专利名称：：一种猪免疫性状相关基因tap1及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种猪免疫性状相关基因TAP1及其制备方法，以及其突变位点检测方法和在建立适用于猪免疫性状的分子标记方面的应用。
背景技术：
：近10年以来，现代育种技术使猪的生产性能(生长，胴体与肉质性状)得到了显著的改良，而对猪健康及抵抗疾病能力的遗传改良却重视不够。随着分子遗传学的飞速发展，畜禽遗传图谱的不断完善，遗传标记的不断补充，使一些与疾病抗性有关的基因或遗传标记相继被发现。采用遗传学方法从遗传本质上提高畜禽的抗性，减少疾病的发生，对于控制疾病，提高养猪效益和安全养殖具有标本兼治的重要意义。个体免疫力是衡量动物健康的重要指标(Knapp等，2000)，它属于数量性状，其中涉及相关基因较多，分子机制很复杂。免疫力与生产性能通常表现为表型负相关关系，这为育种工作者提出了一个大的难题，即如何在保持和提高生产性能的基础上同时提高个体免疫能力是育种工作者研究的新课题。最近国外少量研究表明猪免疫能力与生产性能的关系是双向的，某种情况下即正常状态免疫能力的增强能提高猪的生长速度，饲料效率等主要生产性能，而单纯针对生产性能的选择却导致猪免疫能力下降即相关等位基因的丢失或频率的降低。但是，目前二者的相互关系仍然不是很明了，从基因组水平揭示出生产性能和免疫力的控制基因体系间的具体关系，是解决上述难题的有效途径。在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。肠毒素型大肠杆菌(￡>zferato:dgemV:co//,￡7^0是引起仔猪泻痢的主要病原体之一(施启顺，2001)，研究表明动物体内如果缺乏大肠杆菌K88受体或F18受体，就会对相应的血清型大肠杆菌引起的腹泻产生抗性，目前编码大肠杆菌K88受体(K88abR和K88acR)的基因已经定位在猪13号染色体上靠近转铁蛋白基因的位置(Edfors-Lilja等，1997)，a-(1，2)-海藻糖转移酶1(a(1，2)^/ms7^ra似/era^,Ft/77)基因是F18受体(ECF18R)的候选基因，位于猪6号染色体上(Meijerink等，1997)。此外，猪第7号染色体着丝粒附近的主要组织相容性复合体(A^y'or/H'Jtoco呼a/z》z7z'/ycompfec，MHC)基因已经被证明与抗体对多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关(Pedman等，1996)，其它与抗病力有关的基因还有MX1(AfyjcoWms(7w/7M,"ms/加"cg1，禾占液病毒(流感)抗性因子1)、NRAMP1(iVifl似raZms7'加w"-asvocz-她Jmacro/7/wzge/ra的V21，与巨噬细胞有关的天然抗性蛋白1)，IL1(/WerZeMJb>wl，白细胞介素1)、PPARG(Perajdyome/ra断ratorflcft.va/^/gamma，过氧化物酶体增殖激活受体Y)等基因。Rothschild实验室长期从事MHC基因单倍型与猪初生重、断奶重、生长速度、背膘厚等性状有关等性状的研究，他们认为MHC基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(RothschildMF，1998)。内源性抗原通过MHC类分子提呈给细胞毒性T细胞(CTL)是机体细胞免疫识别的重要阶段。抗原处理相关转运体(/r^wpo"w似w"'flfejvWfA，TAP)负责抗原肽从胞浆到内质网的转运，在MHC类分子的抗原处理及提呈过程中发挥重要作用，TAP结构和功能障碍将导致细胞表面MHC类分子表达缺陷，这成为肿瘤细胞、病毒感染细胞逃逸免疫监视的重要机制。人的TAP基因是于1985年首次发现的，TAP是由TAP1与TAP2亚单位以异二聚体的形式发挥生物学效应，在MHC-I类分子介导的抗原递呈途径中起着重要作用(Colonnaetal.,1992)。因此，TAP的异常将严重影响抗原递呈，成为病毒感染及肿瘤细胞逃避免疫监视的重要机制，如卵巢癌、肝癌及宫颈癌(Vermeuleneta1.，2007)。另外，TAP蛋白在T淋巴细胞的活化和增殖过程中作用极大，在自身免疫性疾病的免疫损伤机制中占有重要地位。TAP1对内源性抗原片段的选择转运起主要作用，因而TAP1基因多态性与1型糖尿病的关联性是目前研究的热点(SiaandWeinem，2005)。Carcia-Borges等(2006)发现猪的TAP1基因存在一个可变剪接机，很有可能关系到机体能否抵御一些表达ICP47的病毒。Zhao等(2006)发现猪感染沙门氏杆菌48小时后，TAP1基因显著上升。对于其它病原的感染，也有类似的发现(JennerandYoung，2005)。但是到目前为止，仍没见到全面研究TAP1基因功能的报导。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因的外显子ni进行了多态研究和关联分析，为基因的应用提供技术基础。
