专利名称：厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种反硝化细菌筛选用培养基及筛选反硝化细菌的方法。
技术背景现有厌氧反硝化细菌的分离周期较长，同时不易获得纯菌株，即使获得了 菌株，也没有很好的硝酸盐和亚硝酸盐的降解效果。 发明内容本发明的目的是为了解决现有的厌氧反硝化细菌分离困难、分离周期长， 最后分离到的菌株反硝化效能低的问题，提供了一种厌氧反硝化细菌筛选用培 养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法。本发明厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选用培养基和固体筛选用培养基两种；每升液体筛选用培养基是由3.0~5.0g KN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01 0.06g MgS04'7H20、 1.0~3.0g K2HP04、8 15g酒石酸钾钠、0.5 2g KH2P04、 0.1 2gFeCl2'6H2O、 0.1~2g CaCl2'2H20、 0.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水 组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5;每升固体筛选用培养基是由3.0 5.0g KN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01~0.06g MgS04'7H20、 1.0 3.0g K2HP04、 8~15g 酒石酸钾钠、0.5~2gKH2PO4、 0.1 2gFeCl2.6H2O、 0.1~2g CaCl2.2H20、 10~15g 琼脂粉、0.05~0.4mL浓度为0.2 0.4g/L的刃天青溶液、0.3~0.8g L-半胱氨酸和 余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。本发明的液体培养基和固体培养基均处于厌氧状态。本发明厌氧反硝化细菌的筛选方法是按下述步骤实现的 一、配制上述的 厌氧反硝化细菌液体筛选培养基和固体筛选培养基；二、取厌氧去除氮工艺的 污水或活性污泥，在厌氧条件下进行倍比稀释；三、固体培养基分离将步骤 一配制固体筛选用培养基在沸水浴中融化，然后冷却至45 55。C，迅速将步骤 二稀释的污水或活性污泥用注射器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及"滚 管"方法在冷水中混合，然后放入恒温培养箱中在厌氧、35 38。C条件下培养，直至长出菌落；四、液体培养基富集挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一 配制的液体筛选用培养基，厌氧环境下培养7天 14天；五、分离纯化；六、 重复步骤三至五操作进行多分离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的 纯菌株性能检测，选取厌氧反硝化性能优异的菌株，即完成对厌氧反硝化细菌 菌株的筛选。本发明整个筛选过程在厌氧条件下进行。步骤三中冷水的水温为l(TC。 步骤五中分离纯化是对液体培养富集的菌液进行镜鉴以及革兰氏染色，去除重 复菌株。本发明采用滚管培养固体筛选用培养基、进行多次的分离纯化，在厌氧条 件下，縮短了培养周期，获得厌氧反硝化细菌菌株的同时减少工作量。本发明 筛选的厌氧反硝化细菌对N(V的最高去除率达到了 47.1%。
图1是F1菌单株原子力扫描电镜照片。图2是F1菌对硝酸盐的去除率曲 线图，-"代表NCV的浓度变化，4-代表N03'的浓度变化，-x-代表N(V的去 除率。图3是F1菌对硫酸盐的利用率的曲线图。图4是具体实施方式
九中Fl 菌株和相近的菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式中厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选 用培养基和固体筛选用培养基两种；每升液体筛选用培养基是由3.0~5.0gKN03、 3.0~5.0g NaN03、 0.01~0.06g MgS04'7H20、 1.0~3.0g K2HP04、 8~15g 酒石酸钾钠、0.5~2gKH2PO4、 0.1~2gFeCl2'6H2O、 (U 2gCaCl2'2H20、 0.3 0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5;每升固 体筛选用培养基是由3.0~5.0g KN03 、 3.0~5.0g NaN03 、 0.01~0.06g MgS04.7H20、 1.0~3.0gK2HPO4、 8 15g酒石酸钾钠、0.5~2gKH2P04、 0.1 2g FeCl2.6H20、 0.1~2g CaCl2.2H20、 10~15g琼脂粉、0.05~0.4mL浓度为0.2 0.4g/L 的刃天青溶液、0.3 0.8gL-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基 的pH值为7.5。本实施方式的液体培养基和固体培养基均处于厌氧状态。