专利名称：一种基于绝缘体上硅结构的细胞分离微芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于细胞筛选分离的微芯片，具体涉及基于绝缘体上硅(SOI)结构
的细胞分离微芯片。
背景技术：
生物细胞通过融合可以形成新的细胞，在现代生物医学工程基础领域有着重要的意 义。融合后细胞的筛选、分离，是对融合细胞进行进一步的培养的前提，能够对融合后 样品进行有效的筛选分离对于细胞融合而言具有极其重要的意义。目前能实现细胞筛选、 分离的方法很多，如荧光分离，直流电场偏转，光钳，显微操作等等。这些方法通常都 需要复杂的结构或者精细的操作，实现起来相当困难，对细胞的伤害也较大，试验效果 欠佳，难以推广。
当两个同源细胞发生融合时，在细胞内部物质发生外流较小的情况下，融合后几个
小时内，细胞体积会变为原来的2倍，根据r=￥;r/"3/3,细胞的直径会变为原来的120% 左右，20%的直径差异在光纤检测中可以被明显检出。
同时，生物细胞处于非均匀电场中时，被电场激化形成偶极子，该偶极子在非均匀 电场作用力下发生运动，即介电电泳(dielectrophoresis)，利用电介质电泳可以控制细胞 的运动，在细胞通过微通道的过程中，检测通过细胞是否为融合细胞，利用电介质电泳 现象控制细胞的左右偏转运动，完成细胞的筛选、分离工作。
光学检测与介电力偏转均为非接触操作，作用时间短，不会对细胞产生较大的伤害， 从而保证了细胞的活性。
目前国内在细胞分离芯片研究开发较少，现有的细胞分离芯片一方面在检测时很难 做到不添加加任何染料或荧光材料(这些对细胞都会有所伤害，影响细胞的生物活性)； 另一方面，微电极产生的电场强度和电场梯度比较弱，在细胞的精确控制方面显得比较 弱，而且加工材料选择方面抗腐蚀、抗氧化能力也较弱，本发明能较好解决以上问题。
国内外相关专利如下
200410017098.8， 2004年，复旦大学，孔继烈等； 200510076662.8， 2005年，中国科学院电子学研究所，崔大付等； 200510012106.4， 2005年，中国科学院电子学研究所，崔大付等；200480014316.0， 2004年，日东电工株式会社，栗津邦男等； 200480007421.1, 2004年，日本电气株式会社，佐野亨等; 03818586.5, 2003年，日本电气株式会社，饭田一浩等； 200410077992.4, 2004年，清华大学，罗国安等
200510023895.1， 2005年，中国科学院上海微系统与信息技术研究所，金庆辉等； 20080025888, 2008年，Gotzen，Reiner; 20020079219， June 27， 2002， ZhaoMingqi; 20020055167， May 9， 2002， Pourahmadi,Farzad; 20060116741， Junel, 2006, Palanker，Daniel V.;
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提出了一种基于绝缘体上硅(SOI)结构的细胞分 离微芯片，使其结构简单，提高细胞电融合率，保证细胞筛选、分离的实现与精确控制， 减小对融和后细胞的物理损伤，提高其存活能力。
本发明的技术方案如下
一种基于绝缘体上硅(SOI)结构的细胞分离微芯片，该芯片由相互结合的两层组成， 第I层为通道层，第II层为盖板层；
所述通道层是在SOI硅片上使用MEMS工艺刻蚀凹槽而形成的微结构，这些微结构 分别是微通道、通过微通道依次连接的样品池、鞘流液池、废液池、融合细胞液池、光 纤凹槽和微电极对结构；所述的微通道、样品池、鞘流池、融合细胞池、废液池相互独 立，又共同连接，共同构成流路系统。
所述光纤凹槽与微通道垂直布置并连通，并在光纤凹槽内沿微通道左右对称布置光 纤，检测流经微通道的细胞溶液，通过光纤获取细胞体积信息，从而判别细胞是否为融 合细胞；
所述微电极对分别设置在融合细胞液池的入口处，通过键合点与外围电路相连接， 引入外围电信号，在微电极对上施加交流电信号，使细胞发生偏转，控制细胞的运动， 从而实现细胞的筛选分离。
所述盖板层采用玻璃、PMMA和PDMS绝缘类芯片加工材料，在盖板层上在与通道 层上的样品池、鞘流液池、废液池、融合细胞液池对应位置分别加工有样品液进样口、 鞘流液进样口、废液出样口和融合细胞液出样口与外界管道相连接。
所述的通道层使用SOI硅片材料，底部硅材料提供芯片支撑，中间层Si02为绝缘层
材料，表层50pm厚度的硅片材料上刻蚀凹槽形成微结构。
通道层上的鞘流液池布置在连接样品池与融合细胞液池的微通道的侧边，通过鞘流 微通道以(30°~90°)夹角连接主微通道，两个鞘流液微通道以主微通道为对称轴对称， 鞘流通道里流动的是不含有细胞的鞘流液，主微通道贯穿整个芯片，连通样品池与废液 池，鞘流通道宽度为30pm~200nm，长度及其与微通道的夹角根据试验对象细胞进行调 整。通道层上的废液池与两个融合细胞液池呈品字形分布，融合细胞液池通过连接通道 以40。夹角与主微通道相连。
