专利名称：：一种高效絮凝浓缩微生物细胞的技术的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物
技术领域：
，更具体涉及一种高效絮凝浓縮微生物细胞的技术。
背景技术：
：微生物菌剂无药残，无污染，能改善微生态环境，促进生物生长，提高养殖经济效益，因而近年来在农业生产、水产养殖中应用得到高度的重视。目前，菌剂的生产有液体制剂和固体菌剂。粉状菌剂具有运输方便等优点，但存在生产成本较高或菌剂干燥过程细胞存活率低的不足如将菌液经真空冷冻干燥，虽然存活率高但是成本也高，采用热处理法除去水分的菌种存活率较低；液体菌剂如使用菌种发酵液则存在细胞浓度较低，运输负荷大、菌剂性状不稳定等缺点，而采用细胞浓缩的办法研制制剂可使其大大降低运输负荷，并有生产工艺简单，设备投入少等优点，因此，采用浓縮细胞是一种较好的生产应用菌剂的方法。现有市场上光合细菌的细胞絮凝制剂较多，但酵母菌的絮凝浓縮制剂较少。从细胞絮凝技术看，有的采用离心或滤膜过滤进行菌液的浓缩，有的以壳聚糖、明矾等作为絮凝剂进行细胞浓縮。对于采用海藻酸钠进行细胞絮凝制备高浓度的浓縮制剂，以及在细菌与酵母菌的多菌种发酵液中进行细胞絮凝制备其浓縮制剂的技术还未有研究报道。
发明内容本发明的目的是提供一种高效絮凝浓縮微生物细胞的技术，该技术采用海藻酸钠溶液作为絮凝浓縮溶液，用量少，成本低，操作简单，得到的发酵液的絮凝细胞得率可达90%以上，获得的菌剂生物活性高，菌剂生产、保藏、运输和使用方便，有利于大规模推广应用，具有较好的经济效益。本发明的高效絮凝浓縮微生物细胞的技术，其特征在于所述技术为将海藻酸钠配制成30g/L40g/L的溶液，按溶液中海藻酸钠固体的质量为发酵液体积0.15%0.2%添加量添加到细菌或酵母菌的单一菌种或多菌种发酵液中，搅拌均匀后静置使细胞絮凝沉降，所述絮凝条件为所用的细胞絮凝沉降容器的径高比》1:2，温度3(TC35'C和在避光条件下絮凝1620小时。本发明的显著优点是采用海藻酸钠作为细菌或酵母菌的单一菌种或多菌种发酵液的絮凝剂。海藻酸钠(C6H70sNa)n是一种天然多糖，主要由海藻酸的钠盐组成，为a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1，4-糖苷键连接并由不同GGGMMM片段组成的共聚物。海藻酸钠具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性的特点，广泛应用于食品工业、制药、牙科和其它工业。海藻酸钠粉末遇水变湿，微粒的水合作用使其表面具有粘性，以此吸附微粒周围的物质形成团块沉降。利用海藻酸钠絮凝细胞其添加量少，细胞得以有效浓缩，细胞絮凝得率可达90%以上，而且操作简单，对菌剂生产、保藏、运输和使用均有便利。具体实施例方式具体步骤为(1)海藻酸钠的糊化溶解按照所需浓度的海藻酸钠溶液，称取海藻酸钠于蒸馏水中，将其放置于8(TC10(TC水浴锅中，边加热边搅拌，使海藻酸钠充分溶解出现均匀的糊状，取出置于室温下自然冷却备用；(2)细菌、酵母菌单一菌种或混合菌种的培养将细菌或酵母菌单一菌种或它们的多菌种进行培养，收获高生物量细胞的发酵液；(3)海藻酸钠絮凝发酵液中微生物细胞将海藻酸钠溶液按溶液中海藻酸钠固体的质量为发酵液体积的0.15%0.2%添加到细菌或酵母菌单一菌种或多菌种发酵液中；充分搅拌后倒入径高比大于或等于1:2的近似圆柱体容器中，置于3(TC35"C温度避光下静置1620小时使细胞絮凝沉降。(4)絮凝浓缩细胞的获得絮凝结束后用导管虹吸法将发酵液上层清液抽去，并根据浓縮需要将细胞浓縮成所需浓度的浓縮菌剂。本发明采用海藻酸钠作为絮凝剂，其絮凝技术适用于从细菌、酵母菌单一菌种或它们的多菌种发酵液中进行细胞絮凝研制其浓縮菌剂。本发明的技术对细菌与酵母菌适用。细菌-红螺菌科光合细菌类(荚膜红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、球形红假单胞菌、胶质红假单胞菌等)、芽孢杆菌类(枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等)、酵母菌(假丝酵母菌、酿酒酵母菌等)。对于选用海藻酸钠及剂量具有的优势由以下比较试验进行说明1.