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同的是每升液体筛选用 培养基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03gMgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 10g 酒石酸钾钠、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2.6H2O、 0.2gCaCl2.2H20、 0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5。 本实施方式的液体培养基处于厌氧状态。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是每升固体筛选用 培养基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5gK2HPO4、 10g 酒石酸钾钠、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2'6H2O、 0.2gCaCl2.2H20 、 12g琼脂粉、 0.1mL浓度为0.2g/L的刃天青溶液、0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固 体筛选用培养基的pH值为7.5。本实施方式的固体培养基处于厌氧状态。
具体实施方式
四本实施方式中厌氧反硝化细菌的筛选方法整个筛选过程 在厌氧条件下进行，方法是按下述步骤实现的 一、配制如权利要求l所述的 厌氧反硝化细菌液体筛选培养基和固体筛选培养基；二、取厌氧去除氮工艺的 污水或活性污泥，在厌氧条件下进行倍比稀释；三、固体培养基分离将步骤 一配制固体筛选用培养基在沸水浴中融化，然后冷却至45 55"C，迅速将步骤 二稀释的污水或活性污泥用注射器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及"滚 管"方法在冷水中混合，然后放入恒温培养箱中在厌氧、35 38"C条件下培养， 直至长出菌落；四、液体培养基富集挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一 配制的液体筛选用培养基，厌氧环境下培养7天 14天；五、分离纯化；六、 重复步骤三至五操作进行多分离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的纯菌株性能检测，选取厌氧反硝化性能优异的菌株，即完成对厌氧反硝化细菌 菌株的筛选。本实施方式步骤一中采用蒸煮方法配制液体培养基，在蒸煮过程中通入高纯氮气(高纯氮气中氧气浓度^2ppm)以驱除氧气，同时向培养基中加入还原 剂(L-半胱氨酸)，利用其还原作用去除氧，降低氧化还原电位，使氧化还原 电位(ORP)低于-100mV，由此液体培养基处于厌氧状态。本实施方式在步 骤一中采用蒸煮方法配制固体培养基，在煮沸之前，需不断搅拌，防止琼脂凝 固在锅底。在煮沸之前加入0.2%的刃天青溶液(指示剂)待培养基煮沸后，加入L-半胱氨酸0.5g，通入高纯氮气驱氧30min，然后在12rC条件下灭菌 20min。本实施方式中将厌氧工艺的污水或活性污泥的水样注入到经灭菌的含有 高纯氮气的厌氧管中；水样需在4'C下保存。根据样品的具体情况可以进行厌 氧的倍比稀释。经检测，本实施方式对NO,最高去除率达到了47.in/c)。而且本实施方式 筛选的菌株不进行硫酸盐还原。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四不同的是步骤三中菌落的 培养温度为36'C。其他与具体实施方式
四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
四不同的是步骤三中菌落的培养温度为37°C具体实施方式
七:本实施方式与具体实施方式
四不同的是步骤三中冷水的水温为10°C。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
四不同的是步骤五中分离纯化是对液体培养富集的菌液进行镜鉴以及革兰氏染色，去除重复菌株。
具体实施方式
九本实施方式污水选取大庆油田四厂杏九联合污水处理站。微生物分子生态学手段证实污水中有厌氧反硝化功能细菌，进行厌氧管的采样。采用具体实施方式
四中方法进行筛选。将本实施方式的筛选菌株标号为F1，对其进行下述试验 1、对F1菌株形态和生理生化鉴定本实施方式筛选的厌氧反硝化细菌菌体大小为宽0.20 0.4|imx长 3.0 4.0^m;菌体形态短杆，极生鞭毛；生长温度为20 40°C,生长pH值为 7.5，葡萄糖氧化发酵发酵产酸:平板菌落呈白色、圆形且表面隆起；水处理除污菌株生理生化指标接触酶 + 淀粉水解 -油脂水解 +乙酰甲基醇 -甲基红+明胶液化产u引哚+尿素水解柠檬酸盐利用+葡萄糖发酵硝酸盐还原+果糖发酵产硫化氢+乳糖发酵产氨试验+蔗糖发酵革兰氏染色G-乙醇发酵，石蕊牛奶检测石蕊还原、牛奶凝固。2、 Fl菌株的系统发育分析，基于F1菌株和相近的菌株16S rDNA序列 构建的NJ系统发育树如图4所示，经测序后获得1398bp的16S rDNA序列， GenBank登录号为DQ450463，采用邻接法(NJ)构建系统进化树。系统发育树 15个菌株的平均遗传距离为0.085。系统进化表明，Fl菌株的16SrDNA序列 与C7o^n^wm 6wOWcww(AY442812)的相似性为99°/。，结合菌株的形态学和生 理学特性，初步鉴定C7o欲Wwm ^0/n'cwm Fl。3、对本实施方式筛选的厌氧反硝化细菌对N02—、 N(V、 SC^浓度变化 的影响以及对N(V去除率的验证，验证方法如下室内配置改良的筛选用培养基，在接种量为5%的条件下每2411取样，离 子色谱测量N(VN02-和SO^的浓度，由图2(Fl菌对硝酸盐的去除率曲线图) 可知本实施方式筛选的菌株的N03'浓度变化范围是从初始的6220.87mg/L，降 低到3290.82mg/L，在第3天的时候，去除率有了大幅增加，为39.17%。最高 去除率达到了47.1%。而N(V浓度变化不大，整个过程中最高为580.32mg/L。 可知本实施方式筛选的菌株具有反硝化功能。由图3 (Fl菌对硫酸盐的利用率 的曲线图)可知菌株在反硝化过程中，筛选用培养基中SO^的浓度变化范围 从25.73mg/L到31.38m^L，可认为本实施方式筛选的菌株不进行硫酸盐还原。 可以确定该菌株应该是厌氧反硝化细菌。
