专利名称：：一种诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法及用途，属生物医药
技术领域：
。
背景技术：
：生物治疗在治疗恶性肿瘤中具有重要意义。研发新的生物治疗靶点和方法，通过生物活性物质，阻止癌细胞增生、诱导癌细胞凋亡，从而用于恶性肿瘤的治疗，是目前国际生物医药技术的热点之一。例如，在临床上有较好效果的抗癌药物西妥昔单抗(Cetuximab)，即为人源化抗体药物。它们可结合癌细胞表面的生长因子受体，阻止癌细胞增生而治疗癌症。再例如，赫赛汀(HERCEPTIN，抗冊R2的人源化抗体)，可激活服R2相关的细胞凋亡信号通路，导致HER2阳性肿瘤细胞凋亡而治疗乳房癌。它们均被美国食品与药品管理局(FDA)批准和被临床广泛应用。我们的研究表明CD176(TF)是细胞膜糖蛋白的核心糖链。在正常细胞，CD176(TF)被唾液酸及其他糖链掩盖，CD176(TF)不能结合相关抗体和淋巴细胞(Caoetal.1996)。恶性肿瘤时，肿瘤细胞由于糖化障碍，CD176(TF)暴露表达于肿瘤细胞表面。CD176(TF)表达于多种恶性肿瘤，如乳腺癌(Cao1997)、肠癌(Caoetal.1997，1995)、胃癌、肺癌(曹毅，未发表资料)、肾癌(Caoetal.2000)、肝癌(Caoetal.1999)、淋巴瘤(Caoetal.2002)、白血病(Caoetal.2002)，但不表达于正常组织。在恶性肿瘤发生过程中，早期恶性肿瘤，如乳腺原位癌，肿瘤细胞即可表达CD176(TF)(Cao1997)。暴露表达的CD176(TF)可结合相关抗体和配体。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。参考文献1、￡§2y(曹毅)，MerlingA,KarstenU,Schwartz隱AlbiezR.2002.Expres'sionofThomsen-Friedenreich-relatedcarbohydrateantigensonhumanleukemiacells.In:LeucocyteTypingVII(eds.D.Mason.etal.)，OxfordUniversityPress,Oxford,204-205.2、￡my(曹毅)，KarstenU，ZerbanH,BannaschP.2000.ExpressionofMUC1,Thomsen-Friedenreich-relatedantigens,andcytokemtin19inhumanrenalcellcarcinomasandtubularclearcelllesions.VirchowsArchiv,436:119-126.3、y(曹毅)，KarstenU，OttoQBannaschP.1999.ExpressionofMUC1,Thomsen-Friedenreichantigen,Tn,sialosyl-Tn,anda2,6-linkedsialicacidinhepatocellularcarcinomasandpreneoplastichepatocellularlesions.VirchowsArchiv,434:503-509.4、y(曹毅).1997.Epithelialmucins(MUC1andMUC3)andThomsen-Friedenreich-relatedantigensinnormalhumantissuesandinneoplastictissuesofcolorectumandbreast:theirdistribution,pathophysiologicalrole,andclinicalsignificance.DoctorthesisattheMaxDelbriickCenterforMolecularMedicineandHumboldtUniversity,Berlin,Germany.5、y(曹毅)，SchlagPM,KarstenU.1997.Immunodetectionofepithelialmucin(MUC1,MUC3)andmucin-associatedglycotopes(TF,Tn,andSialosyl-Tn)inbenignandmalignantlesionsofcolonepithelium:apolarlocalizationcorrespondtothemalignanttransformation.VirchowsArchiv,431:159-166.6、￡my(曹毅)，StosiekP，SpringerGF,KarstenU.1996.Thomsen-Friedenreich-relatedcarbohydrateantigensinnormaladulthumantissues:Asystematicandcomparativestudy.HistochemistryandCellBiology,106:197-207.7、￡my(曹毅)，KarstenU，LiebrichW，HaenschW,SpringerGF,SchlagP.1995.ExpressionofThomsen-Friedenreich-relatedantigensinprimaryandmetastaticcolorectalcarcinomas:Are-evaluation.Cancer,76:1700-1708.8、KarstenU,ButschakGy(曹毅)，GoletzS,HanischF-G..1995Anewmonoclonalantibody(A78-G/A7)totheThomsen-Friedenreichpan-tumorantigen.Hybridoma，14:37-44.