发明内容本发明的目的是提供一种猪免疫性状相关基因TAP1。本发明的另一个目的是提供所述猪免疫性状相关基因TAP1的制备方法。本发明还有一个目的是通过对父母代及子代群体中进行TAP1基因的SNP检测，并在有免疫及生长记录的子代群体中做关联分析，找到与对综合抗病力影响很大的分子遗传标记，提出TAP1基因在抗性育种方面的应用。本发明通过以下技术方案实现提供一种猪免疫性状相关基因TAP1，所述基因的序列表如SEQIDNO:l所示，基因序列全长为790bp，包括部分外显子m。所述TAP1基因DNA序列中有1个G〉A碱基突变位点，所述碱基突变位点位于第652位置的碱基处，导致了BSP143I—RFLP多态性。所述的碱基突变位点是通过设计引物，应用PCR-RFLP方法检测得到。应用PCR-RFLP的方法检测猪TAP1基因外显子HI突变的多态性，并初步进行其基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析。本发明为猪的分子育种提供了一个新的分子标记。检测652G—652A碱基处碱基突变的正、反向引物序列如下所正向5，-TCGGAAATGTGGATAAGAGCA-3，反向5，-AAACAGACGGATAATGAAAGAGG-3，。本发明同时提供了所述猪免疫性状相关基因TAP1的制备方法，包括以下步骤(1)根据报道的mRNA序列(GenBankAccession:DQ227990)BLASTN分析找到对应的一猪基因组克隆序列(Accession:BX323833)。同源比较两种序列推测猪TAP1基因含有11个外显子，根据以上比对的结果，确认外显子大概的范围，并设计相关引物。正反向引物设计参照的模板为猪的BAC克隆序列BX323833，其克隆号为XX-554F3，引物序列分别是正向5，-TCGGAAATGTGGATAAGAGCA-3，，反向5，-AAACAGACGGATAATGAAAGAGG~3，o(2)进行PCR扩增。15uL的反应体系中加入DNA模板0.75uL，PCRReactionMix7.5uL，去离子水7.5uL，10mM引物前后各0.3uL，Taq酶0.15uL(2.5U/ul)。PCR反应条件为:94。C预变性5min后，94。C变性30s、56。C退火30s、72"C延伸50s，30个循环，最后72。C延伸5min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。所述猪免疫性状相关基因TAP1应用于进行基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析。依照本发明，所述的猪免疫性状相关基因TAP1可以应用在猪标记辅助选择中，为猪的分子育种提供了一个新的分子标记。本发明的有益效果是本发明提供了一种猪免疫性状相关基因TAP1，同时检测到其碱基突变位点，本发明可应用于为猪的标记辅助育种提供新的分子标记，应用本发明有望从遗传本质上提高畜禽的抗性，减少疾病的发生，对于控制疾病，提高养猪效益和安全养殖具有标本兼治的重要意义。图1本发明关联分析的流程示意图图2本发明中猪TAP1基因外显子III部分序列的扩增序列的电泳图谱图3本发明中猪TAP1基因测序G〉A突变图图4本发明中猪TAP1基因外显子III的PCR—RFLP的两种基因型(AB和BB)电泳图谱具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。实施例1猪免疫性状相关基因TAP1的制备具体的实验过程描述如下1.引物设计根据公开报道的mRNA序列(GenBankAccession:DQ227990)BLASTN分析找到对应的一猪基因组克隆序列，Accession:BX323833。同源比较两种序列推测猪TAP1基因含有11个外显子，根据以上比对的结果，确认外显子大概的范围，并设计相关引物。正反向引物设计参照的模板为猪的BAC克隆序列BX323833，克隆号为XX-554F3，引物序列分别是正向5，-TCGGAAATGTGGATAAGAGCA-3，，反向5，-AAACAGACGGATAATGAAAGAGG-3，。2.PCR-RFLP方法建立(1)引物序列正向5，-TCGGAAATGTGGATAAGAGCA-3，，反向5，-AAACAGACGGATAATGAAAGAGG"3，。该引物扩增片段长度790bp。(2)PCR扩增条件15uL的反应体系中加入DNA模板0.75uL，PCRReactionMix7.5uL，去离子水7.5uL，10mM引物前后各0.3uL，Taq酶0.15uL(2.5U/ul)。PCR反应条件为9(C预变性5min后，94。C变性30s、56i:退火30s、72。C延伸50s，30个循环，最后72。C延伸5min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖胶浓度为1%，见附图2所示本发明中猪tapi基因外显子m部分序列的扩增序列的电泳图谱，片段大小为790bp，图中M泳道DNA分子量标记(2000bpladder)。(3)RFLP检测以上述PCR产物6.5111、10xbuffei0.75^d、限制性内切酶BSP14310.25^1(10U/ul)混匀后离心，于37。C培养箱放置4h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照，结果见附图3，本发明中猪TAP1基因测序发现G〉A突变。实施例2标记性状关联分析实验程序如附图l所示，首先进行家系设计，本发明的实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪，父母代为17头公猪和36头母猪，子一代共306头仔猪，父母代及子代全部进行了基因型检测；子代免疫前后采集血样，进行免疫指标测定，父母代、子代基因组DNA抽提，进行标记基因的基因型检测；然后进行指标与基因型间的关联分析。子代在l、17、32日龄采集抗凝血和非抗凝血，用于血常规和抗体水平检测。