专利名称：一种脱除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法
技术领域：
本发明属于生物转化领域 技术背景紫杉垸是含有紫杉烷母核的多个化合物的总称，属芋二萜类化合物。举杉醇(paclitaxel,商品名taxol)是其中的一种，于1967年由美国化学家Wall 和Wani等从太平洋紫杉(又名短叶红豆杉，Taxus. brevifolia)树皮中提取 出来，是当前癌症治疗研究中的一线药物(Wall ME， Wani MC， Taylor HL. Isolation and chemical characterizaticin of antitumor agent from plants. Cancer Treat R印.1976， 60:1011-1014; Wani MC， Taylor HL ， Wall ME, Coggon P， McPhai AT. VI: The isolation and structure of taxol， a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J. Am. Che血.Soc. 1971, 93: 2325—2327)。红豆杉类植物由于生长缓慢，资源极其珍贵，已被列 入国家一级保护植物。为寻找替代资源，全世界做了大量的努力，目前尚无很 好的解决办法(Ramesh N. Patel, Tour de paclitaxel biocatalysis for semisynthesis， A諷Rev.Microbiol, 1998, 98: 361—394)。 7-木糖紫杉烷类 化合物在红豆杉枝叶中的含量十分丰富，能达到紫杉醇含量的10倍。将7-木糖 基紫杉烷类物质转化成紫杉醇，是一种提高红豆杉资源利用效率现实可行的方 法。将7-木糖基紫杉垸转化为相应的紫杉烷，Murray等发明了用高碘酸钠等化 学法水解脱去7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，(Murray ,Christopher K，Beckvermit ， et al . United States Patent: 5,412,116， 1995， 5， 2.)。 溆春芳^^mT氧化法水解红豆杉浸膏中的7-木糖基紫杉醇生成紫杉醇的方法(赵春芳，余龙江，李丽琴等，氧化水解法提高红豆杉浸膏中紫杉醇产率的研究，天然产物研究与开发，2006 , 18 : 95-99)。但化学法脱木糖基所需的时间长， 化学药品有不同程度的毒性，还会污染环境；对于有多个手性中心的紫杉烷来 讲，过量的氧化剂、酸度、温度等条件会引起紫杉垸的降解，导致紫杉垸的收 率降低，对于紫杉醇这种昂贵的药品来说，损失是很大的。施贵宝公司发明了一种用微生物或酶的方法分解7-木糖基紫杉烷中木糖基 的方法，并申报了相应的专利(US Patent 5700669, 1995, 4)。在他们的专利中， 报道了多个有水解7-木糖基紫杉烷中木糖基能力的细菌，分布在三个属，艮P: 杆菌属(》ac/"^)，莫拉氏菌属Ufome77a )，微球菌属(^'"ococcw力等。 本发明的目的在于获得了一些新的产7-木糖基紫杉烷水解酶的微生物类群—— 链霉菌属(5Tre/)/o迈7ce51 )，如马特链霉菌(i^r"t咖yce《迈"e/2"'s0， 异硫 链霉菌(iSYre/^o迈yces a/fA/o〃cw力，i^re/7^7迈7"ces ^r/seo/^e/w1.类芽孢 杆菌属 (/^e"/63"V/ws) 如 户aefli6s"'"z/s ，6w// ， 无色杆菌属假单胞菌属(？"i^o迈o/7W),如恶臭假单胞菌(i^ew/o迈oi7as尸w"'^)， Aewfo迈朋^ a^7/朋2'/等，它们具有较高的分解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶 活。特别是以下的菌种马特链霉菌[i^r印"边/cef鹏,朋w's (x61)]，类芽孢 杆菌[户ae"/^3"'"zwi7由"(m25)]，无色杆菌[JcAr咖o6a"er柳"^(m55)〗， 恶臭假单胞菌[/^e^^zw加;y户tf"Va (ml29)]具有较高的水解7-木糖基紫杉烷 中木糖基的能力.发明内容本发明使用新的微生物类群——链霉菌属、类芽孢杆菌属、无色杆菌属、 假单胞菌属的微生物专^&地降解J二木糖基紫杉烷中木糖基,！ l位的糖苷基水解成羟基。本发明所述的7-木糖基紫杉烷降解成为相应紫杉烷的方法由以下步骤组成一、 从木聚糖含量较高的植物材料中提取出木聚糖或直接使用含有木聚糖 成分的植物性材料为唯一碳源配制培养基；灭菌。