专利名称：一种温度两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶的方法
一种温度两阶段控制策略发酵生产i^o/am》W角质酶的方法技术领域一种温度两阶段控制策略发酵生产i^o/flm》/w'角质酶的方法，涉及环境因 素(温度、pH)分阶段控制策略在发酵过程优化中的应用技术领域。
技术背景角质酶(Qitinase)是一种多功能酶，属丝氨酸酯酶的一种，相对分子质量 约为22 30kD，是一种具有称作cc/々水解酶折叠的共同结构框架的蛋白质，既 可水解不溶性多聚体角质，也可以作用于其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘 油三酯和可溶性的合成酯等。除了水解反应外，角质酶还能参与酯化、转酯化 等反应。因此其在纺织业、食品工业以及生物催化、化工工业等诸多领域有着 广泛的应用前景，特别是在纺织工业的应用是近几年开发的新领域，它是继碱 性果胶酶之后的另一种主要新型纺织品清洁生产的酶制剂。其同样可以作为棉 织物生物精练处理过程中重要的酶制剂，其研制及在棉针织物精练中的应用， 使另一种全新温和的绿色精练方式成为可能。角质酶在生物精练处理过程中， 能有效分解棉纤维表面疏水性的角质和腊酯，使疏水性物质从棉纤维表面脱落， 从而达到精练效果，而纤维本身不受到损伤，如果角质酶和碱性果胶酶混合使 用处理棉纤维则效果更佳。因此，经生物精练的棉纤维能最大程度的保持纤维 强度，失重小，织物手感柔软厚实，且富有弹性，并且克服了传统碱精练过程 中棉纤维损失较大，强度损伤严重及环境污染严重等缺点。角质酶虽然有很广泛的应用前景，但国内外迄今为止并没有工业化生产角 质酶的成功实例，角质酶市场仍处于空白。本实验室通过基因手段构建的产 i^o/"w/ p/w'角质酶工程菌是以作为宿主，此菌种表达量较高， 通过在摇瓶发酵条件优化以及在3 L发酵罐上发酵条件的优化，确定了发酵工 艺，为实现工业化生产奠定基础并且填补国际角质酶工业化生产空白，同时带 来极高经济价值。 发明内容本发明的目的是提供一种利用基于pH分阶段控制的温度两阶段控制策略 发酵生产i^o/am》W角质酶的方法，本发明的优点在于工艺简单易行，能有效 地提高角质酶的产量及生产强度。本发明的技术方案菌种重组芽孢杆菌(Bac77/w swto'fe ) WSHB 06-07为出发菌株，该菌株 已在中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2008， 28 (5): 59 64公开。菌体保持培养基(g/L):蛋白胨IO，酵母膏5，氯化钠10，甘油50%(v/v)。种子培养基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨12，酵母膏24，磷酸氢二钠12.54， 磷酸二氢钾2.31， pH7.5。发酵培养基(g/L):蔗糖32.5，蛋白胨37，酵母膏24，磷酸氢二钠12.54， 磷酸二氢钾2.31,七水硫酸镁4.4， pH7.5。培养方法将保藏好的菌种接入种子培养基中，500mL三角瓶装50mL培 养基，回转式摇床转速200r/min， 37°C，培养14-16 h。将培养好的种子以4% 接种量接入到3 L全自动发酵罐KBT(KoBio Tech Co., Ltd.,韩国)中，装液量1 L; 两阶段控制策略发酵生产i^/am';^'角质酶:菌体生长阶段:控制温度为3°C、 pH7.5、搅拌转速600 r/min、通气量为1.5 wm直到菌体OD6oo达到12.65;高 效表达阶段当菌体OD6。。达到12.65，菌体生长进入对数生长期后，将发酵温 度降到3(TC、 pH6.5、搅拌转速600 r/min、通气量为1.5vvm，直到发酵结束。角质酶活性测定取稀释适当倍数的样品900 ^L，加入100nL2mol/L的 NaOH溶液，混匀后于沸水浴中反应10min，立即用流动冷水冷却至室温，再向 其中加入lmL间苯二酚和3 mL 10 mol/L的HC1，混匀后于沸水浴中反应8 min， 立即用流动冷水冷却至室温，然后用分光光度计测定其500nm处的吸光度。本发明的有益效果利用本发明能大幅提高角质酶的产量及生产强度，产 量由170U/mL提高到312U/mL,生产强度由11.74 U/mL/h提高到13.2U/mL/h， 并能够减少发酵液中杂蛋白的含量，提高了产品纯度和下游提取时的效率，并 且减少了能耗，有利于工业化大规模生产，弥补了角质酶工业化生产的空白， 推动了角质酶在棉纺织业的应用，从而促进纺织工业的发展。本发明采用基于pH分阶段控制策略的温度两阶段控制策略在3 L罐上发酵 达到先进水平，并且对其它的重组菌的发酵具有一定的指导意义。
具体实施方式
实施例1:本发明所采用的菌株为重组芽孢杆菌(5ad//^ w6ft'to) WSHB 06-07，在菌体生长阶段控制pH7.5、温度37。C，搅拌转速600r/min、通气量为 1.5vvm;当菌体OD6oo达到12.65时，将pH调至7.5和温度调至30 °C、搅拌转 速600r/min、通气量为1.5wm直到发酵结束，角质酶产量为312 U/mL，生产强 度为13.2U/mL/h。对照实施例2:发酵过程中恒定温度为37""C，恒定搅拌转速600r/min、通气 量为1.5wm，菌体生长时控制pH7.5，当菌体006()()达到12.65时，将pH调至 6.5直到发酵结束，角质酶产量170U/mL，生产强度为11.74 U/mL/h。对照实施例3:发酵过程中恒定温度为3(TC，恒定搅拌转速600r/min、通气 量为1.5wm，菌体生长时控制pH7.5，当菌体006()。达到12.65时，将pH调至 6.5直到发酵结束，角质酶产量243.12 U/mL,生产强度为9.35 U/mL/h。
权利要求
1、一种温度两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶的方法，其特征是采用分泌性表达载体重组芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSHB 06-07为出发菌株，两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶(1)菌体生长阶段控制温度为37℃、pH 7.5、搅拌转速600r/min、通气量为1.5vvm，直到菌体OD600达到12.65；(2)高效表达阶段当菌体OD600达到12.65，菌体生长进入对数生长期后，将发酵温度降到30℃、pH 6.5、搅拌转速600r/min、通气量为1.5vvm，直到发酵结束。
全文摘要
一种温度两阶段控制策略发酵生产F.solani pisi角质酶的方法，属于环境因素分阶段控制策略在发酵过程优化中的应用技术领域。本发明采用分泌性表达载体重组芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WSHB 06-07为出发菌株，在菌体生长阶段控制温度37℃和pH为7.5，当菌体的OD<sub>600</sub>达到12.65时，将温度调至30℃和pH调至6.5直到发酵结束。采用此策略进行发酵，最终实现了提高角质酶产量和生产强度的目的。本发明的优点在于工艺简单易行，能有效地提高角质酶的产量及生产强度，并能够减少发酵液中杂蛋白的含量，提高了产品纯度和下游提取时的效率，并且减少了能耗，有利于工业化大规模生产。
文档编号C12R1/125GK101323848SQ200810022620
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者敬 吴, 张芙华, 坚 陈 申请人:江南大学