专利名称：：一种人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于遗传工程
技术领域：
，具体地说涉及一种人重组角蛋白19的抗原活性片段表达载体，以及利用该重组载体进行抗原表达的方法。二
背景技术：
：角蛋白是细胞体的中间丝，具有中心性高度保守的a-螺旋杆状区域以及高度变异的氨基和羧基末端区域分布在周围。角蛋白的DNA序列研究表明，角蛋白多肽是基因转录的产物，而不是蛋白水解片段。根据角蛋白相对分子质量及等电位点，用二维电泳可将人类上皮细胞角蛋白分离出20个条带，分别命名为CKl-20,其pl值为5.27.8,分子质量为4000060OOO,这些角蛋白分两型I型具有酸性等电点，分子质量从4000056500不等;II型具有中性或碱性等电点，分子质量从5200067000不等。细胞角蛋白是由I型和II型角蛋白组成的异聚合体。所有的细胞角蛋白都有一个共同的分子结构，它是组成不同类型复合物和细丝的基本单位。这些角蛋白遍及人类上皮细胞，正常人上皮组织主要表达CK5，6，8，14,15。角蛋白19(CK19)的相对分子质量为40000，是一种酸性多肽，是最早在鳞癌细胞中检测出来的分子量最小的角蛋白，CK19的cDNA序列由1349bp组成，包括一个1200bp的开放阅读框，起始于33位核苷酸，起始密码子为ATG，终止于1233位核苷酸。CK19的免疫组化研究表明，覆盖正常支气管树的单层上皮、肺泡表面及呼吸道上皮来源的肿瘤均有CK19表达，但不同组织学类型的癌细胞其CK19的表达强度不同，小细胞肺癌最弱、鳞癌最强、腺癌次之。CYFRA21-1是角蛋白19的可溶性片段，由于可用两种单克隆抗体KS19-1和BM19-21检测到，因而命名为CYFRA21-1。正常时CYFRA21-1以寡聚物形式存在，含量极低。当分布有CK19的细胞恶变时，可释放CYFRA21-1进入血液循环。过去10年中，大量的临床研究资料己充分证实，由KS19-1和BM19-21两株抗体针对定量检测血清中CYFRA21-1而配对组成测定方法，使得CYFRA21-1成为非小细胞肺癌患者最有价值的血清肿瘤标记物，对非小细胞肺癌的诊断、病情监视和疗效判断有较高的临床应用价值。在体外获得CK19抗原可以用作生产相应CK19抗体的免疫原或是体外诊断试剂盒的标准品。目前市面上出售的CK19抗原多为进口，因采用天然提取的方法获得(如Fitzgerald公司生产的来源于人源细胞株的CYFRA21-1)，故生产成本高，得率少，价格昂贵。平均每mg价格约为3000-5000元。而少数一些公司也有利用基因重组的方式在体外表达CK19抗原(如中资汉脉公司生产的编码CK191-401aa全长基因的CK19重组蛋白)，但是因错配率高通过普通PCR的方法得到编码CK19的全长基因比较困难；而且根据这段全长基因构建表达载体表达的重组蛋白抗原活性不高，达不到天然提取物的水平，并且稳定性差。因此有必要提供一种生产成本低、抗原活性高、稳定性又好的基因重组蛋白。
发明内容为了克服以上角蛋白19抗原产品的不足，本发明提供一种人重组角蛋白19抗原的活性片段表达载体及其制备方法，以及利用该表达载体制备该活性片段的方法。本发明的目的是这么实现的构建一种人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体，是克隆有序列表中核苷酸序列3的大肠杆菌表达载体，所述序列表中核苷酸序列3包含在编码角蛋白19的cDNA全长序列中，并且含有两个单抗BM19-21、KS19-1结合表位的编码序列；所述的大肠杆菌表达载体为pTrc-CKS。天然CK19的cDNA序列由1349bp组成，包括一个1200bp的开放阅读框。而Cyfm21-1为角蛋白19(CK19)的可溶性片段，其序列包含在CK19cDNA全序列中。Cyfm21-1结构含有亲水性的棒状体部和疏水性的头尾，抗体表位为氨基酸链QLADVRADSERQNQ及KAALEDTLAETEARFKS，两个抗体表位分别对应单抗BM19-21与单抗KS19-1。本发明从CK19cDNA全序列中选取所述的包含编码与两个单抗BM19-21、KS19-1结合的表位序列，是从编码角蛋白19cDM全序列开放阅读框起始密码子算起第251位氨基酸终止于第390位氨基酸，其氨基酸序列(序列表中序列4)和cDNA序列如下所述的表达载体为图1构建图中所示的pTrc-CKS-C《79-/。