一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法

专利名称：一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法
技术领域：
本发明属制备固定化酶技术领域，具体涉及一种用磁性纳米颗粒固定p-葡萄糖苷酶的 制备方法。
技术背景纳米超微粒子通常指粒径在l 100nm的超微粒子，当物质的颗粒尺寸进入纳米量级 时，便具有了不寻常的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等，导 致了纳米材料独特的光、电、热、磁、力学和化学性质，使纳米材料在新型能源材料、生 态环境材料、高性能电子材料以及新型稀土材料等领域发挥着不可替代的作用。随着纳米 磁性材料在各个领域的广泛应用，作为一种重要的磁性材料一纳米Fe304的研究和开发己 经受到了普遍关注。纳米Fe304以其显著的磁效应、表面效应等，在磁流体、生物医药材 料、信息材料等领域具有广阔的应用前景。目前球磨法、沉淀法及水解法等方法的制备工 艺己经相对成熟，基本可以应用于产业化生产。卩-葡萄糖苷酶^03.2丄21)，也称纤维二糖酶，能够水解结合于非还原性末端的卩-D-葡萄糖苷键，同时释放出(3-D-葡萄糖和相应的配基。在食品工业中，(3-葡萄糖苷酶能增加 酒类和果汁产品中的风味物质含量及水解蔬菜食品中的主要色素一花色素苷；在饮料工业 中，能够水解释放茶叶饮料中糖苷类香气成分；在纤维素糖化过程中，P-葡萄糖苷酶能够 将纤维二糖和纤维寡糖水解生成葡萄糖。但是(3-葡萄糖苷酶价格昂贵，且使用寿命和贮存期短，因而在实际生产应用中受到限制。采用固定化技术将P-葡萄糖苷酶固定在载体上反 复使用，可以达到简化工艺、降低成本的目的。纳米Fe304具有生物降解性、无毒性、惰 性、抗菌性、对重金属的螯合作用、凝胶成型性质、亲水性以及对蛋白显著的亲和性等特 性，常用作固定化酶的载体。发明内容本发明解决的技术问题是提供了一种用磁性纳米颗粒固定P-葡萄糖苷酶的制备方法， 该方法快速简便、成本低，经磁性纳米颗粒固定化的(3-葡萄糖苷酶对温度、pH值和洗涤 剂表现出了较好的稳定性和活性。本发明的一种用磁性纳米颗粒固定(3-葡萄糖苷酶的制备方法，包括 (1)将0.1 lM的Fe"和Fe"的氯化物溶液以1: 2~2: 3的体积比混合后，用l-6M 的NaOH溶液在80-90°C ， pH 8 10下高速搅拌进行沉淀反应制得大小8 10nrn的Fe304颗粒；(2) 将1 2g壳聚糖溶解在100 200mL质量分数为10~30%的醋酸溶液中，形成了均 一透明的胶体溶液，再将制备的Fe304颗粒加入，搅拌20 30min，得到磁性纳米颗粒，用 蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用；(3) 将制得的磁性纳米颗粒加入到卩一葡萄糖苷酶溶液中，经戊二酸溶液吸附一交联 得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶；(4) 分别在0.1 0.5g固定化P-葡萄糖苷酶和游离P-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1 0.5M pH=3.0 9.0的缓冲溶液，2(TC 8(TC调温度后进行反应，每隔一周测定其酶活性。步骤(1)所述的Fe^和Fe^的氯化物溶液浓度为0.2~0.5M， NaOH溶液浓度为3 5M。 步骤(2)所述的醋酸溶液质量分数为15~25%。步骤(3)所述是采用体积分数为25%的戊二醛溶液将卩-葡萄糖苷酶溶液交联在磁性纳米颗粒上的。步骤(3)所述的(3-葡萄糖苷酶溶液的总酶活为5~10IU。步骤(4)所述的缓冲溶液是pH二4.0 8.0的柠檬酸缓冲溶液。步骤(4)所述的反应温度是3(TC 7(TC，反应时间为10 20分钟。步骤(4)所述的每隔一周测定其酶活性是指测定其残余酶活力，残余酶活力以初始酶活力的相对百分数表示。有益效果(1) 本发明操作简单快速，成本低，耗时较少；(2) 所得产品形状均一，比表面积大，酶活力回收率高；(3) 用磁性纳米颗粒固定的l3-葡萄糖苷酶能够反复利用，且酶活力回收率高。


图1为固定化(3-葡萄糖苷酶溶液反应温度曲线；图2为固定化P-葡萄糖苷酶溶液的储存稳定性曲线；图3为固定化P-葡萄糖苷酶溶液反应pH的曲线；图4为游离(3-葡萄糖苷酶溶液反应温度曲线；图5为游离P-葡萄糖苷酶溶液的储存稳定性曲线；图6为游离P-葡萄糖苷酶溶液反应pH的曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 实施例1(1) 将0.1MFe"和Fe^的氯化物溶液以h 2的比例混合后，用4M的NaOH在80°C pH=10.0下高速搅拌进行沉淀反应，然后将沉淀洗涤、过滤、干燥制得大小为8~10nm的 Fe304颗粒，在这种化学共沉淀法制备纳米Fe304粒子的过程中，由于所采用分散体系的化 学特性不同，将对磁性粒子的性能产生一定影响。(2) 将lg壳聚糖溶解在100mL质量分数为10%的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液。(3) 将上述制备的Fe304颗粒倒入壳聚糖溶液中，搅拌20min，用蒸馏水反复洗涤至 中性，烘千待用。(4) 称取上述制得的绝干磁性纳米颗粒0.1g，向其中加入lmL(3 —葡萄糖苷酶溶液和 25%的戊二醛溶液，于4'C、 150r/min下吸附10h得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶。(5) 分别在固定化P-葡萄糖苷酶溶液和游离P-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1M pH=5.0 的柠檬酸缓冲溶液0.9mL，分别在3(TC、 4CTC、 5(TC、 60。C和70。C下反应10分钟，并测 定酶的活力。实施例2(1) 将Feh和Fe^的氯化物溶液以1: 2的比例混合后，用过量的NaOH在一定温度 和pH值下高速搅拌进行沉淀反应，然后将沉淀洗涤、过滤、干燥制得大小为8 10nrn的 Fe304颗粒。(2) 将lg壳聚糖溶解在100mL质量分数为10%的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液。(3) 将上述制备的Fe304颗粒倒入壳聚糖溶液中，搅拌20min，用蒸馏水反复洗涤至 中性，烘干待用。