专利名称：家蚕滞育品种的早期浸酸转基因方法
技术领域：
本发明涉及生物技术、生物工程领域，特别是涉及一种家蚕滞育品种的早期浸酸转基 因方法。
背景技术：
转基因技术是现代生物学研究中的一项重要的技术，在功能基因研究、生物新产品开 发、生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物。随着家蚕基因组测序工作的完成，利 用高效稳定的技术大规模地研究重要基因的功能成为家蚕功能基因组时代的重要课题，同 时，家蚕是理想的"昆虫工厂"，利用现代基因工程技术开发丝腺生物反应器具有巨大的 市场前景。而家蚕转基因技术是探索家蚕生长发育奥秘、拓展蚕业产业链、促进科技成果 实用化的有利武器。
自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家 蚕成功的消息。但是迄今为止的报道中，所有转基因实验都是利用家蚕多化性品系的非滞 育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在 适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制和转 基因后的进一步实验研究。但这些多化性家蚕品系与滞育性的生产上的家蚕实用品种比 较，具有丝量少，丝质差等经济性状差的特点。故利用多化性家蚕品种作为转基因的材料
具有以下两个方面的明显缺陷①多化性家蚕品种经济性状差，利用转基因所创造的附加
性状在产量和质量上都无法达到直接推广应用的标准，以多化性蚕种为原始材料的转基因 品系只能作为育种原始材料，作为某一相关优良性状的原始载体的角色运用于漫长而艰辛 的传统育种之中。②多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁 殖，这样需要浪费大量的人力和物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大 大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。因此，利用多化性家蚕品种不但不利于 进行大规模的转基因实验，而且很难使研究成果快速转化到生产实际中去。
家蚕滞育品种为一化或二化性品系，在产卵以后便进入一个比较漫长的滞育期，这样 极有利于它们维持和继代。另外生产上的实用家蚕品系几乎都是滞育品系，多为一化或二 化性品系。如利用普通的家蚕滞育品系进行转基因研究可以克服多化性家蚕品种转基因研 究中所述的第二个缺陷，而利用生产上的实用家蚕滞育品系原种进行转基因研究则可以克 服多化性家蚕品种转基因研究中所述的所有缺陷。因此，家蚕滞育品种的转基因研究具有 极为重要理论和实际意义。生产实际中，滞育卵一般在产卵后约16-20小时左右利用常规 的即时浸酸法能有效解除它们的滞育。而目前最有效的家蚕转基因显微注射时间是在产卵 后3-6小时，因为转基因操作后卵上会上留下注射小孔，如果在注射后利用常规的即时浸 酸法会导致盐酸渗入蚕卵内，从而致死，根本无法实现家蚕滞育品种的转基因研究。因此 家蚕滞育品种卵会发生滞育，给转基因操作带来很大的限制。
到目前为止，滞育性家蚕品种的转基因技术在国内外还未见报道，更没有一种成熟可 靠的方法实现家蚕滞育品种的转基因，因此，探索家蚕滞育品种的转基因的方法，是简化 家蚕转基因技术、加速科技成果实用化的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕滞育品种的转基因蚕的制作路线方法。该路线方法利 用在蚕卵胚胎发育至胚带形成之前的一定时间内，即产卵后2个半小时之前对家蚕滞育卵 进行盐酸的浸泡处理(本说明书称为早期浸酸法)，随后对处理解除滞育的蚕卵进行胚胎 显微注射，催青孵化获得的GO代家蚕的饲养至化蛾，它们的自交或回交产生G1代，通过 荧光标记筛选，从而有效制作转基因家蚕。
本发明首次建立了家蚕滞育品种胚胎早期浸酸法，并获得了早期浸酸解除滞育的最佳 条件，并将这项技术与家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物操作技术相结合，成 功地突破了家蚕滞育品种转基因技术的瓶颈，建立了一种可靠的家蚕滞育品种的转基因技 术路线方法。
本发明家蚕滞育品种的早期浸酸转基因方法，依次通过以下步骤实现
(1) 家蚕滞育品种进行常规饲养；
(2) 在25'C的种茧保护温度下收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25"C、弱光的条件下交配 4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔lh收集一次 蚕卵，并将收集的蚕卵置于25'C的环境中保护备用；
