专利名称：：食线虫真菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶晶体结构的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到用X光晶体衍射方法确定的食线虫真菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶晶体结构，属于分子生物学和应用微生物学领域。
背景技术：
：线虫是一类线形多细胞原生动物，广泛分布于海水、淡水及土壤中，其中一部分能够寄生于植物或动物体内。植物寄生线虫可以引起多种经济作物的严重病害，造成巨大的经济损失。其中危害最严重的线虫包括根结线虫(Jkfe/o/tfogv"espp.)、胞囊线虫(//"eratferaspp.)和松材线虫(5w^印力e/e"c/z^xy/dpMws)等。应用化学农药虽然对病原线虫有良好的防治效果，但是化学农药容易造成环境污染、农药残留和线虫容易产生药物抗性等缺点，所以，研究杀线虫生物资源和开发生物杀线虫制剂日益受到关注。食线虫真菌是指寄生、捕捉、定殖和毒害线虫的一类微生物，它们在植物的病原昆虫和线虫的生物防治中起着非常重要的作用。其中寡孢节丛孢(^^^^//:^。/iga^or")、厚垣孢普可尼亚菌(尸oc/ww'flc/ztow;^ay;wra)和淡紫拟青霉(尸fle"7omycey///a"'"M)等食线虫真菌在侵染线虫的过程中能够分泌胞外酶并参与对线虫体壁的降解和侵染过程(2,6,7)。对食线虫真菌的研究表明蛋白酶等侵染性胞外酶在侵染线虫的过程中起着非常重要的作用(3-5)。然而，这些食线虫真菌在自然条件下所产生和分泌的胞外酶的浓度是非常低的^g/L)(7),所以提高食线虫真菌胞外蛋白酶的表达水平是提高线虫生防制剂防效的一种途径。Ahman等(l)的研究工作表明应用分子生物学手段构建的含有多拷贝胞外蛋白酶(PII)编码基因的寡孢节丛孢突变株不仅能够使生防菌株分泌更多的胞外酶，而且生防菌株的捕食能力也得到了极大的增强，这也为食线虫真菌的遗传改造提供了较好的思路和方法。目前提高食线虫真菌侵染活性的方法仅限于利用基因工程提高侵染性丝氮酸蛋白酶基因的拷贝数，增加表达量来实现，但没有对丝氨酸蛋白酶的结构进行细致的研究。经文献检索，未发现与本
发明内容相同文献的公开报道。参考文献1.Ahman，J.，T.Johansson,M.Olsson，P.J.Punt,C.A.vandenHondel，andA.Tunlid.2002.Improvingthepathogenicityofanematode-trappingfungusbygeneticengineeringofasubtilisinwith'nematotoxicactivity.ApplEnvironMicrobiol368:3408-15.2.Bo腿ts，P.J.，P.F.Fitters,H.Thijs，E.denBelder，C.Waahvijk，andJ.W.Henfling.1995.AbasicserineproteasefromPaecilomyceslilacinuswithbiologicalactivityagainstMeloidogynehaplaeggs.Microbiology141(Pt4):775-84.3.^GillespieJP，B.R.，Charn!eyAK.1998.RoleofcuticledegradingproteasesinthevirulenceofMetarhiziumspp.forthedesertlocust,schistocercagregaria.JInvertebrPathol71:128-137.4.H,M.1996.Roleofmicrobialproteasesinpathogenesis.MicrobiolImmunol40:685-693.5.Huang,X.，N.Zhao,andK.Zhang.2004.Extracellularenzymesservingasvirulencefactorsinnematophagousfungiinvolvedininfectionofthehost.ResMicrobiol155:811-6.6.Segers，R.，T.M.Butt,B.R.Kerry,andJ.F.Peberdy.'1994.ThenematophagousfungusVerticilliumchlamydosporiumproducesachymoelastase-likeproteasewhichhydrolyseshostnematodeproteinsinsitu.Microbiology140(Pt10):2715-23.7.—Tunlid,A.，S.Rosen,B.Ek，andL.Rask.1994.Purificationand'characterizationofanextracellularserineproteasefromthenematode-trapj)ingfungUsArthrobotrysoligospora.Microbiology140(Pt7):1687-95.8.汪家政，范明.2000.蛋白质技术手册.科学出版社.