不同絮凝剂对比试验将海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶分别按0.2%的添加量添加到由地衣芽孢杆菌、光合细菌和假丝酵母菌的多菌种发酵液中，混合静置相同时间，取底层10%或1%等不同浓縮比的液体为浓縮液，浓縮细胞制剂以平板菌落计数法测定各种菌的细胞数量，以絮凝细胞得率为指标获得絮凝剂的优化种类。由实验结果(表l)表明，海藻酸钠是较好的絮凝剂。表1添加不同絮凝剂的浓縮液中各菌种的细胞絮凝得率海藻酸钠阿拉伯胶明胶地衣芽孢杆菌、96.2%62.7%60,3%光合细菌89.7%59.8%58.6%假丝酵母80.3%73.5%74.2%2.海藻酸钠絮凝剂不同用量对比试验海藻酸钠絮凝剂按不同添加量(0.1%、0.2%、0.3%)进行多菌种发酵液的细胞絮凝，絮凝浓縮液分别进行细胞计数测定，以絮凝细胞得率为指标优化海藻酸纳添加量。表2结果表明，海藻酸钠添加量0.2%时细胞絮凝得率高。而后为减少絮凝剂使用剂量，又增设海藻酸钠添加O.15%进行枯草杆菌、地衣芽孢杆菌发酵液的单菌种浓縮试验，结果细胞絮凝得率均为92%左右，海藻酸钠添加0.15%对表中所示的3种菌进行细胞絮凝，其效果与添加0.2%的较为相近。为此，选择海藻酸钠适宜的用量为0.15%~0.2%，根据反复试验表明，单一菌种细胞絮凝海藻酸钠添加量0.15%即可，对多菌种细胞絮凝海藻酸钠添加量还为0.2%较好。表2添加不同剂量海藻酸钠的浓縮液中各菌种的细胞絮凝得率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.不同絮凝条件的对比试验采用正交试验优化絮凝条件设定细胞絮凝时的光线(避光、室内自然光)、容器径高比(1:1、1:1.5、1:2)和温度(15。C、25°C、35°C)进行9个正交实验组(3种菌发酵液)的絮凝试验(实验及结果略)，后测定细胞数量，以絮凝细胞得率为指标，并采用方差分析各因素的显著性。由正交试验的方差分析(表3)结果可知，絮凝条件中容器径高比对3种菌的絮凝影响都具显著性；光线对菌种絮凝没有影响(即室内自然光或避光下都可以很好絮凝)，温度对细菌的絮凝有一定影响，一般温度低不利于细胞絮凝，温度较高有利于细胞絮凝。为此，优化细胞絮凝最重要的条件是容器径高比容器径高比为1:2细胞絮凝快且效果好，如容器径高比为l:l或l:i.5均不利于菌种絮凝沉降。对于其他条件，为方便操作，在絮凝过程中保持3CTC35'C温度下可将容器放置于室内自然光下絮凝即可。表3絮凝正交试验方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>径高比574.312287.1641.98林误差e19.4829.74--误差eA27.3546.84--光照A9.1324.56--地衣芽孢杆菌温度64.39232.207,61径高比606.672303.3471.71**注F005(2，4)=6.94，F",(2,4)=18,0，F001(2，6)=10.92**表示显著，*表示有--定的影响。以下通过实施例进一步阐述本发明，但是本发明不仅限以此。实施例1)絮凝剂液体制备-称取海藻酸钠80克置于2L水中，在9(TC水浴条件使絮凝剂糊化溶解，此时絮凝剂成糊状冷却备用。2)光合细菌单一菌种絮凝将光合细菌母种按20%应用接种于40L培养基的白色聚酯塑料容器中，在253(TC下光照培养5天(呈现深红色的菌液)，后放入径高比约为1:2的白色塑料桶中，搅拌均匀并取样先进行细胞数量测定(作为对照，发酵液每毫升细胞数)，后加入糊化的海藻酸纳(每L菌液中含海藻酸纳2克)，不断均匀搅拌后，放置于室内避光条件1624小时，絮凝结束后用导管虹吸法除去上清90%液体，后将浓縮10倍的细胞并进行平板菌落计数测定，通过絮凝细胞的数量与絮凝前细胞总数量计算细胞絮凝得率。按下列公式计算得该光合细菌细胞絮凝得率为88%。公式絮凝液中菌种细胞得率(％)=絮凝液菌数量(cfu/ml)x絮凝液体积(ml)xinnox发酵液菌数量(cfWml)x发酵液体积(ml)光合细菌细胞絮凝得率(％)=1.97xl09(cfU/ml)x4xl03mlXH)0%=88%2.25xl08(cfU/ml)x4xl04ml3)多菌种发酵液的细胞絮凝本实验多菌种有3株菌种，分别是光合细菌、地衣芽孢杆菌和假丝酵母菌，具有降解水质如氨氮、亚硝基氮等作用。