(4) 分别在固定化(3-葡萄糖苷酶溶液和游离p-葡萄糖苷酶溶液中分别加入pH值为 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0的O.IM拧檬酸缓冲溶液，于45'C下反应10分钟，并测定酶的活 力。实施例3(1) 将F^+和F^+的氯化物溶液以1: 2的比例混合后，用过量的NaOH在一定温度 和pH值下高速搅拌进行沉淀反应，然后将沉淀洗涤、过滤、干燥制得大小为8~10nm的 Fe304颗粒。(2) 将lg壳聚糖溶解在lOOmL质量分数为10%的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液。(3) 将上述制备的Fe304颗粒倒入壳聚糖溶液中，搅拌20min，用蒸馏水反复洗涤至 中性，烘干待用。(4) 分别在固定化P-葡萄糖苷酶溶液和游离卩-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1M pH=5.0 的柠檬酸缓冲溶液，于45t:下反应10分钟，每隔一周测定其酶活性。实施例4以对硝基苯基-P-D-葡萄糖溶液为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体步骤如下游离酶活力的测定将P-葡萄糖苷酶溶解在0.1M拧檬酸缓冲溶液中，取0.1mL稀释 的酶液与0.9mL浓度为5mmol/L对硝基苯基-p-D-葡萄糖溶液混合后，于45'C下保温10min。 立即加入lmol/L的Na2C03溶液2mL终止反应，加入10mL的蒸馏水摇匀，在400nm下 测定吸光度。根据对硝基苯酚的标准曲线求得反应所生成的对硝基苯酚的量。以0.1mL蒸 馏水代替酶液作空白对照。固定酶活力的测定用O.lmL蒸馏水与O.lg固定化卩-葡萄糖苷酶的混合溶液代替在 游离酶活力测定中的O.lmL稀释的酶液，其余与上述步骤相同。固定化(3-葡萄糖苷酶和游离p-葡萄糖苷酶酶活测定结果见图1~6。
权利要求
1.一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括(1)将0.1～1M的Fe2+和Fe3+的氯化物溶液以1∶2～2∶3的体积比混合后，用1～6M的NaOH溶液在80-90℃，pH 8～10下高速搅拌进行沉淀反应制得大小8～10nm的Fe3O4颗粒；(2)将1～2g壳聚糖溶解在100～200mL质量分数为10～30％的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液，再将制备的Fe3O4颗粒加入，搅拌20～30min，得到磁性纳米颗粒，用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用；(3)将制得的磁性纳米颗粒加入到β-葡萄糖苷酶溶液中，经吸附—交联得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶；(4)分别在0.1～0.5g固定化β-葡萄糖苷酶和游离β-葡萄糖苷酶溶液中加入0.1～0.5MpH＝3.0～9.0的缓冲溶液，20℃～80℃调温度后进行反应，每隔一周测定其酶活性。
2. 根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定(3-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于 步骤(1)所述的Fe"和Fe"的氯化物溶液浓度为0.2-0.5M， NaOH溶液浓度为3~5M。
3. 根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定P-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于 步骤(2)所述的醋酸溶液质量分数为15~25%。
4. 根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定(3-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于 步骤(3)所述是采用体积分数为25%的戊二醛溶液将P-葡萄糖苷酶溶液交联在磁性纳米 颗粒上。
5. 根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定卩-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于 步骤(3)所述的P-葡萄糖苷酶溶液的总酶活为5~10IU。
6. 根据权利要求3所述的用磁性纳米颗粒固定(3-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于 步骤(4)所述的缓冲溶液是pH二4.0 8.0的柠檬酸缓冲溶液。
7. 根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定卩-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于 步骤(4)所述的反应温度是3(TC 70。C，反应时间为10 20分钟。
8. 根据权利要求1所述的用磁性纳米颗粒固定卩-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于 步骤(4)所述的每隔一周测定其酶活性是指测定其残余酶活力，残余酶活力以初始酶活 力的相对百分数表示。
全文摘要
本发明涉及一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括(1)利用Fe²⁺和Fe³⁺的氯化物溶液和NaOH溶液进行沉淀反应，制得Fe₃O₄颗粒；(2)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中形成均一透明的胶体溶液，再与Fe₃O₄颗粒混合搅拌，得到磁性纳米颗粒；(3)将磁性纳米颗粒加入到β-葡萄糖苷酶溶液中，经戊二醛溶液吸附-交联得到壳聚磁性纳米颗粒固定化酶；(4)分别在固定化β-葡萄糖苷酶和游离β-葡萄糖苷酶溶液中加入柠檬酸缓冲溶液，调温度后进行反应，测定其酶活性。该方法快速、简便、廉价，所得产品具有形状均一、比表面积大及酶活力回收率高等特点。
文档编号C12N11/00GK101270352SQ200810035950
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月11日 优先权日2008年4月11日
发明者周毓婷, 朱利民, 聂华丽, 勇 薛 申请人:东华大学