本发明还提供将所述的人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体转化入大肠杆菌菌株得到的重组菌株。所述大肠杆菌菌株为大肠杆菌TOP10菌株。本发明还提供一种表达重组角蛋白19抗原活性片段的方法，包括上述的重组大肠杆菌菌株，IPTG诱导表达角蛋白19抗原活性片段的步骤。所述的方法中还包括利用金属亲和柱层析分离纯化重组角蛋白19抗原活性片段的步骤。所述金属亲和柱层析为镍离子亲和柱层析。所述的重组角蛋白19抗原活性片段表达载体的构建过程优选例如下1)设计一对引物，以cDNA文库为模板(购自MegaMan公司)，PCR扩增得到目的基因片段(^:/9-/;2)扩增得到的目的基因片段0^9-7的5'端带有S,HI酶切位点、3'端带有&oRI酶切位点，全长420bp，将其克隆入pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)中；3)测序证明得到的基因序列与设计完全一致后，将重组质粒载体用ft/mHI和EcoRI限制性内切酶消化，与同样用限制性内切酶消化的pTrc-CKS载体(购自Invitrogen公司)连接；4)连接产物转化TOP10感受态细胞，用酶切的方法鉴定阳性克隆。其中TOP10菌株购自Invitrogen公司。本发明还提供所述的重组角蛋白19抗原活性片段的制备方法和鉴定方法，步骤如下1)将鉴定正确的阳性克隆在大肠杆菌TOP10菌株中实现表达，28'C低温诱导，目的蛋白大部分以可溶性的形式分泌，经超声破碎后上清用镍离子亲和层析柱(购自金思特公司的Ni-NTA)纯化，得到所需要的目的蛋白；2)得到的目的蛋白经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测，呈分子量约51KD的一条带，纯度大于90%。用ELISA的方法对其活性和稳定性进行检测，活性在加样量稀释到15ng的情况下，OD值仍能大于l.O，而且在37'C下放置5-7天OD值改变不大，可见稳定性较好。本发明构建的重组角蛋白19抗原活性片段表达载体所克隆的基因序列是一段从CK19cDNA全长序列中截取的核苷酸序列，这段核苷酸序列包含编码单抗BM19-21、KS19-1结合表位的序列。将其克隆至pTrc-CKS表达载体中，实现其高效可溶性表达，5产量可以达到15mg/L;对其活性和稳定性进行检测达到了可应用的水平。CK19在体外的高效表达，既改善了CK19的得率低、生产成本高以及稳定性差的缺点，又使得到的蛋白抗原特异性大幅度提高。四附图1重组CK19抗原基因C《79-7构建流程图；附图2(^^9-/基因的测序结果；附图3SDS-PAGE电泳图谱左图为诱导前后蛋白样品，右图为纯化后蛋白样品；附图4A、B、C三种抗原的活性比较图A为本发明得到的CK19-l抗原，B为购买的KRT19(中资汉脉公司，来源于CK19l-401aa全长重组蛋白)，C为购买的CYFRA21-1(Fitzgerald公司，来源于人源细胞株提取蛋白)。图中横坐标代表抗原加入量，单位(ng);纵坐标代表活性检测OD值，OD值越高，活性越强。五具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用的酶如无特虽说明均来自TaKaRa公司。实施例1、人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体pTrc-CKS-C^/9J的构建如图]所示，载体pTrc-CKS-C《7W的构建过程包括以下步骤一、CK19抗原活性片段编码基因CKW-7的克隆1.以从MegaMan公司购买的人源cDNA文库为模板，根据所要截取的核苷酸序列设计一对引物，这对引物序列如下弓1物1:5，ggatccgacatgcgaagccaatatg3'弓i物2:5，gaattcgtgatcttcctgtccctcg3'引物l序列在截取的CK19基因片段Oa^的5'端加上S函HI酶切位点，引物2序列在截取的CK19基因片段CiQ9-73'端加上￡coRI酶切位点。PCR操作严格按照标准操作规程进行，在5(^1的PCR体系中使用1^1的cDNA，以及1.25U的Taq聚合酶，1.25mMMgCl2，0.2mM的dNTP和各lOOpmol的引物1和2，剩余体积用无菌水补平。PCR反应的参数为94°C5分钟，循环过程的参数为94。C30秒，55°C45秒，72°C1分钟，共35个循环，最后延伸温度为72'CIO分钟。