权利要求
1、厌氧反硝化细菌筛选用培养基，其特征在于厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选用培养基和固体筛选用培养基两种；每升液体筛选用培养基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06g MgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2g FeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5；每升固体筛选用培养基是由3.0～5.0g KNO3、3.0～5.0g NaNO3、0.01～0.06gMgSO4·7H2O、1.0～3.0g K2HPO4、8～15g酒石酸钾钠、0.5～2g KH2PO4、0.1～2gFeCl2·6H2O、0.1～2g CaCl2·2H2O、10～15g琼脂粉、0.05～0.4mL浓度为0.2～0.4g/L的刃天青溶液、0.3～0.8g L-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。
2、 根据权利要求1所述的厌氧反硝化细菌筛选用培养基，其特征在于每 升液体筛选用培养基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 lOg酒石酸钾钠、1.0gKH2PO4、 0.5g FeCl2'6H20、 0.2g CaCl2'2H20、 0.5gL-半胱氨酸和余量的蒸馏水组成，液体筛选用培养基的pH值为7.5。
3、 根据权利要求1所述的厌氧反硝化细菌筛选用培养基，其特征在于每 升固体筛选用培养基是由2.0gKNO3、 2.0gNaNO3、 0.03g MgS04'7H20、 0.5g K2HP04、 lOg酒石酸钾钠、1.0gKH2PO4、 0.5gFeCl2'6H2O、 0.2gCaCl2.2H20 、 12g琼脂粉、0.1mL浓度为0.2g/L的刃天青溶液、0.5g L-半胱氨酸和余量的蒸 馏水组成，固体筛选用培养基的pH值为7.5。
4、 利用权利要求1所述筛选用培养基的厌氧反硝化细菌的筛选方法，整 个筛选过程在厌氧条件下进行，其特征在于厌氧反硝化细菌的筛选方法是按下 述步骤实现的 一、配制如权利要求1所述的厌氧反硝化细菌液体筛选培养基 和固体筛选培养基；二、取厌氧去除氮工艺的污水或活性污泥，在厌氧条件下 进行倍比稀释；三、固体培养基分离将步骤一配制固体筛选用培养基在沸水 浴中融化，然后冷却至45 55。C，迅速将步骤二稀释的污水或活性污泥用注射 器注入固体培养基中，采用Hungate厌氧及"滚管，，方法在冷水中混合，然后放 入恒温培养箱中在厌氧、35 38。C条件下培养，直至长出菌落；四、液体培养 基富集挑取步骤三培养的单菌落接种到步骤一配制的液体筛选用培养基，厌氧环境下培养7天 14天；五、分离纯化；六、重复步骤三至五操作进行多分 离纯化，直至获得纯菌株；七、对步骤六得到的纯菌株性能检测，选取厌氧反 硝化性能优异的菌株，即完成对厌氧反硝化细菌菌株的筛选。
5、 根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤 三中菌落的培养温度为36°C。
6、 根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤 三中菌落的培养温度为37。C。
7、 根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤 三中冷水的水温为l(TC。
8、 根据权利要求4所述的厌氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于步骤 五中分离纯化是对液体培养富集的菌液进行镜鉴以及革兰氏染色，去除重复菌 株。
全文摘要
厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法，它涉及一种反硝化细菌筛选用培养基及筛选反硝化细菌的方法。本发明解决了现有的厌氧反硝化细菌分离困难、分离周期长，最后分离到的菌株反硝化效能低的问题。厌氧反硝化细菌筛选用培养基分液体筛选用培养基和固体筛选用培养基两种。菌株的筛选一、取污水或活性污泥；二、配制筛选用培养基；三、固体培养基分离；四、液体富集；五、重复三至四的操作；六、功能验证；选取性能优异的菌株即可。本发明筛选的菌株能去除硝酸盐，且去除率高。筛选用培养基的针对性强。本发明方法简单有效、分离快速、培养周期短、工作效率高，并筛选出目前筛选不到的污水处理性能优异的菌株。
文档编号C12Q1/04GK101402990SQ200810064948
公开日2009年4月8日 申请日期2008年7月18日 优先权日2008年7月18日
发明者吕晓磊, 伟 孙, 博 王, 放 马, 利 魏 申请人:哈尔滨工业大学