二、 接种链霉菌属、类芽孢杆菌属、无色杆菌属、假单胞菌属中的菌株于 已灭菌的培养基中。接种后，摇瓶在100—400rpm 15-37。C条件下培养3-7天， 诱发微生物产生相应的转化酶。三、 将转化底物7-木糖基紫杉烷用有机溶剂溶解后加入到发酵液中；或从 发酵液中提取出转化酶的粗酶制剂，酶经固定化或不经固定化处理，酶溶于水 中或有机溶剂中，再将有机溶剂溶解的底物加入到酶液中进行转化。四、 转化后的产物经大孔树脂吸附或有机溶剂萃取，也可直接将发酵液浓 縮，再经柱层析方法纯化后即可进入后续的加工处理阶段。在有机溶剂中转化 的底物可以直接浓缩或经柱层析纯化。在步骤一中，培养基含有木聚糖的目的在于使链霉菌、.类芽孢杆菌、假单 胞菌、无色杆菌等微生物能在木聚糖的诱导下产生木糖苷酶，这些微生物产生 的木糖苷酶能降解7-木糖基紫杉烷中的木糖基。木聚糖在培养基中的含量在 0. 1%-10%之间。本发明所述的木聚糖，可以是含木聚糖的甘蔗渣、玉米芯等植物材料，也 可以是这些植物材料经过碱如NaOH、 KOH等处理后提取出来的提取物。本发明所述的微生物属于链霉菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、无色杆 菌属的微生物，在发酵液中的接种用量为0. 01%-10%.这些菌能够产生专一性地 降解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶或能力，使7-冰糖基紫^^烷啦助木糖基能够被有效脱除。本发明所指的含有木糖基的紫杉烷包括一系列含有紫杉烷母核且在7位含 有木糖基的化合物，主要有7-木糖基紫杉醇，7-木糖基-lO-脱乙酰紫杉醇， 7-木糖基三尖杉磷碱，7-木糖基-10-脱乙酰三尖杉磷碱等。'本发明所述的紫杉垸底物，可以纯化到一定纯度，如含量70 /。以上的7-木 糖基紫杉烷,也可以是含有7-木糖基紫杉烷的植物浸膏,含量可以低至1%左右。 加入的底物可以是含有一种7-木糖基紫杉垸的底物，也可以是几种7-木糖基紫 杉烷的混合物。本发明中能溶解紫杉垸的有机溶剂包括甲醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、二甲基亚砜等；或者是由几种溶剂所组成的混合溶剂。本发明所指的紫杉垸木糖苷酶，是经发酵后由微生物分泌到发酵液中，使 用时可以是未经任何浓縮或提取的发酵液或发酵液的稀释液，也可以是将转化 酶浓縮或提纯至不同纯度的酶液或发酵液。也可以是用硫酸铵或其它方法提纯 到较高纯度的固体酶。提取出来的酶也可以是经过不同固定化方式处理或不经 固定化处理，转化时的介质是水或有机溶剂。本发明要解决的技术问题是通过含有木聚糖的培养基培养新的产生紫杉垸7-木糖苷酶的微生物，能降解各种7-木糖基紫杉烷中的木糖基生成相应的紫杉 烷。该产物包括可经纯化后直接作为药用的紫杉醇，也可以包括经过半合成后 成为紫杉醇或多烯紫杉醇的前体化合物。该技术由以下的特征组成培养基中必须含有一定量的木聚糖，便于所接 种的微生物经诱导后产生木聚糖酶；必须接种纯的链霉菌属、类芽孢杆菌属、 无色杆菌属、假单孢菌属中的一个微生物菌株；接种后必须培养一定时间(3-7 天)，接种微生物才能产生足够多的酶；含有7-木糖紫杉垸必须用有机溶剂溶解 后加入到培养好的发酵液中或提取出来钓酶中。转化定时伺后经提取纯化即可。有益效果是通过微生物对7-木糖紫杉烷中木糖基的专一性降解，.脱掉了 其中的木糖基，可以直接用来生产紫杉醇，或者可用于合成紫杉醇或多烯紫杉 醇的前体物质，可以大幅度地提高红豆杉资源的利用效率，增加了新的转化微 生物类群，且后处理工艺十分简便。为了更好的理解本发明,.下面用实验数据进行说明用下列配方配制培养基甘蔗渣木聚糖3%，磷酸氢二钾1%,磷酸二氢钾 0. 5%,硫酸铵0. 1%,柠檬酸钠G. G51配制培养基溶液3QG毫升，分装入3个 500毫升的玻璃瓶中，每瓶装量为100亳升，121-C高压灭菌15min，将马特链 霉菌(i^re/7^ ,es咖/朋".y X61)接入液体培养基中，28。C300rpm培养7 天。将7-木糖基紫杉醇30mg溶解于10ml的甲醇溶液中，分装入三个已培养好 菌体的发酵液中，转化30小时后，合并发酵液，用二氯甲烷150ml分3三次萃 取，萃取物用旋转蒸发仪减压浓縮后，浓縮物经柱层析纯化，结构解析，确认 为紫杉醇。经高压液相色谱仪定量测定，得紫杉醇22mg，产品收得率为73%。具体实施例1、将玉米芯粉碎成能过80目筛的粉未，按下列配方配制培养基溶液300 毫升.玉米芯粉7%，磷酸氢二钾1%,磷酸二氢钾0. 5%，硫酸铵0.1%，柠檬酸 钠0. 05%。配制好的培养基分装入3个500毫升的玻璃瓶中，每瓶装量为100毫 升，121。