反应结束后，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到约420bp左右的条带。2.PCR产物用天根公司的凝胶回收试剂盒割胶回收，然后与pMD18-simple-Tvector(购自TaKaRa公司)连接，连接反应体系为10pl，其中SolutionI溶液5pl，Tvector0.5^1，6PCR产物4.5pl，4t:连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化操作按照分子克隆的相关操作进行，具体操作如下所述(1)感受态细胞的制备a.挑取大肠杆菌DH5a单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37°C，250rpm培养过夜。b.将过夜培养的菌液以l:100比例接入100mlLB液体培养基中，37。C',250rpm培养2-3hr，OD600达到0.4-0.6左右。c.培养液分装入预冷的50ml无菌的离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至O'C。d.4°C，5000rpm离心5min，到处培养液。e.沉淀用20ml冷却的CaCl2溶液重悬，冰上放置10min。f.4°C,5000rpm离心5min，倒出培养液。g.沉淀用2ml预冷的CaCl2溶液重悬，加等体积50%甘油混匀。h.分装后冻存于-8(TC冰箱中。(2)转化a.将100ijJDH5a感受态细胞加入连接体系中，混匀，冰上放置30min。b.放入42'C水浴中热击90s，立即取出放于冰上2min。c.加入200^1LB液体培养基，37°C，250rpm培养30-45min。d.取15(^1涂布LB固体培养及平板(含50昭/mi氨苄)，37。C倒置培养过夜。从平板上挑选多个阳性克隆用PCR鉴定，PCR结果显示带有目的基因片段的阳性克隆菌株送去测序(Iiwitrogen公司)。领"'序结果如附图2所示。测序结果表明扩增得到的基因序列与设计截取的DNA序列完全一致二、人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体pTrc-CKS-C/a仏/的构建将重组载体pMD18-T-CD9-/用BamHI和五coRI限制性内切酶消化，并将其克隆入同样用这两种限制性内切酶消化的表达载体pTrc-CKS(购自Iiwitrogen公司)中。连接产物转化入大肠杆菌TOPIO(购自Iiwitrogen公司)感受态细胞中，其中感受态细胞的制备与转化方法与DH5a感受态细胞的制备和转化方法相似。挑选阳性克隆，提取质粒后用限制性内切酶6awHI和￡CORI做酶切鉴定。鉴定结果正确的阳性克隆质粒即所要构建的人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体pTrc-CKS-CK/9-7。而将含有重组表达载体的重组菌株命名为pTrc-CKS-CK/9-//TOP10。实施例2、人重组角蛋白19抗原活性片段的诱导表达一、人重组角蛋白19抗原活性片段的小量诱导表达及鉴定培养基2XYT培养基(g/L):酵母浸出物10g，蛋白胨16g，NaC15g，含50吗/mlAmp。诱导剂lmMIPTG(异丙基-卩-D-硫代半乳糖苷)将重组菌株卩丁1"0(:^:8-^^"-//1010以1:100接种于5ml2XYT培养基中，37°C，250rpm培养3.5hr，取lml菌液用作空白样品，剩余菌液加入终浓度为lmMIPTG(异丙基-P-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，28°C，250rpm培养4hr。取诱导前后样品，7000rpm离心6min收集菌体。用1/10菌液体积的裂解缓冲液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，pH8.0)重悬菌体，重悬的菌液样品用SDS-PAGE检测，如附图3左图所示。二、人重组角蛋白19抗原活性片段的诱导表达将重组菌株pTrc-CKS-CX79-7/TOP10以1:100接种于5ml2XYT培养基中，过夜培养后转接入1000ml三角瓶中的200ml2XYT液体培养基中扩大培养。37°C，250rpm培养3hr，OD6oo达到0.6左右时加入终浓度为lmMIPTG(异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，28°C，250rpm培养4hr后7000rpm离心6min收集菌体。