专利名称：苹果MdMYB1基因中与着色相关的两处突变及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及苹果MdMYBl基因中的两处突变与苹果果实着色性状的关系及突变检测方法。
背景技术：
苹果(Malus domestica Borkh.)是我国果树产业中重要的大宗水果，其着色问题是影响我国许多产区苹果质量的一个重要因素，培育着色好的品种是生产中急需的。通过研究利用苹果着色相关基因的序列变异，开发果实着色性状的分子标记，提早鉴定杂交后代植株果实着色性状，对杂交后代植株提早进行筛选，将有助于降低早期试验费用和工作量，以低成本尽快培育出着色好的苹果新品种，增强我国苹果的质量和市场竞争力。苹果的着色与果皮中的花色苷有关，花色苷的合成涉及查尔酮合成酶(OB)、类黄酮3-羟基化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、UDP-葡萄糖类黄酮-3-0-葡萄糖转移酶 (UFGT)等酶的基因。研究表明，花色苷的积累与这些基因、特别是UFGT基因的表达水平有关，这些基因的表达受到MYB家族转录因子的调控，MdMYBl基因是一个与果实着色有关的功能基因(Takos 等，2006)。Takos 等 Q006)通过分析MdMYBl-I (GenBank登录号 DQ886414) 等基因序列，找到了一个与果实着色性状有关的碱基突变位点，开发出一个dCAPS标记。 dCAPS标记是一种改进的CAPS标记(derived CAPS)，而CAPS标记是指切割扩增的多态性序列标记(Cleaved amplified polymorphic sequence)。Takos 等(2006)开发的 dCAPS 标记虽然不能将澳洲青苹等品种与一些着色品种区分开，但可以区分其它一些着色与非着色品种，可以完全区分杂交亲本植株(粉红女士姊妹株、金帅)及其后代植株，在杂交后代植株的早期选择中利用价值高。该dCAPS标记的缺点是酶切后的片段长度仅有^bp的差异， 利用普通的琼脂糖电泳无法检测，需要用价格约为7000元/125g的昂贵NuSieve GTG琼脂糖进行电泳检测。本发明的目的是通过进一步分析MdMYBl基因序列，寻找其它与苹果果实着色性状相关的突变位点，开发可用普通琼脂糖电泳检测的分子标记(例如CAPS标记) 用来鉴定苹果植株果实着色性状。参考文献[1]苑克俊，张毅，孙瑞红，张振成.苹果、葡萄花色苷生物合成研究进展.山东农业科学，1998,6 :46-49.[2]张学英，张上隆，骆军，叶正文，李世诚.果实花色素苷合成研究进展.果树学报，2004，21 (5) :456-460.[3] Takos, Α. M.，Jaffe, F. W.，Jacob, S. R.，Bogs, J.，Robinson, S. P.，Walker, A. R. Light-Induced Expression of a MYB Gene Regulates Anthocyanin Biosynthesis inRed Apples. Plant Physiology,2006,142(3) :1216-1232.[4] Ban, Y. , Honda, C. , Hatsuyama, Y. , Igarashi, Μ. , Bessho, H. and Moriguchi, T.Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that isa key regulator for the development of red coloration in apple skin. PlantCellPhysiology,2007,48(7) :958-970
发明内容
本发明找出苹果MdMYBl基因中两处突变与苹果果实着色性状相关，提供检测这些突变、进而鉴定苹果果实着色性状的分子标记方法和测序方法。本发明解决问题所采用的技术方案是根据苹果MdMYBl基因(GenBank登录号 DQ886414)序列设计引物，利用设计的引物对8个不同苹果品种的基因组DNA进行PCR扩增，通过对这些苹果品种的PCR扩增产物测序与序列比对寻找突变，然后分析这些苹果品种的基因突变与果实着色性状的关系，找出与苹果果实着色性状相关的两处突变，开发用普通琼脂糖电泳检测突变的分子标记方法(例如CAPS标记方法)用来鉴定苹果果实着色性状，也可通过测序方法获得突变位点碱基信息鉴定苹果果实着色性状。本发明的有益效果是(1)本发明通过实验新找出苹果MdMYBl基因中两处突变与苹果果实着色性状相关，可用来开发新的方法鉴定苹果果实着色性状。(2)与现有的利用另外一处突变鉴定苹果果实着色性状的dCAPS标记相比，本发明新开发的CAPS标记鉴定方法简单实用。