(3) 以蚕卵收集时间为起点开始记时，于收集后2hl5min-2h30min,将上述收集的蚕卵 连同蚕连纸片一并浸入46。C恒温、比重1. 075的HC1中处理lmin30s-3min30s，及时取出 在流水中漂洗至酸脱尽，解除滞育蚕品种的滞育；
(4) 将脱尽酸的蚕卵用镊子转移至用75%酒精消毒的载玻片上，并按照蚕卵腹面向右的 标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37%的甲醛蒸气中消毒5min;
(5)以收集的时间开始记时，于收集后3h-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度 400ng/ul的piggyBac质粒转座载体从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的 胶水封闭卵壳注射留下的小孔；
(6)将注射完成的蚕卵在35-37%的甲醛蒸气中消毒5min后置于25°C、相对湿度85% 以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，词养孵化出来的蚁蚕，将当代(GO)的蚕蛾进行 自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体；最后，获得的转基因个 体词养、传代，即完成家蚕滞育品种的转基因蚕的制作。
h表示小时，min表示分钟。
本发明的优点是
本发明关于家蚕滞育品种的转基因蚕的制作方法，首次通过获得早期浸酸解除滞育的 最佳条件后，采用早期浸酸解除需要注射蚕卵的滞育，最后参照多化性品系转基因家蚕显 微注射的制作方法，从而有效地突破了家蚕滞育品种转基因技术的瓶颈。本发明的优点是， 利用上述技术路线，可以有效地实现家蚕滞育品种转基因。而利用家蚕滞育品种创造的转 基因蚕品系，可以克服多化性品系转基因家蚕的所有缺点，其具有以下的明显优势①家 蚕滞育品种，尤其是生产上采用的实用性品种各种经济性状都比较良好，外源或内源的转 基因目标性状也非常优良，在利用这些家蚕品种作为生物反应器时，其目的产物的产量与
质量远远超过多化性品系的转基因家蚕；②现今蚕业生产中所采用的蚕品种多为滞育性的
一化或二化性品种，在利用转基因技术创造新的遗传素材或品种资源时，直接采用生产中 普遍使用的实用性家蚕滞育品种作为原始材料，可以避免漫长而烦琐的育种过程，直接利 用转基因技术创造出各种性状优良的新的特殊家蚕品种，大大的缩短了育种的周期，也节
约了大量的人力和物力；③滞育性家蚕在自然条件下一年繁殖一个或两个世代以后便自动 进入一个漫长的滞育期，要保存其品种资源只需要在一年内进行一次或两次的饲养和简单 的蚕种管理即可，对其生产和管理可以根据计划的需要人为地进行调节，而且实用性家蚕 品种的各项性状通过长期育种的选择，都比较稳定，所以利用这些家蚕滞育品种作为家蚕 转基因研究的材料，可以简化资源保存的工作、降低品种资源丢失的风险、增强转基因工 作的计划性、使转基因工作与实际生产更加紧密地结合。
具体实施例方式
实施例1:
利用家蚕滞育品种"碧波"作为原始材料，将正常饲养并按前述方法交配、收集处理
所得的蚕卵，于产下后2h30min在液温46。C、比重1. 075的HC1中处理2min30s，用自来
水漂洗干净后，于产下后3h用E卯endorf显微注射仪将带有神经和眼睛特异启动子启动 的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入通过早期浸酸法解除滞 育后的1518粒蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25。C、相对湿度85%的高湿度环境中催 青孵化，将孵化的70头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得42头G0代蚕蛾通过 自交或回交共获得23蛾圈Gl代蚕卵，用Olympu肿电动宏观荧光显微镜观察筛选并获得3 个阳性蛾圈，共获得18头家蚕滞育品种"碧波"的转基因蚕，转化效率为13.04%。
实施例2:
利用家蚕滞育品种"秋白"作为原始材料，将正常词养并按前述方法交配、收集处理 所得的蚕卵，于产下后2h20min在液温46。C、比重1. 075的HC1中处理3min30s,用自来 水漂洗干净后，于产下后5h用Eppendorf显微注射仪将带有神经和眼睛特异启动子启动 的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入通过早期浸酸法解除滞 育后的2008粒蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25'C、相对湿度90%的高湿度环境中催 青孵化，将孵化的109头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得72头G0代蚕蛾通 过自交或回交共获得34蛾圈G1代蚕卵，用Olympu-电动宏观荧光显微镜观察筛选并获 得4个阳性蛾圈，共获得26头家蚕滞育品种"秋白"的转基因蚕，转化效率为11.76%。