实施例3、人重组角蛋白19抗原活性片段的纯化一、表达产物的预处理菌体中加入裂解缓冲液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，pH8.0)超声破碎，破碎后溶液变澄清，14000rpm离心15min，取上清。二、表达产物的纯化上清过High-A伍nityNi-NTA(镍离子亲和柱，购自金思特科技有限公司)，上样后加入IO个柱体积的WashBuffer(50mMNaH2P04，300mMNaCl，10mMimidazole,pH8.0)洗杂蛋白，然后用ElutionBuffer(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mMimidazole,pH8.0)洗脱目的蛋白。实施例4、人重组角蛋白19抗原活性片段的鉴定一、浓度及纯度鉴定得到的蛋白样品取2吗经12%SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测，在51KD处有一条目的条带，用凝胶成像系统分析纯度大于90%。电泳图见附图3右图。用Bradford方法检测目的蛋白的浓度，浓度约为1.5mg/ml。8二、抗原性鉴定用ELISA检测目的蛋白的活性,采用双抗体夹心的方法，得到的结果如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>A为本发明得到的CK19抗原活性片段CK19-1，B为购买的KRT19(中资汉脉公司，来源于CK19l-401aa全长重组蛋白)，C为购买的CYFRA21-1(Fitzgerald公司，来源于人源细胞株提取蛋白)。柱状图比较见附图4。从ELISA的结果可以看出，本发明得到的CK19抗原活性片段CK19-1在大于15ng时，0D值就可以大于1，而且线性符合率也较好，所以其活性和灵敏度都要比天然提取的CK19抗原以及全长基因编码的CK19重组抗原好纟多。三、稳定性鉴定用ELISA双抗体夹心的方法检测抗原的稳定性。进行加速试验证明，37'C放置5-7天，抗原均能保持基本不变的活性，实验结果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明构建的重组pTrc-CKS-a79-7/T0P10表达工程菌可以高效表达含有与单抗BM19-21、KS19-1表位相匹配的CK19抗原，且得率较高并且纯度和活性都较进口天然提取的CK19抗原和CK19全长基因编码的重组抗原好，所以有很好的实际应用价值和经济效益。序列表〈110〉上海裕隆生物科技有限公司〈120〉一种人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体及其应用〈160〉4<210>1<211>25<212〉DM〈213〉人工序列〈220><223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作编码含有单抗BM19-21、KS19-1结合表位的序列的DNA引物，命名为上游引物1。<400〉1ggatccgacatgcgaagccaatatg25<210>2〈211〉25<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作编码含有单抗BM19-21、KS19-1结合表位的序列的DNA引物，命名为下游引物2。<400>2gaattcgtgatcttcctgtccctcg25〈210>3〈211〉420<212>DNA<213>人属(Homo)<400>3gacatgcgaagccaatatgaggtcatggccgagcagaaccggaaggatgctgaagcctgg60ttcaccagccggactgaagaattgaaccgggaggtcgctggccacacggagcagctccag120atgagcaggtccgaggttactgacctgcggcgcacccttcagggtcttgagattgagctgicagtcacagctgagcatgaaagctgccttggaagacacactggcagaaacggaggcgcgc240tttggagcccagctggcgcatatccaggcgctgatcagcggtattgaagcccagctgggc300gatgtgcgagctgatagtgagcggcagaatc鄉agtaccagcggctcatggacatcaag360tcgcggctggagcaggagattgccacctaccgcagcctgctcgagggacaggaagatcac420<210〉4〈211〉140〈212〉PRT<213>人属(Homo)<400〉4AspMetArgSerGinTryGluValMetAlaGluGinAsnArgLys151015AspAlaGluAlaTrpPheThrSerArgThrGluGluLeuAsnArg202530GluValAlaGlyHisThrGluGinLeuGinMetSerArgSerGlu354045ValThrAspLeuArgArgThrLeuGinGlyLeuGlulieGluLeu505560GinSerGinLeuSerMetLysAlaAlaLeuGluAspThrLeuAla657075GluThrGluAlaArgPheGlyAlaGinLeuAlaHislieGinAla808590LeuHeSerGlyHeGluAlaGinLeuGlyAspValArgAlaAsp95100105SerGluArgGinAsnGinGluTyrGinArgLeuMetAsplieLys110115120SerArgLeuGluGinGlulieAlaThrTyrArgSerLeuLeuGlu125130135GlyGinGluAspHis1401权利要求1.一种人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体，是克隆有序列表中核苷酸序列3的大肠杆菌表达载体，所述序列表中核苷酸序列3包含在编码角蛋白19的cDNA全长序列中，并且含有两个单抗BM19-21、KS19-1结合表位的编码序列；所述的大肠杆菌表达载体为pTrc-CKS。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述的包含编码与两个单抗BM19-21、KS19-1结合的表位序列，是从编码角蛋白19cDNA全序列开放阅读框起始密码子算起第251位氨基酸终止于第390位氨基酸，其氨基酸序列和cDNA序列如下DMRSQYEVMAEQNRKDAEAWFTSRTEELNREVAGHTEQIiQMSRSEVTDLRRTLQGLEIELQSQLSMKAAIiEDTLAETEARFGAQIiAHIQALISGIEAQLGDVRADSERQIIQEYQRLMDIKSRLEQEIATYRSIjIjEGOEDH3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为图1构建图中所示的pTrc-CKS-C尺/9匿7。4.将权利要求1-3中所述的人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体转化入大肠杆菌菌株得到的重组菌株。5.如权利要求4中所述的重组菌株，其特征在于所述大肠杆菌菌株为大肠杆菌TOP10菌株。6.—种表达重组角蛋白19抗原活性片段的方法，包括培养权利要求4或5所述的重组大肠杆菌菌株，IPTG诱导表达角蛋白19抗原活性片段的步骤。7.如权利要求6中所述的表达重组角蛋白19抗原活性片段的方法，其特征在于所述的方法中还包括利用金属亲和柱层析分离纯化重组角蛋白19抗原活性片段的步骤。8.如权利要求7中所述的表达重组角蛋白19抗原活性片段的方法，其特征在于所述金属亲和柱层析为镍离子亲和柱层析。全文摘要本发明公开了一种人重组角蛋白19抗原活性片段表达载体及其应用，目的是提供一种克隆有重组角蛋白19高抗原活性基因片段的重组表达载体的构建，以及利用其生产制备重组角蛋白19抗原活性片段的方法。该表达载体编码角蛋白19抗原cDNA全长序列中的一段核苷酸序列，并且该序列包含编码两个单抗BM19-21、KS19-1结合表位的基因。将其克隆至大肠杆菌pTrc-CKS表达载体中，可实现高效可溶性表达，产量可以达到15mg/L；对其活性和稳定性进行检测，达到了可应用的水平。CK19在体外的高效表达，既改善了CK19的得率低、生产成本高以及稳定性差的缺点，又使得到的蛋白抗原特异性大幅度提高。文档编号C12N15/70GK101659959SQ20081004230公开日2010年3月3日申请日期2008年8月29日优先权日2008年8月29日发明者韧任,纲刘,汪宁梅,穆海东申请人:上海裕隆生物科技有限公司被以下专利引用(1),