现有dCAPS标记的PCR扩增产物酶切后，片段长度仅有^bp的差异，利用普通的琼脂糖电泳无法检测；本发明CAPS标记PCR扩增产物的酶切产物，通过设计引物可将酶切产物的片段长度差异控制在70 200bp，可利用普通的琼脂糖电泳检测，而且由于片段差异大，电泳时间可缩短。( 与现有技术相比，本发明CAPS标记方法节省实验成本效果突出。现有dCAPS标记实验在3%的NuSieve GTG琼脂糖上进行电泳检测，NuSieve GTG琼脂糖价格昂贵为6900元/125g ；本发明CAPS标记实验在1. 2%的普通琼脂糖上电泳检测，价格仅220元/100g。一次实验按IOOml凝胶溶液计算，则现有dCAPS标记实验琼脂糖费用 165. 6元，本发明CAPS标记实验琼脂糖费用仅2. 64元，实验成本显著降低。(4)利用本发明可鉴定苹果品种和杂交后代植株果实着色性状后，进而对苹果杂交后代植株进行早期选择，舍弃一部分植株，节省杂交后代植株的管理与筛选成本。总之，本发明为苹果的果实着色性状改良提供了一种简单易用的低成本分子标记育种手段。这里需要说明的是本发明所用8个苹果品种富士、国光、嘎拉、红星、红玉、印度、 金帅、青香蕉全部为生产上栽培的品种，公众能得到；本发明涉及基因序列为已知MdMYBl 基因序列，不涉及核苷酸或氨基酸序列表；本发明设计人曾在2009年11月21-22日于广州召开的“庆祝中国园艺学会创立80周年暨第十一次会员代表大会”发表“苹果着色相关基因的分子标记及其利用研究”论文摘要，但该论文是研究另一突变，本发明权利要求中与苹果果实着色性状有关的两处MdMYBl基因突变及其检测方法未发表。为慎重起见，我们还是填写了发明专利请求书(19)不丧失新颖性宽限声明。
图1是8个苹果品种PCR扩增产物的电泳图。图中M. DNA分子量标记，数字和bp
为标记大小与单位，1.富士，2.国光，3.嘎拉，4.红星，5.红玉，6.印度，7.金帅，8.青香 >、、、 图2是已知位点227的碱基信息、本发明新找出的206与280两处突变位点的碱基信息与果实着色性状；
图3是本发明第一个实施例8个苹果品种PCR扩增产物酶切后的电泳图，图中 M. DNA分子量标记，数字和bp为标记大小与单位，1.富士，2.国光，3.嘎拉，4.红星，5.红玉，6.印度，7.金帅，8.青香蕉；
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。本发明测序方法检测突变实施步骤步骤1，试材富士和嘎拉苹果及其杂交后代植株的叶或花，以及金帅、国光、红星、红玉、印度、青香蕉六个苹果品种的叶或花。步骤2，基因组DNA提取试材研磨后立即加入预热至65°C的0.6mL 2% CTAB提取缓冲液[2 % CTAB，100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA, 1. 4mol/L NaCl,2 % PVP-40,2% β -巯基乙醇]，在65°C水浴中提取30min，这期间轻轻倒置样品试管3次。取出加入0. 6mL氯仿异戊醇04 1)，轻轻翻转，充分混勻，12000rpm离心lOmin。将上清液转入另一个新试管，加入等体积经-20°C预冷的异丙醇，轻轻摇勻，在12000rpm离心IOmin 后将上清液移去。试管中的DNA球用500 μ L冷的70%乙醇(_20°C )漂洗2次，将试管置于室温下晾干，加入30 50 μ L灭菌无离子水或0. 2Χ的ΤΕ，再加入1 μ LRNase A (2. 5mg/ ml)处理除去RNA，在4°C冰箱中保存备用，暂时不用的DNA则冷冻保存。步骤3，PCR扩增利用MdMYBl基因序列在突变两侧设计正向引物Mb2f (序列为 TTGGGTGTTTGCTGTTGC)和反向引物 Mb2R(序列为 TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，也可设计其它正向和反向引物。PCR反应液(20 μ L)含有0. 5yU25ng)基因组DNA和19. 5 μ L反应混合物，一份混合物由0. 4 μ L dNTPs (10mmol/L)、2 μ L IOx Taq缓冲液、0. 5 μ L正向引物 (10ymol/L)、0.5yL 反向引物(10 μ mol/L)、0· 25 μ L(5U)的 Taq DNA 聚合酶禾口 15. 85 μ L 水组成。PCR反应35个循环，每一循环包括94°C变性30s、56°C退火Imin和72°C引物延伸 2min。步骤4，电泳检查将3 μ L PCR产物、6 μ L /K和1 μ L上样染料混合，溴化乙锭染色，在120V电压、1. 2%琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物，结果如图1所示。步骤5，PCR产物测序由专门的生物技术公司进行。测序后通过对获得的各苹果品种序列进行比对分析找出突变位点，然后分析这些突变位点与前人开发的dCAPS标记突变位点的关系，结果如图2所示，新找出位点206和位点280两个突变位点(也就是 MdMYBl-I基因转录起始点上游-16Mbp处和-1550bp处)，能提供与前人苹果着色性状 dCAPS分子标记突变位点227相同的信息(即在每一突变位点前6个苹果品种都含有一个相同的碱基，后6个苹果品种都含有一个相同的碱基)，表明PCR产物测序新获得的突变位点碱基信息可直接用来鉴定苹果果实着色性状，也可用来开发可鉴定苹果果实着色性状的分子标记。本发明CAPS标记方法检测突变实施步骤步骤1，试材同上述测序方法。步骤2，基因组DNA提取同上述测序方法。步骤3，PCR扩增同上述测序方法。步骤4，电泳检查PCR产物同上述测序方法。