实施例3:
利用家蚕滞育品种"大造"作为原始材料，将正常饲养并按前述方法交配、收集处理 所得的蚕卵，于产下后2hl5rain在液温46'C、比重1. 075的HC1中处理lmin30s，用自来 水漂洗干净后，于产下后6h用Eppendorf显微注射仪将带有神经和眼睛特异启动子启动 的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入通过早期浸酸法解除滞 育后的1623粒蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25。C、相对湿度95%的高湿度环境中催 青孵化，将孵化的212头G0代蚁蚕用人工词料收集饲养至化蛾，获得153头G0代蚕蛾通 过自交或回交共获得71蛾圈G1代蚕卵，用01ympu^电动宏观荧光显微镜观察筛选并获 得li个阳性蛾圈，共获得57头家蚕滞育品种"大造"的转基因蚕，转化效率为19.29%。
实施例4:
利用家蚕滞育品种"洞庭"作为原始材料，将正常饲养并按前述方法交配、收集处理 所得的蚕卵，于产下后2h25min在液温46。C、比重1. 075的HC1中处理lmin30s，用自来 水漂洗干净后，于产下后4h用E卯endorf显微注射仪将带有神经和眼睛特异启动子启动 的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入通过早期浸酸法解除滞 育后的1580粒蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25'C、相对湿度90%的高湿度环境中催
青孵化，将孵化的86头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得68头G0代蚕蛾通过 自交或回交共获得36蛾圈Gl代蚕卵，用0^1!^113@电动宏观荧光显微镜观察筛选并获得4 个阳性蛾圈，共获得32头家蚕滞育品种"大造"的转基因蚕，转化效率为11.11%。
权利要求
1、一种家蚕滞育品种的早期浸酸转基因方法，其特征在于依次通过以下步骤实现(1)家蚕滞育品种进行常规饲养；(2)在25℃的种茧保护温度下收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护备用；(3)以蚕卵收集时间为起点开始记时，于收集后2h15min-2h30min，将上述收集的蚕卵连同蚕连纸片一并浸入46℃恒温、比重1.075的HCl中处理1min30s-3min30s，及时取出在流水中漂洗至酸脱尽，解除滞育蚕品种的滞育；(4)将脱尽酸的蚕卵用镊子转移至用75％酒精消毒的载玻片上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min；(5)以收集的时间开始记时，于收集后3h-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/ul的piggyBac质粒转座载体从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔；(6)将注射完成的蚕卵在35-37％的甲醛蒸气中消毒5min后置于25℃、相对湿度85％以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体；最后，获得的转基因个体饲养、传代，即完成家蚕滞育品种的转基因蚕的制作。h表示小时，min表示分钟。
全文摘要
一种家蚕滞育品种的早期浸酸转基因方法，利用在蚕卵胚胎发育至胚带形成之前的一定时间内，即产卵后2个半小时之前对家蚕滞育卵进行盐酸的浸泡处理，随后对处理解除滞育的蚕卵进行胚胎显微注射，催青孵化获得的G0代家蚕的饲养至化蛾，它们的自交或回交产生G1代，通过荧光标记筛选，从而有效制作转基因家蚕。该方法直接采用生产中普遍使用的实用性家蚕滞育品种作为原始材料，可以避免漫长而烦琐的育种过程，直接利用转基因技术创造出各种性状优良的新的特殊家蚕品种，可大大缩短育种的周期，节约大量的人力和物力。
文档编号C12N15/85GK101195834SQ20071030390
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者向仲怀, 夏庆友, 徐汉福, 赵爱春, 成 鲁 申请人:西南大学;重庆拓桑生物科技有限公司