发明内容本发明的目的在于通过X-晶体衍射的方法，确定食线虫真菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶的晶体结构。本发明通过对刀孢轮枝菌aecaw'd/tom戸flWotoe，YMF1:00U2)，保藏号CGMCCNo.l312，和淡紫拟青霉(Pae"7o附少cMWad/ms，M-14)，保藏CGMCCNo0241在诱导产酶液体培养基PL-4中发酵培养，使真菌在发酵液中分泌大量的丝氨酸蛋白酶。然后对发酵;液进行硫酸铵分级沉淀(盐析)，'对有蛋白酶活性的沉淀在AKTA(TM)(GE)纯化仪上进行阳离子交换层析和分子筛(凝胶柱)纯化。通过^t)S-PAGE检验蛋白酶的纯度。在获得电泳纯(>95%)的蛋白酶后用超滤浓縮管(Millipore,USA)将其浓縮到较高浓度。然后使用悬滴气相扩散法进行晶体培养。结晶条件的筛选使用Hampton(USA)公司的结晶条件筛选试剂盒。在获得好的筛选条件后，即在该条件下培养蛋白晶体。获得的晶体在X光机上衍射。使用HKL2000，O，ccp4等软件进行处理，最终获得该蛋白酶的三维结构。本发明是这样实现的真菌液体培养，将发酵液进行硫酸铵分级沉淀。将具蛋白酶活性部分用缓冲液溶解，即获得粗酶液。将粗酶液在蛋白纯化仪AKTA(TM,GE)上进行阳离子交换层析和分子筛纯化。通过SDS-PAGE检验纯度。获得纯酶以后进行浓縮处理以获得较高浓度的酶溶液。将高浓度的酶溶液进行悬滴气相扩散结晶。结晶条件通过试剂盒筛选。得到的晶体在X光机上衍射并收集足够多张衍射图片。用HKL2000处理衍射图片，并用O，ccp4等软件解析和优化蛋白结构。本发明的具体步骤如下1、真菌的培养真菌通过PDA斜面保藏，.用PDA平板传代。将少量菌丝接入液体产酶PL-4培养基(土豆100g/L煮沸25分钟加入明胶lg/L,葡萄糖lg/L,硫酸铵lg/L,磷酸二氢钾2g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸亚铁0.001g/L;每500mL三角瓶中分装200mL)中，在摇床上28°C，150rpm培养。培养6天以后收集培养液。酶活的测定采用FoIin-酚法(8)。2、胞外蛋白酶的纯化一将发酵物用4层纱布过滤除掉菌丝，收集上清液。加入不同质量的固体硫酸铵(终浓度5-85%)进行盐析，8500rpni离心12分钟，弃上清，.用发酵液1/20体积的磷酸盐缓冲液(10mMPBS，Ph6.0)溶解沉淀。测各溶液样品的蛋白'酶活。具有蛋白酶活的样品用45um微孔滤膜过滤。加到AKTA蛋白纯化仪上用10mMPBS，pH6.0平衡过的Resourcel5S阳离子柱上。用含有1MNaCl的10mMPBS，pH6.0缓冲液梯度洗脱。收集不同的洗脱峰，分别测蛋白酶酶活。SDS-PAGE电泳检测。将具有蛋白酶活的洗脱液浓縮后上分子筛(Superdex7526/60)，缓冲液为50mMPBSpH7.0，力n0.15MNaCl。收集不同的洗脱峰，分别测蛋白酶活。SDS-PAGE电泳检测。3、蛋白酶的结晶'通过以上纯化步骤获得电泳纯的蛋白酶样品。将此蛋白溶液加入Amicon(TM，Millipore)超滤浓縮管。4000rpm离心，直到达到预期的体积。使用Brandford染色法确定蛋白浓度。使用Hampton结晶试剂盒进行结晶条件的筛选。蛋白酶浓度为5mg/ml,将lul蛋白和lul池液混合均匀点在硅化的盖玻片上，倒扣密H"在含有200ul池液的槽上，在16'C进行悬滴气相扩散结晶。具体见试剂盒说明书。每隔8小时观察结晶。在产生结晶的条件下对蛋白浓度和池液中各物质的浓度进行梯度优化以获得较好的蛋白结曰曰曰o4、X光衍射和结构解析在收集到蛋白酶的X射线衍射数据后，首先使用HKL2000等(包括Mosflm、D*trek等)软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep等，利用分子置换(MolecularReplacement)的方法，得到蛋白酶PL646和抑制剂的精细三维结构。