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步骤5，酶切实验取5μ LPCR产物加入试管中，再加入2μ L反应缓冲液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性内切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h进行酶切。步骤6，电泳检查酶切产物20 μ L酶切产物加5 μ L上样染料混合，溴化乙锭染色， 在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物，结果如图3所示。有2个苹果品种PCR扩增产物酶切后仅出现一条与苹果果实着色性状有关的495bp带，有2个苹果品种 PCR扩增产物酶切后仅出现一条与苹果果实非红色性状有关的698bp带，有4个苹果品种 PCR扩增产物酶切后出现一条与苹果果实着色性状有关的495bp带和一条与苹果果实非红色性状有关的698bp带。^MM 1 :CAPSt示iPi去撒_突夺、鉴定苹果品种棺株着卢,t牛状步骤1，试材富士、嘎拉、金帅、国光、红星、红玉、印度、青香蕉8个常见苹果品种的叶或花。步骤2，基因组DNA提取同前述测序方法。步骤3，PCR扩增同前述测序方法。步骤4，酶切实验取5μ LPCR产物加入试管中，再加入2μ L反应缓冲液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性内切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h进行酶切。20 μ L酶切产物加5 μ L上样染料混合，溴化乙锭染色，在120V电压、1. 2%琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物，结果如图3所示。步骤5，苹果品种植株着色性状分析鉴于新找出的两个突变位点能提供与前人苹果着色性状dCAPS分子标记突变位点相同的信息，表明利用新获得的突变位点碱基信息开发的苹果果实着色性状分子标记，同前人的苹果着色性状dCAPS分子标记一样可鉴定苹果杂交后代植株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果，8个苹果品种中，国光和红玉2个苹果品种PCR扩增产物酶切后仅出现一条495bp带，苹果果实着色性状为红色；金帅和青香蕉2个苹果品种PCR扩增产物酶切后仅出现一条698bp带，苹果果实着色性状为非红色性状；富士、嘎拉、红星和印度4个苹果品种PCR扩增产物酶切后出现一条698bp带和一条495bp带，苹果果实着色性状可能为红色(包括桔红色，如富士、嘎拉和红星)，也可能为非红色(如印度)。实施例2 :CAPS标记法检测突变、鉴定苹果杂交后代植株着饩性状步骤1，试材利用富士和嘎拉苹果作为亲本进行杂交获得种子，种子播种后获得的苹果杂交后代植株叶作为试材。步骤2，基因组DNA提取同前述测序方法。步骤3，PCR扩增同前述测序方法。步骤4，酶切实验取5μ LPCR产物加入试管中，再加入2μ L反应缓冲液(IOx)、 1 μ L(IOU)限制性内切酶Riil I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h进行酶切。20 μ L酶切产物加5 μ L上样染料混合，溴化乙锭染色，在120V电压、1. 2%琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物。步骤5，苹果杂交后代植株着色性状分析鉴于新找出的两个突变位点能提供与前人苹果着色性状dCAPS分子标记突变位点相同的信息，表明利用新获得的突变位点碱基信息开发的苹果果实着色性状分子标记，同前人的苹果着色性状dCAPS分子标记一样可鉴定苹果杂交后代植株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果，