发明内容本发明的目的在于提供一种安全和适用范围广的诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法及其应用。本发明直接用CD176(Thomsen-Friedenreich肿瘤相关抗原，TF，Galpl-3GalNAca1-R和Galpl_3GalNAcpl-R)的抗体(自然抗体、合成的人源化抗体)和配体[合成的结合CD176(TF)的重组蛋白和多肽、提取的结合CD176(TF)的植物或动物凝集素]，或给病人免疫CD176(TF)抗原疫苗产生抗CD176(TF)自然抗体。外源的CD176(TF)抗体和配体，免疫后产生的抗CD176(TF)自然抗体，结合恶性肿瘤细胞膜上的CD176(TF)，诱导恶性肿瘤细胞凋亡，其具体步骤如下a.用抗CD176(TF)单克隆抗体作为第一抗体，荧光素标记的羊抗鼠作为第二抗体，对培养的恶性肿瘤细胞株进行染色,用流式细胞仪检测染色结果；同时，用浓度为每毫升5微单位的唾液酸酶(NeuraminidasefromVibriocholerae)在37'C下处理恶性肿瘤细胞株1小时，或用浓度为每毫升2微单位的阿尔法2-3唾液酸酶(a2-3sialidase)在37。C下处理恶性肿瘤细胞株度90分钟，再用CD176(TF)抗体和荧光素标记的羊抗鼠进行染色，用流式细胞仪检测染色结果；未用唾液酸酶和阿尔法2-3唾液酸酶处理的细胞系，部分细胞系CD176(TF)呈强阳性，部分细胞系CD176(TF)呈阳性，部分细胞系CD176(TF)呈弱阳性或阴性用唾液酸酶处理的细胞系，所有细胞系CD176(TF)呈强阳性；用阿尔法2-3唾液酸酶处理的细胞系，部分细胞系CD176(TF)呈强阳性，部分细胞系CD176(TF)呈阳性，部分细胞系CD176(TF)呈弱阳性或阴性；b.用CD176(TF)抗体孵育培养恶性肿瘤细胞株，抗体浓度分别为每毫升1微克、每毫升5微克、每毫升10微克，孵育条件分别为37。C下处理5小时或过夜，孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，用流式细胞仪检测，用鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照；CD176(TF)抗体处理后在CD176(TF)呈强阳性细胞株，大量肿瘤细胞凋亡；在CD176(TF)呈阳性细胞株，部分肿瘤细胞凋亡；在CD176(TF)呈弱阳性或阴性细胞株时，仅很少量肿瘤细胞凋亡；正常鼠IgM处理后，仅很少量肿瘤细胞凋亡；c.先用唾液酸酵(NeuraminidasefromVibriocholerae)处理培养恶性月中瘤细胞株，唾液酸酶浓度为每毫升5微单位，37。C下处理l小时，唾液酸酶处理后，用CD176(TF)抗体孵育培养恶性肿瘤细胞株，抗体浓度分别为每毫升l微克、每毫升5微克、每毫升10微克，孵育条件分别为37'C下处理5小时或过夜，鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照，孵育后分别用荧光素标记的ArmexinV或Nicoletti染色，流式细胞仪检测；CD176(TF)抗体处理后，在所有细胞系表现为，大量肿瘤细胞凋亡；d.先用阿尔法2-3唾液酸酶(a2-3sialidase)处理培养恶性肿瘤细胞株，阿尔法2-3唾液酸酶浓度为每毫升2微单位，37"C下处理90分钟；阿尔法2_3唾液酸酶处理后，用CD176(TF)抗体孵育培养恶性肿瘤细胞株，抗体浓度分别6为每毫升l微克、每毫升5微克、每毫升10微克，孵育条件分别为37'C下处理5小时或过夜，鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照，孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，流式细胞仪检测；CD176(TF)抗体处理后CD176(TF)呈强阳性细胞株，大量肿瘤细胞凋亡；CD176(TF)呈阳性细胞株时，部分肿瘤细胞凋亡；CD176(TF)呈弱阳性或阴性细胞株时，仅很少量肿瘤细胞凋亡；正常鼠IgM处理后，仅很少量肿瘤细胞凋亡。