本发明首次报道了食线虫真菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶的晶体结构，为提高蛋白酶的水解活性和食线虫真菌的侵染能力奠定了基础。图1为蛋白酶PL646晶体结构的飘带模型。由图可知蛋白酶PL646包含6个a螺旋，一个7股平行p折叠片，两个2股反平行p折叠片。图中同时展示了抑制剂的结合位置。屈:2为抑制剂与蛋白酶PL646.结合的精细结构四肽(Ala-Ala-Pro-Val)与蛋白酶形成氢键。抑制剂的末端碳原子和Val的C端碳原子分别与催化中心的组氨酸和丝氨酸残基形成共价键。具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。实施例一刀孢轮枝菌￡^""/"7//訓/^///^<^胞外丝氨酸蛋白酶的结构解析将PDA平板上培养的刀孢轮枝菌aec朋/dWm/7戸fl〃/otoe，YMF1.00112)，保藏号CGMCCNo.1312的菌株接种于产酶培养基中，28°C，150rpm摇床培养6天。过滤发酵液，上清液用硫酸铵沉淀。将有蛋白酶活性的部分用10mMPBS(pH6.0)缓冲液溶解，通过阳离子交换层析进行纯化。将有酶活的洗脱液通过分子筛进一步纯化。得到电泳纯的蛋白l每Ver112，浓縮后进行结晶获得蛋白酶晶体。晶体通过X光衍射，用HKL2000，ccp4等软件处理得到该蛋白酶的三维结构。"实施例二淡紫拟青霉尸ae"7o^yc^Waa>z^胞外丝氨酸蛋白酶的结构解析将PDA平板上培养的淡紫拟青霉(尸ae"7oOT7CM///a"'"^，M-14)，保藏CGMCCNo0241.的菌株接种于产酶培养基中，28°C，150rpm摇床培养6天。过滤发酵液，上清液用硫酸铵沉淀。将蛋白酶活性的部分用10mMPBS(pH6.0)缓冲液溶解，通过阳离子交换层析进行纯化。将有酶活的洗脱液通过分子筛进一步纯化。得到电泳纯的蛋白酶PL646，浓縮后进行结晶获得蛋白酶晶体。晶体通过X光衍射，用HKL2000，ccp4等软件处理得到该蛋白酶的三维结构。'上述实施实例得到的食线虫真菌胞外碱性丝氨酸酶的晶体结构，其特征为两种食线虫真菌胞外碱性丝氨酸蛋白酶Verll2和PL646晶体衍射后分辨率分别达到1.6A和2.1A。、两个蛋白酶都是球形蛋白，'具有6个a螺旋，一个7股平行p折叠片，两个2股反平行卩折叠片组成，另外Verll2有一个3/10螺旋。两个蛋白酶都含'有5个半胱氨酸，其中四个组成两个二硫键。两个蛋白酶都含有一个钙结合位点，结合l丐离子能提高蛋白酶的热稳定性。上述实施实例得到的食线虫真菌胞外碱性丝氨酸蛋白酶的活性中心，其特征为通6过对PL646及其蛋白酶抑制剂(mbthoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketone)的复合物结晶的衍射后确定了蛋白酶的底物结合口袋。抑制剂的^g肽片段与底物结合区的两条肽链通过氢键连接形成一个3股反平行折叠片。其C端与催化中心的丝氨酸和组氨酸残基形成共价键。通过此结构确定了4个底物结合口袋，Sl-S4，分别结合底物的四个氨基酸残基P1-P4。P1残基C端的肽键被催化中心的丝氨酸侧链的氧原子通过亲核攻击打断，从而催化了蛋白底物的水解反应。表一蛋白酶晶体参数衍射数据<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>aVaiueSinparenthesescorrespondtothehighestresolutionshell.bRmerge=2/^!^|/(7^/」广</(7^/)〉|/2/^/^1(7^/人，where</(7A:/」>isthemeanintensityoftheobservationsofreflectionhkl.