所述的通道层上的主微通道宽度为8(Him 10(^m，长度根据试验对象细胞进行调整。 所述的光纤凹槽宽度为125拜，凹槽深度为50^m，长度根据芯片大小决定，需要贯 穿芯片。
所述微电极对为5(Vm高的圆柱状，直径^100拜，或为100pm X 100pm方柱状结构。
所述的盖板层上与通道层上光纤凹槽相对应的位置上也刻蚀光纤凹槽，光纤凹槽与 通道层上光纤凹槽尺寸一致，深度为75拜，通道层和盖板层上的相对应的光纤凹槽上下 相扣，形成125Mm宽和125nm深的光线通道，用于放置光纤，形成光学检测通路。
本芯片由微通道、样品池等形成单向的流动通路，微通道畅通，用于样品(细胞悬 液或者溶液)流动，光纤提供了光学检测通路，微电极对实现了细胞筛选，通过光纤获 取包含细胞体积的光散射信息，由此判别细胞是否为融合后细胞，进而控制外部电路经 微电极对结构向检测细胞施加电信号，控制细胞向融合细胞液池和废液池的流动，使细 胞发生偏转，从而实现细胞的分离。根据所检测细胞选定鞘流液通道及主通道尺寸后， 芯片内部液体的流动速度由外部泵及阀门(这两个结构属于芯片外围配套结构，不属于 芯片本身)控制。
本发明提出的细胞电融合的微电极阵列芯片结构具有以下优点
(1) 结构简单，加工工艺成熟，成本低廉，容易推广；
(2) 采用MEMS加工技术可以实现微电极对的精密加工，保证细胞筛选、分离的实 施与精确控制；
(3) 利用电场对生物活细胞进行非接触的筛选、分离操作，实现细胞的自动分离， 减小对融和后细胞的物理损伤，提高生物活细胞的生存率。
本芯片可以用于在微芯片结构中进行不同大小的生物活细胞或者非生物颗粒(如聚 苯乙烯颗粒，可以吸附生物大分子)的筛选和分离。
图l是微芯片剖面示意图。
图2是微芯片通道层俯视示意图。
图3是盖片层俯视示意图。
具体实施例方式
实施例l:
参见图l、 2和3，微芯片由相互结合的两层组成，第I层为通道层l,第II层为盖 板层2。通道层是在SOI硅片上采用MEMS加工技术刻蚀凹槽形成微结构，通道层1上 有主微通道3、连接主微通道与融合细胞池的微通道9、鞘流液通道IO、样品池4、鞘流 液池5、废液池16、融合细胞池6、光纤凹槽7和微电极对8结构，通道层1上的样品 池4用于筛选前样品液的储存；主微通道3、微通道9和鞘流液通道10保持畅通，用于 样品(细胞悬液或者溶液)流动，位于光纤凹槽7中的光纤提供光学检测通路；微电极 对8实现细胞筛选。盖板层2用聚合物PDMS制成，上面加工有与样品池4、鞘流池5、 废液池16、融合细胞液池6相对应的样品液进样口 11、鞘流液进样口 12、融合细胞液 出样口 15、废液出样口 14，并与外界管道相连接。光纤凹槽13与微通道层上光纤凹槽 7相吻合形成总的光纤凹槽。通过光纤获取细胞体积信息，从而判别细胞是否为融合后 细胞，根据此信息在微电极对8上施加交流电信号，使细胞发生偏转，从而实现细胞的 分离。
两层结合前，先把通道层1表面清洁后，水平放置，微通道朝上。然后把盖板层2 用等离子处理30秒钟，然后朝下覆盖在通道层1上，两层基片通过物理作用紧密结合在 一起。通道层1上的光纤凹槽7和盖板层2上的光纤凹槽13相对应，盖板层2上的样品 液进样口 11、鞘流液进样口 12、融合细胞液出样口 15、废液出样口 14与通道层1上的 样品池4、鞘流池5、废液池6相对应，与微通道3共同构成流路系统。通过外围流路控 制系统控制微通道内部流速。微电极对8通过引线与外围电路相连接，引入外围电信号， 以实现细胞的筛选分离。
整个芯片的尺寸为30 (长)x20(宽)x3(高)mm，主微通道3、连接主微通 道与融合细胞池的微通道9、鞘流液通道10的深度为50 pm，为矩形，长度、宽度可根 据需要进行调整。样品池4、鞘流池5、废液池6均为边长2 mm的正方形，深度是50 pm。
所有样品液进样口 U、鞘流液进样口 12、融合细胞液出样口 15、废液出样口 14的边长 均为lmm。微电极对8俯视为正方形，其边长为50pm，高度为50 pm，微电极对中的 两个电极间距为100 pm。
该芯片中的细胞筛选分离过程为待分离样品液经样品液进样口 11进入样品池4中； 缓冲液通过鞘流液进样口 12进入鞘流池5;在外围流路控制系统的作用下，混合液进入
微通道中形成单细胞流，流速由外围电路及通道宽度控制；当单细胞液流经光纤检测位 置时，光学检测通路检测流过细胞是否为融合后细胞，利用检测结果控制外围电路，施 加电刺激信号于正确的微电极对上，筛选的方式为当光学检测通路检测到通过为融合后 细胞时，施加电刺激信号于融合细胞池口处微电极对上，利用介电力吸附细胞于其中， 随后靠液体的流动让融合后细胞进入融合细胞池中；当检测到通过细胞不是融合细胞时，
在废液池口处的微电极对上施加电刺激信号，偏转细胞使其进入废液池中。
权利要求