本发明的诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法可作为恶性肿瘤生物治疗。本发明与现有技术相比，具有安全和适用范围广等优点。可用于多种恶性肿瘤的生物治疗。具体实施例本发明的方法不仅局限于实施例。本实施例为用CD176(TF)抗体处理培育的白血病和恶性淋巴瘤细胞，CD176(TF)抗体诱导白血病细胞凋亡(ap叩tosis)。本实施例所用检测仪及检测方法均为现有常规方法。本实施例具体如下1、用抗CD176(TF)单克隆抗体(A78-G/A7，Karstenetal.1995)作为第一抗体，荧光素标记的羊抗鼠作为第二抗体，对用现有方法培养的白血病细胞株，包括——急性髓母细胞白血病细胞株(KGl，KGla)，急性单核细胞白血病细胞株(U937)，急性红白血病细胞株(K562)，T淋巴细胞白血病细胞株(CEM-C7)，进行染色，并用流式细胞仪检测染色结果。同时，用唾液酸酶(NeuraminidasefromVibriocholerae)或阿尔法2-3唾液酸酶(oc2-3sialidase)处理KG1、KGla、U937、K562、CEM-C7。唾液酸酶浓度为每毫升5微单位，37。C下处理1小时；或阿尔法2-3唾液酸酶浓度为每毫升2微单位，37'C下处理90分钟。唾液酸酶和阿尔法2-3唾液酸酶处理后，用抗CD176(TF)抗体和荧光素标记的羊抗鼠进行染色，并流式细胞仪检测染色结果。所有染色结果见表l。表1.CD176(TF)抗体(A78-G/A7)染色及流式细胞仪检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><1%阳性细胞；(+):1%-5%阳性细胞；+:5%-30%阳性细胞；++:30%-60%阳性细胞；〉60%阳性细胞。2.用CD176(TF)抗体，A78-G/A7(抗体为提纯的，无菌的，无防腐剂)，孵育培养的白血病细胞株，包括——急性髓母细胞白血病细胞株(KGl,KGla)，急性单核细胞白血病细胞株(U937)，急性红白血病细胞株(K562)，T淋巴细胞白血病细胞株(CEM-C7)。鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照。抗体浓度分别为每毫升1微克、每毫升5微克、每毫升10微克。孵育条件为37匸下处理5小时或过夜。孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，流式细胞仪检测。CD176(TF)强阳性细胞株KG1，大量肿瘤细胞凋亡；CD176(TF)阳性细胞株K562，部分肿瘤细胞凋亡；CD176(TF)弱阳性或阴性细胞株KGla、CEM-C7、U937，仅很少量肿瘤细胞凋亡。结果见图1和图2。正常小鼠免疫球蛋白IgM替代CD176(TF)抗体孵育作为对照，仅很少量细胞凋亡，细胞凋亡数分别为CEMC7，2%;U937，1%;KG1,2%;KGla，1%;K562，13%。'3.先用唾液酸酶(NeuraminidasefromVibriocholerae)处理KG1、KGla、U937、K562、CEM_C7。唾液酸酶浓度为每毫升5微单位，37'C下处理1小时。唾液酸酶处理后，用CD176(TF)抗体孵育培养的白血病细胞株，鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照，方法同2。孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，流式细胞仪检测。CD176(TF)抗体处理后，在所有细胞系KG1、KGla、U937、K562、CEM-C7表现为，大量肿瘤细胞凋亡。结果见图1和图2。正常小鼠免疫球蛋白IgM替代CD176(TF)抗体孵育作为对照，仅很少量细胞凋亡，细胞凋亡数分别为CEMC7，4%;U937,1，5%;KG1，2%;KGla,1.5%;K562，16%。4.先用阿尔法2-3唾液酸酶(oc2-3sialidase)处理KG1、KGla、U937、K562、CEM-C7。阿尔法2-3唾液酸酶浓度为每毫升2微单位，37"C下处理90分钟。阿尔法2-3唾液酸酶处理后，用CD176(TF)抗体孵育培养的白血病细胞株，鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照，方法同2。孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，流式细胞仪检测。CD176(TF)抗体处理后，CD176(TF)强阳性细胞株KG1，大量肿瘤细胞凋亡；CD176(TF)阳性细胞株K562，部分肿瘤细胞凋亡；CD176(TF)弱阳性或阴性细胞株KGla、CEM-C7、U937，仅很少量肿瘤细胞凋亡。结果见图1和图2。正常小鼠免疫球蛋白IgM替代CD176(TF)抗体孵育作为对照，仅很少量细胞凋亡。图1.为CD176(TF)抗体处理培养的白血病细胞，荧光素标记的AnnexinV染色，流式细胞仪检测结果。白血病细胞株(CEMC7为T淋巴细胞白血病，U937单核细胞白血病，KG1急性粒细胞白血病，KGla急性粒细胞白血病，K562幼红细胞白血病)分别经唾液酸酶(參)，阿尔法2-3唾液酸酶(*)处理，或未处理(〇)；CD176(TF)抗体孵育5小时；AnnexinV染色并流式细胞仪分析细胞凋亡。图2.CD176(TF)抗体处理培养的白血病细胞，Nicoletti染色，流式细胞仪检测结果。白血病细胞株(CEMC7为T淋巴细胞白血病，U937单核细胞白血病，KG1急性粒细胞白血病，KGla急性粒细胞白血病，K562幼红细胞白血病)经唾液酸酶处理，或未处理；CD176(TF)抗体(每毫升10微克)孵育过夜；Nicoletti染色并流式细胞仪分析细胞凋亡。在细胞图(Cytograms)内给出的数字表示DNA破碎的(Fragments)的平均荧光强度(区域用划线表示)。划线区域右外侧表示未损细胞处于不同的细胞周期。权利要求1.一种诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法，其特征在于该方法直接用CD176(Thomsen-Friedenreich肿瘤相关抗原，TF，Galβ1-3GalNAcα1-R和Galβ1-3GalNAcβ1-R)的自然抗体或合成的人源化抗体、合成的结合CD176(TF)的重组蛋白和多肽、提取的结合CD176(TF)抗原的植物或动物凝集素，结合恶性肿瘤细胞膜上的CD176(TF)，诱导恶性肿瘤细胞凋亡；其具体步骤如下a.用抗CD176(TF)单克隆抗体作为第一抗体，荧光素标记的羊抗鼠作为第二抗体，对培养的恶性肿瘤细胞株进行染色，用流式细胞仪检测染色结果；同时，用浓度为每毫升5微单位的唾液酸酶(NeuraminidasefromVibriocholerae)在37℃下处理恶性肿瘤细胞株1小时，或用浓度为每毫升2微单位的阿尔法2-3唾液酸酶(α2-3sialidase)在37℃下处理恶性肿瘤细胞株度90分钟，再用抗CD176(TF)抗体和荧光素标记的羊抗鼠进行染色，用流式细胞仪检测染色结果；未用唾液酸酶和阿尔法2-3唾液酸酶处理的细胞系，部分细胞系CD176(TF)呈强阳性，部分细胞系CD176(TF)呈阳性，部分细胞系CD176(TF)呈弱阳性或阴性用唾液酸酶处理的细胞系，所有细胞系CD176(TF)呈强阳性用阿尔法2-3唾液酸酶处理的细胞系，部分细胞系CD176(TF)呈强阳性，部分细胞系CD176(TF)呈阳性，部分细胞系CD176(TF)呈弱阳性或阴性；b.