C高压灭菌15min，将马特链霉菌(^re^咖yces咖^i^/力接入发酵 培养棊中，28。C300rpm培养6天。用纱布滤去菌体，合并滤液。用10ml丙酮溶 解7-木糖-10-脱乙酰紫杉醇50nig，加入到发酵滤液中，继续转化3天。用XAD 大孔树月旨吸附，然后用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，经高 压液相色谱仪定量测定，得10-脱乙酰紫杉醇35mg，产品收得率为70%。 10-脱乙酰紫杉醇经乙酰化后即可得到紫杉醇。二2、 用下列配方配制培养基玉米芯木聚糖3%，磷酸氢二钾W，磷酸二氢 钾0.5%，硫酸铵0.1%，柠檬酸钠0.051配制培养基溶液300毫升，装入3个 500毫升的玻璃瓶中，每瓶装量为100毫升，12rC高压灭菌15min，将无色杆 菌[JcAro迈o6a"er ^a/ /w;y(m55)]接入液体培养基中，28。C300rpm培养7天。收集发酵液，用纱布滤去菌体，加入硫酸铵至饱和，过滤收集沉淀，得转化粗 酶制剂10mg，再将粗酶制剂溶于100ml水中，将7-木糖基紫杉醇30mg溶解于 15ml的甲醇溶液中，再加入配好的酶液中，转化30小时后，用二氯甲烷150ml 分3三次萃取，萃取物用真空旋转蒸发仪浓縮后，经高压液相色谱仪分析测定， 得紫杉醇21mg。3、 用下列配方配制培养基甘蔗渣木聚糖3%,磷酸氢二钾1%,磷酸二氢 钾0. 5%,硫酸铵0. 1%,柠檬酸钠0. 051配制培养基溶液300毫升，装入3个 500毫升的玻璃瓶中，每瓶装量为100毫升，121'C高压灭菌15min,将恶臭〗叚 单胞菌[(Pseudomonas Putida (ml29)]接入液体培养基中，28'C300rpm培养 7天。合并发酵液，用纱布滤去菌体，加入硫酸铵至饱和，过滤收集沉淀，得转 化粗酶制剂，将粗酶制剂加入到含有7-木糖基三尖杉磷碱30mg的50ml氯仿中， 转化50小时后，用硅胶柱层析分离，得三尖杉磷碱20mg得，收率为66%。
权利要求
1、一种脱除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特征在于该方法由使用含有木聚糖成分的培养基培养链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的微生物，诱导所接种的微生物产生相应的酶后，加入7-木糖基紫杉烷到培养基中进行转化，再将产物提取出来等步骤组成。
2、 根据权利要求1所述的酶法脱除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特征在 于所接菌种的微生物为链霉菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、类芽孢杆菌属中 的一种。
3、 根据权利要求1或2所述的脱除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特征在 于转化时7-木糖基紫杉垸底物的浓度百分比为0. 001-1%。或提取出转化所需的 酶后，固定化后或直接以游离酶在有机溶剂中转化，转化浓度为0. 01-20%。
4、 根据权利要求1或2或3所述的脱除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法，其特 征在于所述的温度为10-7(TC,转化菌的培养时间为3-10天，转化时间为0.5 小时至150小时。
全文摘要
本发明涉及一种用微生物或酶法脱除7-木糖基紫杉烷中木糖基的方法。本发明所述的方法由以下步骤组成一、将含有木聚糖的培养基灭菌后，接种链霉菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、类芽孢杆菌属中的一种微生物，培养3-10天；二、用溶剂溶解7-木糖基紫杉烷，加入到已培养好的培养液中，浓度为0.001％-0.2％，在15-37℃条件下培养3-7天；或提取转化酶，制成粗酶制剂，固定化后或直接以游离酶在水中或有机溶剂中转化0.5-150小时，浓度为0.001％-20％。本发明要解决的技术问题是通过链霉菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、类芽孢杆菌属的微生物所产生的能分解7-木糖基紫杉烷中木糖基的酶，将7-木糖基紫杉烷中的木糖基降解，得到相应的紫杉烷。
文档编号C12P17/02GK101215589SQ20081005800
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月7日 优先权日2008年1月7日
发明者周继蓉, 煜 张, 松 李, 王兴红 申请人:云南大学