所分析的性状主要是免疫性状。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析TAP1基因SNPs位点的基因型效应及其与免疫指标的关系其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；(3为固定效应参数向量，包括性别效应、胎次效应、生产线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；Y为所有随机效应参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS(Version8.1)软件中MIXEDMODELS程序进行数据处理与统计分析。实验效果1、猪TAP1基因不同带型基因型的验证以酶切带型不同个体的DNA为模板进行PCR扩增。将PCR产物纯化、克隆、后测序，测序结果显示其碱基序列与根据酶切带型所判断的结果一致，见附图4。2、PCR-RFLP诊断方法建立用引物扩增猪基因组DNA得到了790bp特异性扩增片段，序列分析结果表明在652nt处存在G>A突变，该基因座由两个等位基因控制，A是没有形成酶切位点的等位基因，B是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型其中AA型为未发生酶切的纯合型，只有790bp-DNA带；BB型为发生酶切的纯合型，651bp和139bp两条DNA带；AB为杂合型，790bp、651bp和139bp三条DNA带；但是在现有的群体中只检测到了AB型和BB型，见附图4。3、标记性状关联分析3.1猪tapi基因外显子ni多态性与免疫性状之间的关联分析对猪TAP1基因外显子ni多态性位点基因型检测结果表明在306个个体中AB基因型有31个，BB基因型有275个。所分析的免疫性状有:蓝耳病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项，分别对306头仔猪在1、17、32三个日龄进行检测。不同基因型之间性状显著差异的结果总结如下。表i:tapi基因外显子ni多态性位点基因型与1日龄部分免疫性状的关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>氺表示P〈0.05;衬表示PO.Ol由表1可知TAP1基因外显子III的SNP位点对1日龄的RBC分布宽度有显著影响(p<0.05)，此位点对其它免疫性状没有显著影响。对RBC分布宽度显著影响的TAP1基因外显子III中SNP位点基因型的最小二乘均数见表2:表2:SNP位点(TAP1)基因型RBC分布宽度的最小二乘均数<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表2可知，AB基因型的RBC分布宽度显著高于BB基因型(p<0.05)表3:TAP1基因外显子III多态性位点基因型与17日龄部分免疫性状的关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表3可知TAP1基因外显子III的SNP位点对17日龄的蓝耳抗体和淋巴细胞绝对值有显著影响(p<0.05)，此位点与其他免疫性状没有达到显著水平。对蓝耳抗体和淋巴细胞绝对值显著影响的TAP1基因外显子III中SNP位点基因型的最小二乘均数见表4:表4:SNP位点(TAP1)基因型蓝耳抗体和淋巴细胞绝对值的最小二乘均数<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表4可知，AB基因型的蓝耳抗体水平显著低于BB基因型(p<0.05)，而淋巴细胞绝对值显著高于BB基因型(p<0.05)。200810028459<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表6可知，从检测的标准差来看，各类指标的标准误较小，各次测定的准确性较好。三次测定的抗体水平及血常规指标比较，经T检验发现除伪狂犬抗体、红细胞压积、平均HGB量、平均HGB浓度、淋巴细胞等指标没有显著变化外，其他免疫指标相差都达到显著或极显著水平。测定值减少的有蓝耳抗体、猪瘟抗体、平均RBC体积、淋巴细胞等指标，测定值增加的有红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板、RBC分布宽度等指标，其它性状均表先为先减少后增加的趋势。对猪TAP1基因外显子m多态性位点基因型检测结果表明在306个个体中AB基因型有31个，BB基因型有275个。所分析的免疫性状有蓝耳病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项，分别对306头仔猪在1、17、32三个日龄进行。不同基因型之间性状显著差异的结果总结于表7:表7:TAP1基因外显子III多态性位点基因型与1日龄部分免疫<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>承表示PO.05;w表示PO.Ol由表7可知TAP1基因外显子III的SNP位点对1日龄的RBC分布宽度有显著影响(p<0.05)，此位点与其他免疫性状没有达到显著水平。对RBC分布宽度显著影响的TAP1基因外显子III中SNP位点基因型的最小二乘均数见表8:(p<0.05)表8SNPs位点(TAP1)基因型RBC分布宽度的最小二乘均数<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由表8可知，AB基因型的RBC分布宽度显著高于BB基因型。