专利名称：快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法
技术领域：
本发明属医学检验领域，涉及结核分枝杆菌鉴定的方法，具体涉及一种快 速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法。
背景技术：
结核分枝杆菌中有一类遗传背景相似，具有特异spoligotyping指纹图谱的菌 株，称为北京基因型菌株，这类菌株在世界各地流行(7^"&McroWo/20议箭"-"; 五werg/"/e^"/s2002;S,SW-9;J C7/".M/cra6/o/2004;42..4040-4049)。具有关统i十，自1995 年以来，北京地区的结核杆菌流行菌株中，80 90%的属于北京基因型。在中国 其它地区北京基因型菌株也广泛流行，例如宁夏(67%)，上海、广东(25%)。 北京基因型菌株与耐药的联系、北京基因型菌株在巨噬细胞中的快速增殖(iVoc Ato"c。fi 5W t/SJ 2002. 7W:站65-70; J/"/e"D/s /79.""-7)都使这类菌株吸引了 本领域研究人员的广泛关注。现行用于鉴定北京基因型菌株的标准方法采用的 Spoligotyping方法，需采用特殊的试剂和仪器，且花费多、耗时，故，不便于广 泛使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、有效、准确的鉴定结核分枝杆菌北京基因型 菌株的方法。
本发明方法采用多引物PCR对北京基因型菌株的RD105位点进行检测从而 能快速、有效、准确的鉴定其是否属于北京基因型菌株。
本发明方法针对北京基因型菌株在进化过程中基因组上出现的一个缺失片 段RD105(/VocAto"cac^c/t/S^MW;/0六站65-7ft)，进行PCR引物设计，鉴定结核 分枝杆菌基因组上是否存在该片段的缺失。所述的缺失片段RD105共缺失 3467bp;所述的引物包括Pl、 P2、 P3。
上述的引物P1为:5，-GGAGTCGTTGAGGGTGTTCATCAGCTCAGTC-3',引 物P2:为5，-CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGTCG-3，，引物P3位于所述的片段中央为GGTTGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT-3，。
本发明方法包括下述步骤
1、选取临床结核菌株，通过煮沸的方法得到粗提DNA;
2、 设计PCR引物P1、 P2和P3。
引物设计旨在鉴定结核分枝杆菌基因组上是否存在RD105片段的缺失， 采用另外的IS6110引物用于检测PCR体系中模板DNA的数目和质量。
3、 PCR反应；
4、 电泳检测PCR结果。
应用P1、 P2、 P3的多引物PCR对菌株的RD105位点进行检领ij，鉴定其是否 属于北京基因型菌株；
5、 敏感性和特异性的检测。
本发明提供了以检测RD105的缺失为目的多引物PCR (DTM-PCR)方法， 是一种快速、经济的方法，也适用于在大批量菌株中进行鉴定。经采用中国上海 的菌株评估，结果显示，本发明方法的效力与鉴定北京基因型菌株的标准方法 Spoligotyping相同。但是花费更少、耗时更短，用标准的PCR试剂和仪器就可 以轻松的用于高通量分析。
本发明方法与现有技术比较，具有如下优点 不需Spoligotyping的价格昂贵的试剂盒以及配套的杂交仪器且一次实验的 花费需要2万元左右，本方法只需要普通PCR仪器试剂，就可以进行实验。并 且，结果简单明了，易于判断，更适用于高通量的筛选北京基因型菌株基因型菌 株流行的地区，是一种用于鉴别北京基因型菌株的理想技术。
图1是RD105多引物PCR条件的优化， 其中，M: marker; Rv: H37Rv; C4:非北京基因型;A2:北京基因型； A组P1，P2,P3，IS1和IS2用于扩增产物； B组P1,P2 、 P3三条引物；
C组仅P1 、 P2两条引物；
CK:阴性对照。
图2是RD105 Multiplex-PCR检测临床菌株中北京基因型菌株，其中，利用3条引物P1、 P2 、 P3对208株临床菌株进行检测，182株北京 基因型菌株都产生了 761bp的片段，26株非北京基因型菌株产生了 1466bp的片 段；显示的A3,A4， A5, A6,B1，H1是北京基因型菌株;C5, C7, H5， J3, Kl是非 北京基因型菌株；Ck:阴性对照。
图3是182株RD105位点缺失的菌株为北京基因型菌株， 其中，与Spoligotpying相比较，RD105多引物PCR方法，在鉴别北京基因 型菌株上具有100%的敏感性，特异性为89%。
具体实施方式
实施例l
1、 选取208株临床结核菌株，通过煮沸的方法得到粗提DNA 所述结核菌株上海市疾病预防控制中心(上海市CDC) 2000至2003年的结
核分枝杆菌菌株库里随机挑选的208株临床结核菌株用于实验。通过煮沸的方法 McraWo/ 2WW,U:^/7/-_ )得到所述菌株的粗提DNA。
2、 设计PCR引物
本方法主要关注的是北京基因型菌株在进化过程中基因组上出现的一个缺失 片段，RD105，该片段共缺失3467bp。
本方法的PCR引物设计旨在鉴定结核分枝杆菌基因组上是否存在这个片段 的缺失，本方法设计了位于这个片段两侧的
弓l物Pl:5，陽GGAGTCGTTGAGGGTGTTCATCAGCTCAGTC-3，，禾口
引物P2:5，-CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGTCG-3'，同时还设计了位于片 段中央的引物P3: GGTTGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT-3 ，。
本方法采用另外的IS6110引物，(IS1: 5' - CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3' 和 IS2: 5' - GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3， ) ( E證g /"/w 衡證 200WW'7M-":736-41)用于检测PCR体系中模板DNA的数目和质量。
3、 PCR反应