用CD176(TF)抗体孵育培养恶性肿瘤细胞株，抗体浓度分别为每毫升1微克、每毫升5微克、每毫升10微克，孵育条件为37℃下处理5小时或过夜，孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，用流式细胞仪检测；用鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照；CD176(TF)抗体处理后在CD176(TF)强阳性细胞株，大量肿瘤细胞凋亡；在CD176(TF)阳性细胞株，部分肿瘤细胞凋亡；在CD176(TF)弱阳性或阴性细胞株，仅很少量肿瘤细胞凋亡；正常鼠IgM处理后，仅很少量肿瘤细胞凋亡；c.先用唾液酸酶(NeuraminidasefromVibriocholerae)处理培养恶性肿瘤细胞株，唾液酸酶浓度为每毫升5微单位，37℃下处理1小时，唾液酸酶处理后，用CD176(TF)抗体，A78-G/A7孵育培养恶性肿瘤细胞株，抗体浓度分别为每毫升1微克、每毫升5微克、每毫升10微克，孵育条件为37℃下处理5小时或过夜；鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照；孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，流式细胞仪检测；CD176(TF)抗体处理后，所有恶性肿瘤细胞系表现为大量肿瘤细胞凋亡；正常鼠IgM处理后，仅很少量肿瘤细胞凋亡；d.先用阿尔法2-3唾液酸酶(α2-3sialidase)处理培养恶性肿瘤细胞株，阿尔法2-3唾液酸酶浓度为每毫升2微单位，37℃下处理90分钟；阿尔法2-3唾液酸酶处理后，用CD176(TF)抗体孵育培养恶性肿瘤细胞株，抗体浓度分别为每毫升1微克、每毫升5微克、每毫升10微克，孵育条件为37℃下处理5小时或过夜；鼠浆细胞瘤来源的鼠IgM作为对照；孵育后分别用荧光素标记的AnnexinV或Nicoletti染色，流式细胞仪检测；CD176(TF)抗体处理后在CD176(TF)强阳性细胞株，大量肿瘤细胞凋亡；在CD176(TF)阳性细胞株，部分肿瘤细胞凋亡；在CD176(TF)弱阳性或阴性细胞株，仅很少量肿瘤细胞凋亡；正常鼠IgM处理后，仅很少量肿瘤细胞凋亡。2、权利要求l所述的诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法的应用，其特征在于该方法作为恶性肿瘤的生物治疗。全文摘要本发明涉及一种诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法和用途，属生物医药
技术领域：
。本发明直接用CD176(Thomsen-Friedenreich肿瘤相关抗原，TF，Galβ1-3GalNAcα1-R和Galβ1-3GalNAcβ1-R)的抗体(自然抗体、合成的人源化抗体)和配体[合成的结合CD176(TF)的重组蛋白和多肽、提取的结合CD176(TF)的植物或动物凝集素]，结合恶性肿瘤细胞膜上的CD176(TF)，诱导恶性肿瘤细胞凋亡。本发明的诱导恶性肿瘤细胞凋亡的方法可作为恶性肿瘤生物治疗。本发明与现有技术相比，具有安全和适用范围广等优点。文档编号C12N5/09GK101319201SQ20081005829公开日2008年12月10日申请日期2008年4月18日优先权日2008年4月18日发明者毅曹申请人:中国科学院昆明动物研究所