表9:TAP1基因外显子m多态性位点基因型与17日龄部分免疫性状的关联分析<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表9可知TAP1基因外显子m的SNP位点对17日龄的蓝耳抗体和淋巴细胞绝对值有显著影响(p<0.05)，此位点与其他免疫性状没有达到显著水平。对蓝耳抗体和淋巴细胞绝对值显著影响的TAP1基因外显子III中SNP位点基因型的最小二乘均数见表10:表10SNPs位点(TAP1)基因型蓝耳抗体和淋巴细胞绝对值的最小二乘均数<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表10可知，AB基因型的蓝耳抗体水平显著低于BB基因型(p<0.05)，而淋巴细胞绝对值显著高于BB基因型(pO.05)'SEQUENCELISTING<110〉华南农业大学<120〉一种猪免疫性状相关基因TAPl及其制备方法和应用<130><160〉1<170>Paterrtinversion3.2<210〉1<211>790<212>D跳<213>人工序列<400〉1tcgga犯tgtggMaagagcaagcccaccccgctcaggtccacttggtggagaggaaaga60gccctggactgggtgggagtcaggagtcctggactccsgtgctgctcaggtgttgcttca120ctggccacct.tgggcg站ctctttcctcctaccatcctgiggcttcttaattaaccctcta180aaggtctggtgaggecacaggattacgagttccccgggggcccattccagtgccgagagt240gtgcgctgtttetgeaggataatgggcaagggtgaagggaggatgggcgggaggtgeage300ctggttagagctgagctgettaggctgettagacttgetctttctgacccgcccatctct360cctctccctccccaggggagatggccattccgttctt.cacaggccggctcactgactgga420ttctacgagatggggc郷tgctgccttcacgcagaacctaactctcatgtccatcctca480teatagecaggtctgactgctgagcttggaaggctggggacgggggaccctgaa肌gggc540gC3gttgg肌gttggggccgccctccaaagtgcacttctacggggtccctgaccgaccgg600ccc"tccttctttgtctccctetagcteggtgctgg敏tcgtgtgcgacgggatct3taa660cagcaccatgggccgcgtgcacagccacctgcagggagaggtgtttcggtctgtcctgcg720cc犯ga犯cagagttttttc3gaaig犯1:ca犯caggtgl:cttatgaacctctttcattat780ccgtctgttt790权利要求1.一种猪免疫性状相关基因TAP1，其特征在于所述基因的序列表如SEQIDNO1所示。2、根据权利要求1所述猪免疫性状相关基因TAP1，其特征在于所述TAP1基因DNA序列中有1个G>A碱基突变位点，所述碱基突变位点位于第652位置的碱基处。3、根据权利要求2所述猪免疫性状相关基因TAP1，其特征在于所述的碱基突变位点是通过设计引物，应用PCR-RFLP方法检测得到。4、一种权利要求1或2所述猪免疫性状相关基因TAP1的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)根据GenBankAccession:DQ227990mRNA序列BLASTN分析找到对应的一猪基因组克隆序列Accession:BX323833，同源比较两种序列，以猪的BAC克隆序列BX323833为参照模板，设计正反向引物；(2)进行PCR扩增。5、根据权利要求4所述的猪免疫性状相关基因TAP1的制备方法，其特征在于步骤(1)所述正反向引物的序列为正向5，-TCGGAAATGTGGATAAGAGCA-3，，反向5，-AAACAGACGGATAATGAAAGAGG"3，。6、根据权利要求4所述的猪免疫性状相关基因TAP1的制备方法，其特征在于歩骤(2)所述PCR扩增条件为94i:预变性5min;94C变性30s、56。C退火30s、72。C延伸50s、30个循环；72。C延伸5min。7、一种权利要求1所述猪免疫性状相关基因TAP1的应用，其特征在于应用于进行基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析或猪标记遗传辅助选择。全文摘要本发明公开了一种猪免疫性状相关基因TAP1，基因的序列表如SEQIDNO1所示，并检测到一个影响猪免疫性状的碱基突变位点。本发明还公开了获得上述基因的方法；本发明提供的基因以及检测到的碱基突变位点的成果可应用于为猪的标记辅助育种提供新的分子标记，应用本发明有望从遗传本质上提高畜禽的抗性，减少疾病的发生，对于控制疾病，提高养猪效益和安全养殖具有标本兼治的重要意义。文档编号C12N15/10GK101285065SQ200810028459公开日2008年10月15日申请日期2008年6月2日优先权日2008年6月2日发明者吴珍芳,孙奴奴,陈慧勇申请人:华南农业大学