGGGTACCACTAGTTATTAATAGTAATC-3，；492L25:5，-TATGGTACCGCAGCGACTCCCGCCC-3，，扩增条件为94。C预变性5min,然后进入循环94°Clmin，52°Clmin,72°Clmin，共35个循环，最后72。C延伸10min，)扩增的CMVIE/鸡P-actin启动子(CAGp)用T4DNALigase连接插入其中。利用SpeI酶酶切筛选CAGp正向插入的重组质粒载体；4、用PCR(引物为CPPRRE-Fl:5，-CCTGCTAGCTTGTAACAAAGGGAGGGAAAGTATGTGGTGTATGGGATTAT-3，和CPPRRE-R2:5'-CGGCTCGAGTTTTGACAGTGATCACTATCCACAGAAGATGTCCTGTAT-3'，扩增条件为95"C预变性5min，然后进入循环94。C30sec，59。C30sec，72。Clmin，共35个循环，最后72。C延伸10min)扩增EIAV-DLA(根据中国兽药监查所公布的"马传染性贫血防治技术规范"以及出售的兽医生物制品"3413马传染性贫血琼脂扩散试验抗原与阴、阳性血清"、"3414()马传染性贫血酶联免疫吸附试验抗原、酶标记抗体"、"34141马传染性贫血补体结合试验抗原"和"34142马传染性贫血病毒单克隆抗体_酶结合物"等试剂分离病毒，基因组序列参照"杨志彪，王柳，童光志，孔宪刚，仇华吉，马传染性贫血病病毒驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组核苷酸序列分析，中国预防兽医学报，2()()1，23(3)，161-166")的RRE序列，其引物中引入EIAV-DLA的中央聚嘌呤序列(cPPT)，分别用Nhel和Xhol双酶切处理PCR产物和载体，胶回收PCR产物目的片段和载体片段，然后用T4DNALigase连接，将EIAV-DLA的cPPT和RRE序列插入到载体中。用Notl单酶切载体,并用碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化,将同样酶切处理后的以土拨鼠肝炎病毒(由武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院杨东亮教授惠赠)为模板扩增(引物为1082U30:5，-CTGGCGGCCGCAATCAACCTCTGGATTACA—3，和1709L30:5，-CGCGCGGCCGCACAGGTGAAGACCAAGCAA-3'，扩增条件为94。C预变性5min，然后进入循环94°Clmin，70°Clmin，共35个循环；最后72。C延伸10min)的WPRE用T4DNALigase连接插入其中。利用SacII酶酶切筛选WPRE正向插入的重组质粒载体，获得pcP:PTWCAG。试验例1基因转移载体pcPPTWCAG报告基因表达水平的鉴定将实施例1所构建的EIAV基因转移载体pcPPTWCAG分别转染细胞HEK293(购自中国协和医科大学基础医学院)和DF-1(购自美国ATCC公司)。用胰酶溶液分散HEK293细胞和DF-1细胞，分别接种于24孔细胞培养板，每孔1Xl()5个细胞。培养液为含10%优级胎牛血清(购自TBD公司)和青、链霉素的DMEM培养基(购自GIBCO公司)，37。C培养箱中5%C02通气培养。待细胞单层长至60%，参照磷酸药转染试剂盒(购自Invitrogen公司)说明书进行转染。转染前3h更换新鲜培养液。在EP管中加入5ygDM和9uLCaCl2溶液，补充灭菌去离子水至75uL，缓慢滴加入轻旋着的75uL2X:HBS缓冲液，轻轻混匀，室温静置30min。缓慢等量分装入细胞孔，设3个重复。10h后用无菌PBS(0.Olmol/L,pH7.4)洗涤细胞2次，更换新鲜培养液，每孔lmL，继续培养。设正常细胞对照。转染后48h收获细胞，利用BECK應CoulterCytomicsFC500流式细胞仪，通过FS和SS设门，计数2X1048个细胞，计算阳性细胞所占的百分数，以正常细胞设定空白对照。结果显示HEK293细胞中阳性细胞百分率为41.7%，DF-1细胞中阳性细胞比率为11.4%(图2)。序列表〈110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所〈120〉慢病毒基因转移载体、其制备;，法和应用〈130>P20070426〈160>1〈17()>:PatentI:nversion3.1〈210>1〈211>502〈212〉DNA〈213〉Artificial〈400>1ggggt￡lCC￡lCt￡lgtt￡ltt￡l￡lt￡lgt￡l￡ltC￡l￡lttacggggtcattagttcatagcccatata60tggagttccgcgttecateacttecggt股iatggcccgcctggctgaccgCCC&l&lCg&lCC120cccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagta_a_cgcca_a_ta_gggactttcc180at.t.gacgt.caat.gggt.ggagtet.t.tecggt.aaact.gcccact.t.ggcagt.acat.caagt.gt.240atcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcatt300a;tgcccagtaca;tgaccttatgggactttcctacttggcagtaca;tctacgta;ttagtca360tcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccc420cctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcg;atggggg■cgggagtcgctgcggteccat￡l5029权利要求一种源于马传染性贫血病毒(EIAV)的缺陷型慢病毒基因转移载体，该慢病毒基因转移载体以中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株基因为主要骨架，包含有启动子序列、多克隆位点、完整的EIAV3’LTR序列、抗性基因、poly(A)信号、cis作用序列元件等真核表达载体所必需的序列，其特征在于所述的缺陷型慢病毒基因转移载体含有2个启动子序列，分别是CMV/R/U5启动子序列和CMVIE/鸡β-actin启动子序列；其中，CMVIE/鸡β-actin启动子序列用于启动报告基因的表达；所述的CMV/R/U5启动子序列是将人巨细胞病毒的立即早期启动子/增强子替换中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株基因5’LTR-U3区，使CMVIE与R和U5区串连而得；所述的多克隆位点位于CMVIE/鸡β-actin启动子序列的上游和/或下游。2.按照权利要求1的缺陷型慢病毒基因转移载体，其特征在于含有土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE。3.按照权利要求1的缺陷型慢病毒基因转移载体，其特征在于在CMV/R/U5启动子序列和CMVIE/鸡|3-actin启动子序列之间含有EIAV非翻译区UTR的引导区序列、gag基因编码区的前334bp序列和EIAV的中央聚嘌呤序列cPPT和Rev反应元件RRE;其中，中央聚嘌呤序列cPPT和EIAV的Rev反应元件RRE序列位于CMVIE/鸡P-actin启动子序列的....匕游；gag基因编码区的前334bp序列位于中央聚嘌呤序列cPPT和EIAV的Rev反应元件RRE序列上游；非翻译区UTR的引导区序列位于CMV/R/U5启动子序列和gag基因编码区的前334bp序列之间。4.按照权利要求1的缺陷型慢病毒基因转移载体，其特征在于erw和pol基因区缺失。5.按照权利要求1的缺陷型慢病毒基因转移载体，其特征在于所述的报告基因是增强绿色荧光蛋白基因；所述的抗性基因是氨苄抗性基因。6.—种源于马传染性贫血病毒的缺陷型慢病毒基因转移载体pcPPTWCAG，其结构图为图l所示。7.按照权利要求6的缺陷型慢病毒基因转移载体pcPPTWCAG，包含CMV/R/U5启动子序列，CMVIE/鸡P-actin启动子CAGp序列，EIAV非翻译区UTR的引导区序列，gag基因编码区的前334bp序列，中央聚嘌呤序列cPPT和EIAV的Rev反应元件RRE，增强绿色荧光蛋白基因，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，氨苄抗性基因，poly(A)信号序列和完整的E]:AV3'LTR;其中，CMVIE/鸡P-actin启动子序列启动报告基因的表达；所述的CMV/R/U5启动子序列是将人巨细胞病毒的立即早期启动子Z增强子替换中国EIAV驴白细胞弱毒疫苗株基因5'LTR-U3区，使CMVIE与R和U5区串连而得；所述的多克隆位点位于CMVIE/鸡|3-actin启动子序列的上游和./或下游。8.—种构建权利要求7缺陷型慢病毒基因转移载体pcPPTWCAG的方法，包括(l)在含有Amp抗性基因AmpK的pCI真核表达载体上插入EIAV完整的3'LTR、5'LTR-R和U5区，并用人巨细胞病毒的立即早期启动子/增强子替换5'LTR-U3区，使之与R和U5区串连得到CMV/R/U5启动子；(2)保留5'LT:R与gag基因编码区之间非翻译区UTR的引导区序列和gag基因编码区前334bp序列；(3)插入报告基因及多克隆位点；(4)在多克隆位点中插入CMVIE/鸡e-act.in启动子，并在该启动子上游加入中央聚嘌呤序列cPPT和EIAV的Rev反应元件RRE，在3'LTR和EGFP之间插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE。9.含有权利要求卜8任何一项的慢病毒基因转移载体的宿主细胞或病毒颗粒。10.权利要求卜8任何--项的慢病毒基因转移载体在表达外源基因中的应用，包括将外源基因插入到慢病毒基因转移载体的多克隆位点中；导入到真核细胞或病毒中，诱导外源基因表达。全文摘要本发明公开了一种马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体、其构建方法及其用途。本发明载体包含CMV/R/U5启动子、5’非翻译区引导序列、部分5’gag基因编码区序列、中央聚嘌呤序列和EIAV的Rev反应元件、CMVIE/鸡β-actin启动子、报告基因、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件、多克隆位点、EIAV3’LTR之前的poly(A)信号、完整的3’LTR以及真核表达载体的部分序列。本发明载体具有慢病毒载体的共有优点，缺少所有野生型病毒辅助基因，并可以携带一个或多个选定基因以传送给靶细胞，能够插入大片段的目标DNA序列，能够使外源基因和报告基因在细胞中高水平的表达。文档编号C12N7/01GK101705246SQ20071009775公开日2010年5月12日申请日期2007年4月29日优先权日2007年4月29日发明者于海波,刘家森,司昌德,姜骞,孙成群,孟庆文,曲连东,童光志,韩凌霞申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所