反应体系总体积10ul，包含2xTaqPCR MasterMix，每条引物0.2pM，模板 DNAlpl，循环条件94。C5分钟，25个循环94。C30秒，68。C30秒、72°C 2分钟.终末延伸温度72°C延伸7分钟。4、 电泳检测PCR结果 本发明进行了如下预实验
首先，测试一株标准菌株H37Rv , —株北京基因型菌株(A2)以及一株非北 京基因型菌株(C4)(图1)，引物Pl和P2在H37Rv、 A2菌株中分别扩增出了预 期的4228bp、 761bp大小的片段(图lc)，非北京基因型菌株的C4没有得到PCR 产物，分析认为可能是通过煮沸法得到的DNA量少，长片段的PCR反应难度高 这样两个原因。因此，本方法利用引物P1、 P2、 P3重复PCR，结果H37Rv和 C4菌株均得到1446bp片段，A2菌株仍然是只有761bp大小的片段。将IS1、 IS2 加入到PCR体系中，使得产物中除去P1、 P2、 P3扩增出的产物外附加有245bp 大小的片段，用于监测模板DNA的质量(图la)。
本发明选择了 208株临床菌株，实验中没有观测到其它大小的产物，鉴定了 182株北京基因型菌株，26株非北京基因型菌株。
本方法用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离扩增的DNA片断，在电压为80V条件 下电泳45min，即可根据PCR产物的大小判断菌株是否属于北京基因型。
应用P1、 P2、 P3的多引物PCR对菌株的RD105位点进行检测鉴定其是否属 于北京基因型菌株。如产物出现预期的1466bp大小片段，认为其是非北京基因 型菌株。如果是761bp大小片段，则认为是北京基因型菌株。(图2)。
5、 对本方法的敏感性和特异性的检测。
用spoligotyping kit (Isogen Bioscience公司产品)对菌株进行Spoligotyping分 型。DNA模板( 10ng)同样通过煮沸法得到。用试剂盒的DRa和DRb两条引 物扩增(/ C//w M'croWo/ /卯^W06-》，利用含43间隔序列寡核苷酸的商品膜杂 交，根据标准步骤分析结果；
Spoligotyping对所有208株菌株进行分型，其中182株菌株具有特异的北京 基因型菌株图谱(包括19株在35—43间隔区少了一个或几个杂交条带)，剩余 的26株为非北京基因型菌株。
结果显示，本发明方法的效力与鉴定北京基因型菌株的标准方法 Spoligotyping相同。但是花费更少、耗时更短，用标准的PCR试剂和仪器就可 以轻松的用于高通量分析。补正用快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法 SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学
<120>快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法
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<170〉 Patentln version 3.1
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DNA
生物
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<211> 29
<212〉 DNA
<213> 生物
<400> 3
ggttgcccac tggtcgatat ggtggactt 29
权利要求
1、快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法，其特征是采用多引物PCR对北京基因型菌株的RD105位点进行检测，包括下述步骤1)选取临床结核菌株，通过煮沸的方法得到粗提DNA；2)设计PCR引物P1、P2和P3，采用IS6110引物检测PCR体系中模板DNA的数目和质量，引物P15’-GGAGTCGTTGAGGGTGTTCATCAGCTCAGTC-3’，引物P25’-CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGTCG-3’，引物P3GGTTGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT-3’。所述的IS6110引物是IS15’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’和IS25’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’；3)PCR反应；4)电泳检测PCR结果。应用P1、P2、P3的多引物PCR对菌株的RD105位点进行检测，鉴定其是否属于北京基因型菌株；5)敏感性和特异性的检测。
2、 按权利要求1所述的方法，其特征是所述的RD105片段共缺失3467bp。
3、 按权利要求1所述的方法，其特征是所述的PCR反应反应体系总体积10 ul， 包含2xTaqPCRMasterMix，每条引物0.2pM，模板DNAlpl，循环条件94°C 5 分钟，25个循环94。C30秒，68。C30秒、72°C 2分钟.终末延伸温度72°C延 伸7分钟。
4、按权利要求1所述的方法，其特征是所述的电泳检测PCR结果是根据PCR 产物的大小判断菌株是否属于北京基因型。
全文摘要
本发明属医学检验领域，涉及结核分枝杆菌鉴定的方法，具体涉及一种快速鉴定结核分枝杆菌北京基因型菌株的方法。本发明提供了以检测RD105的缺失为目的多引物PCR(DTM-PCR)方法，经采用中国上海的菌株评估，结果显示，本发明方法的效力与鉴定北京基因型菌株的标准方法Spoligotyping相同。但是能更快速、有效、准确的鉴定其是否属于北京基因型菌株，花费更少、耗时更短，用标准的PCR试剂和仪器就可以轻松的用于高通量分析，是一种快速、经济的方法，本发明也适用于在大批量菌株中进行鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101413021SQ20081009187
公开日2009年4月22日 申请日期2008年4月1日 优先权日2007年10月19日
发明者建 梅, 婧 陈, 谦 高 申请人:复旦大学