前期实验优化了3种菌的混合培养基配方和混合培养模式。这里举例该多菌种的细胞絮凝。具体操作在40L的混合培养基中先接种光合细菌和假丝酵母菌，培养至32小时后接种地衣芽孢菌(总接种量为10%)，继续培养至48小时收获细胞培养物，并放置于径高比约为1:2的塑料桶中，搅拌均匀后取样测定发酵液中各菌种细胞数量(作为对照)，后加入糊化的海藻酸纳溶液(每升发酵液添加2克重量的海藻酸钠)，在室内条件下静止絮凝16小时，排出上清液体90X，将4L浓縮IO倍的多菌种浓縮液震荡均匀，取样以平板菌落计数法分别测定浓缩液中各菌种的细胞数量(采用3种菌各自良好生长的培养基分别计数)，并计算各菌种的细胞絮凝得率。结果光合细菌絮凝细胞得率为89%;地衣芽胞菌絮凝细胞得率为95%;假丝酵母菌絮凝细胞的得率为88%，3种菌细胞絮凝的平均得率为90.6%。本发明利用海藻酸钠作为絮凝剂，在保证预先加热糊化的海藻酸钠溶质添加量为0.150.2%情况下，对发酵液中的细菌、酵母菌细胞都有高效的絮凝作用，并且适用于细菌和酵母菌的单一菌种与多菌种发酵液。菌种细胞絮凝浓縮倍数可以10倍、20倍甚至100倍(即浓縮液体积只占原发酵液的1/10、1/20、1/100)。使用该技术细胞絮凝得率为90%以上。由于海藻酸钠用量少，细胞得以有效浓縮，成本比粉剂干燥低，因此具有菌剂生产、保藏与运输使用便捷性的优点。权利要求1.一种高效絮凝浓缩微生物细胞的技术，其特征在于所述技术为将海藻酸钠配制成30g/L～40g/L的溶液，按溶液中海藻酸钠固体质量为发酵液体积0.15％～0.2％的添加量添加到细菌或酵母菌的单一菌种或多菌种发酵液中，搅拌均匀后静置使细胞絮凝沉降，所述絮凝条件中为絮凝沉降使用的容器径高比≥1∶2，温度30℃～35℃和在避光条件下絮凝16～20小时。2.根据权利要求1所述的高效絮凝浓縮微生物细胞的技术，其特征在于所述的微生物为细菌与酵母菌。3.根据权利要求2所述的高效絮凝浓縮微生物细胞的技术，其特征在于所述细菌为荚膜红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、球形红假单胞菌、胶质红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中的一种或几种。4.根据权利要求2所述的高效絮凝浓縮微生物细胞的技术，其特征在于所述酵母菌为假丝酵母菌或酿酒酵母菌。5.根据权利要求l、2、3或4所述的高效絮凝浓縮微生物细胞的技术，其特征在于所述技术的具体步骤为-(1)海藻酸钠的糊化溶解按照所需浓度的海藻酸钠溶液，称取海藻酸钠于蒸馏水中，将其放置于8(TC10(TC水浴锅中，边加热边搅拌，使海藻酸钠充分溶解出现均匀的糊状，取出置于室温下自然冷却备用；(2)细菌、酵母菌单一菌种或混合菌种的培养将细菌或酵母菌单一菌种或它们的多菌种进行培养，收获高生物量细胞的发酵液；(3)海藻酸钠絮凝发酵液中微生物细胞将海藻酸钠溶液按溶液中海藻酸钠固体的质量为发酵液体积的0.15%0.2%添加到细菌或酵母菌单一菌种或多菌种发酵液中；充分搅拌后倒入径高比为》1:2的近似圆柱体容器中，置于3(TC35。C温度避光下静置1620小时使细胞絮凝沉降；(4)絮凝浓缩细胞的获得絮凝结束后用导管虹吸法将发酵液上层清液抽去，并根据浓縮需要将细胞浓縮成所需浓度的浓縮菌剂。全文摘要本发明提供一种高效絮凝浓缩微生物细胞的技术，将海藻酸钠配制成30g/L～40g/L溶液，按溶液中海藻酸钠固体的质量为发酵液体积0.15％～0.2％添加量添加到细菌或酵母菌的单一菌种或多菌种发酵液中，搅拌均匀后静置使细胞絮凝沉降，所述絮凝条件中为絮凝沉降容器的径高比为≥1∶2，温度30℃～35℃和在避光条件下絮凝16～20小时。本发明技术采用海藻酸钠溶液作为絮凝浓缩溶液，用量少，成本低，操作简单，得到的发酵液的絮凝细胞得率可达90％以上，获得的菌剂生物活性高，菌剂生产、保藏、运输和使用方便，有利于大规模推广应用，具有较好的经济效益。文档编号C12R1/085GK101298603SQ200810071258公开日2008年11月5日申请日期2008年6月23日优先权日2008年6月23日发明者航谢,邱宏端,黄贵闽申请人:福州大学