权利要求1、一种食线虫真菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶晶体结构，其特征在于丝氨酸蛋白酶的晶体结构经如下步骤得到a.真菌通过PDA斜面保藏，用PDA平板传代，将少量菌丝接入液体产酶培养基中，在摇床上28℃，150rpm培养；培养6天以后收集培养液；b.过滤收集上清液，硫酸铵沉淀；通过AKTA蛋白纯化仪(sourece15S阳离子柱和凝胶柱superdex7526/60)进行纯化，得到电泳纯的蛋白酶；c.检测多肽抑制剂methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketone对蛋白酶PL646的抑制活性；.d.通过以上纯化步骤获得的电泳纯蛋白酶样品进行悬滴气象扩散法进行结晶；e.用旋进法收集X射线衍射数据在收集到蛋白酶的X射线衍射数据后，首先使用HKL2000、包括Mosflm、D*trek软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；再使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep软件，利用MolecularReplacement的分子置换方法，得到蛋白酶PL646和抑制剂的精细三维结构；其中食线虫真菌胞外丝氨酸酶的总体结构，其特征为两种食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶Ver112和PL646晶体衍射后分辨率分别达到1.6和2.1。两个蛋白酶都是球形蛋白，具有6个α螺旋，一个7股平行β折叠片，两个2股反平行β折叠片组成，另外Ver112有一个3/10螺旋；两个蛋白酶都含有5个半胱氨酸，其中四个组成两个二硫键，都含有一个钙结合位点，结合钙离子能提高蛋白酶的热稳定性；食线虫真菌胞外碱性丝氨酸蛋白酶的活性中心，其特征为通过对PL646及其蛋白酶抑制剂(methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketone)的复合物结晶的衍射后确定了蛋白酶的底物结合口袋；抑制剂的四肽片段与底物结合区的两条肽链通过氢键连接形成一个3股反平行折叠片；其C端与催化中心的丝氨酸和组氨酸残基形成共价键；通过此结构确定了4个底物结合口袋，S1-S4，分别结合底物的四个氨基酸残基P1-P4；P1残基C端的肽键被催化中心的丝氨酸侧链的氧原子通过亲核攻击打断，从而催化了蛋白底物的水解反应。全文摘要本发明涉及食线虫真菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶晶体结构，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明用食线虫真菌刀孢轮枝菌(Lecanicilliumpsalliotae，YMF1.00112)及淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus，M-14)进行液体培养，将发酵液进行硫酸铵分级沉淀。将具蛋白酶活性部分用缓冲液溶解，即获得粗酶液。将粗酶液进行阳离子交换层析和分子筛纯化。获得纯酶以后进行浓缩处理以获得较高浓度的酶溶液。将高浓度的酶溶液进行悬滴气相扩散结晶。结晶条件通过试剂盒筛选。得到的晶体在X光机上衍射并收集足够多张衍射图片。用HKL2000处理衍射图片，并用O，ccp4等软件解析和优化蛋白结构。本发明首次报道了食线虫真菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶的晶体结构，为提高蛋白酶的水解活性和食线虫真菌的侵染能力奠定了基础。文档编号C12N9/58GK101434945SQ20081005898公开日2009年5月20日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者娄智勇,孟照辉,张克勤,杨金奎,梁连铭,饶子和申请人:云南大学