1.一种基于绝缘体上硅结构的细胞分离微芯片，该芯片由相互结合的两层组成，第I层为通道层(1)，第II层为盖板层(2)；其特征在于所述通道层是在SOI硅片上刻蚀凹槽而形成的微结构，这些微结构分别是微通道、通过微通道依次连接的样品池(4)、鞘流液池(5)、废液池(16)、融合细胞液池(6)、光纤凹槽(7)和微电极对(8)结构；所述光纤凹槽(7)与微通道垂直布置并连通，并在光纤凹槽内沿微通道左右对称布置光纤，检测流经微通道的细胞溶液，通过光纤获取细胞体积信息，从而判别细胞是否为融合细胞；所述微电极对(8)分别设置在两个融合细胞液池(6)的入口处，通过键合点与外围电路相连接，引入外围电信号，在微电极对上施加交流电信号，使细胞发生偏转，从而实现细胞的分离；所述盖板层采用玻璃、PMMA或PDMS绝缘类芯片加工材料，在盖板层上与通道层上的样品池(4)、鞘流液池(5)、废液池(16)、融合细胞液池(6)对应位置分别加工有样品液进样口(11)、鞘流液进样口(12)、废液出样口(14)和融合细胞液出样口(15)，与外界管道相连接。
2. 根据权利要求l所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在于 所述的通道层(1)使用SOI硅片材料，底部硅材料提供芯片支撑，中间层Si02为绝缘 层材料，表层50pm厚度的硅片材料上刻蚀凹槽形成微结构。
3. 根据权利要求1或2所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在 于所述的通道层(1)上的鞘流液池(5)布置在连接样品池(4)与废液池(6)的主 微通道(3)侧边，通过鞘流液微通道(10)呈角度连接主微通道(3),两个鞘流液微通 道(10)以主微通道(3)为对称轴对称，鞘流通道里流动的是不含有细胞的鞘流液。
4. 根据权利要求1或2所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在 于所述的通道层(1)上的废液池(6)与两个融合细胞液池(16)呈品字形分布，融 合细胞液池(16)通过连接通道(9)以40。夹角与主微通道(3)相连。
5. 根据权利要求4所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在于 所述的通道层(1)上的主微通道(3)宽度为80^m 10(^m，长度根据试验对象细胞进 行调整。
6. 根据权利要求3所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在于 所述的通道层(1)上的鞘流通道(10)宽度为30拜 200nm，长度及其与微通道的夹角 根据试验对象细胞进行调整。
7. 根据权利要求1或2所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在 于所述的光纤凹槽(7)的宽度为125pm，凹槽深度为50pm，贯穿芯片。
8. 根据权利要求1或2活所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征 在于所述微电极对(8)为50pm高的圆柱状，直径01OO拜，或为lOOnm X IOO拜方柱状结构。
9. 根据权利要求1或2所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在 于所述的盖板层(2)上与通道层上光纤凹槽(7)相对应的位置上也刻蚀光纤凹槽(13)， 光纤凹槽(13)与通道层上光纤凹槽(7)尺寸一致，深度为75拜，通道层和盖板层上 的相对应的光纤凹槽上下相扣，形成125pm宽和125^m深的光线通道，用于放置光纤，形成光学检测通路。
10. 根据权利要求5所述的基于绝缘体上硅结构的细胞分离的微芯片，其特征在于 所述的芯片上的主微通道(3)的截面为梯形或矩形。
全文摘要
本发明提出了一种基于绝缘体上硅结构的细胞分离微芯片，该芯片由相互结合的两层组成，第I层为通道层，第II层为盖板层。通道层在SOI硅片上刻蚀凹槽形成微结构，通道层上有微通道、储液池、光纤凹槽和微电极对结构，通道层上的储液池用于筛选前后样品液及鞘流液的储存；微通道畅通，用于样品(细胞悬液或者溶液)流动；光纤提供光学检测通路；微电极对实现细胞筛选。盖板层上的进样、出样口与外界管道相连接。通过光纤获取细胞体积信息，判别细胞是否为融合后细胞，相应地在微电极对上施加交流电信号，使细胞发生偏转，从而实现细胞的分离。该芯片利用电场对生物活细胞进行非接触的筛选、分离操作，提高生物活细胞的生存率，结构简单，加工方便，成本低廉。
文档编号C12Q1/04GK101343656SQ200810070158
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月22日 优先权日2008年8月22日
发明者侯文生, 廖彦剑, 军 杨, 静 杨, 宁 胡, 蓉 许, 郑小林, 阴正勤 申请人:重庆大学