6本发明实施例苹果杂交后代植株中，有些植株PCR扩增产物酶切后仅出现一条495bp带，其果实为红色；有些植株PCR扩增产物酶切后仅出现一条698bp带，其果实为非红色；有些植株PCR扩增产物酶切后出现一条698bp带和一条495bp带，其果实为红色(包括桔红色)。 如果研究的目的是筛选非红色品种，可保留仅出现一条698bp带的杂交后代植株，舍弃其它杂交后代植株，因此可节约后期管理和筛选费用。如果研究的目的是筛选红色品种，可舍弃仅出现698bp带的杂交后代植株，保留其它杂交后代植株，节约后期管理和筛选费用。^MM 3 禾丨用突夺位点206鉴定苹果品禾料首株着卢/丨牛状步骤1，试材同前述测序方法。步骤2，基因组DNA提取同前述测序方法。步骤3，PCR扩增同前述测序方法。步骤4，电泳检查同前述测序方法。步骤5，PCR产物测序同前述测序方法。步骤6，苹果品种植株着色性状分析鉴于新找出的突变位点206(也就是 MdMYBl-I基因转录起始点上游_1624bp处)能提供与前人苹果着色性状dCAPS分子标记突变位点相同的信息，表明新获得的突变位点206的碱基信息，同前人的苹果着色性状dCAPS 分子标记一样可鉴定苹果杂交后代植株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果，8个苹果品种中，国光和红玉2个苹果品种PCR产物序列位点206含有G， 苹果果实着色性状为红色；金帅和青香蕉2个苹果品种PCR产物序列位点206含有A，苹果果实着色性状为非红色性状；富士、嘎拉、红星和印度4个苹果品种PCR产物序列位点206 含有G和A，苹果果实着色性状可能为红色(包括桔红色，如富士、嘎拉和红星)，也可能为非红色(如印度)。实施例4 利用突变位点280鉴定苹果品种植株着饩性状步骤1，试材同前述测序方法。步骤2，基因组DNA提取同前述测序方法。步骤3，PCR扩增同前述测序方法。步骤4，电泳检查同前述测序方法。步骤5，PCR产物测序同前述测序方法。步骤6，苹果品种植株着色性状分析鉴于新找出的突变位点观0(也就是 MdMYBl-I基因转录起始点上游_1550bp处)能提供与前人苹果着色性状dCAPS分子标记突变位点相同的信息，表明新获得的突变位点280的碱基信息，同前人的苹果着色性状dCAPS 分子标记一样可鉴定苹果杂交后代植株果实着色性状。根据前人的dCAPS分子标记分析苹果着色性状结果，8个苹果品种中，国光和红玉2个苹果品种PCR产物序列位点280含有T， 苹果果实着色性状为红色；金帅和青香蕉2个苹果品种PCR产物序列位点280含有C，苹果果实着色性状为非红色性状；富士、嘎拉、红星和印度4个苹果品种PCR产物序列位点280 含有T和C，苹果果实着色性状可能为红色(包括桔红色，如富士、嘎拉和红星)，也可能为非红色(如印度)。
权利要求
1.苹果MdMYBl基因的一处突变，其特征是在MdMYBl-I基因转录起始点上游-1624bp 处的碱基发生与苹果果实着色性状相关的突变或者杂合突变G — A、G — G/A、G — Α/Τ ；基于该处突变可开发检测方法鉴定苹果果实着色性状。
2.苹果MdMYBl基因的一处突变，其特征是在MdMYBl-I基因转录起始点上游-1550bp 处的碱基发生与苹果果实着色性状相关的突变或者杂合突变T — C、T — T/C、T — C/A ；基于该处突变可开发检测方法鉴定苹果果实着色性状。
3.—种检测上述权利1所述突变的CAPS分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1 提取DNA样本；步骤2 在上述权利1所述突变两侧利用MdMYBl基因设计引物； 步骤3:进行PCR扩增； 步骤4 电泳检查PCR产物； 步骤5 用RnlI酶酶切PCR产物；步骤6 普通琼脂糖电泳检测酶切产物，与前人需要在昂贵NuSieve GTG琼脂糖上电泳检测的dCAPS分子标记相比，其实验成本显著降低。
4.一种检测上述权利1或2所述突变的测序方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1 提取DNA样本；步骤2 在上述权利1或2所述突变两侧利用MdMYBl基因设计引物； 步骤3:进行PCR扩增； 步骤4 普通琼脂糖电泳检测PCR产物； 步骤5:PCR产物测序检测。
5.根据权利要求1或2所述的突变，其特征是可以用来鉴定苹果品种及杂交后代植株果实着色性状，对苹果杂交后代植株着色性状进行早期选择，舍弃一部分植株，节省杂交后代植株的管理与筛选成本，为苹果果实着色性状改良提供一种有效的低成本分子育种手段。
全文摘要
苹果MdMYB1基因中与着色相关的两处突变及其检测方法。本发明属生物技术领域，为苹果着色性状改良提供一种低成本分子育种手段。利用苹果着色相关基因MdMYB1设计一对引物，以苹果基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增片段。对8个苹果品种的PCR扩增片段进行测序和分析，找出两处与苹果着色性状有关的基因突变，其中一处为Pml I酶切位点。利用该酶切位点开发出一个检测突变的CAPS标记Mb2P，其显著进步是它能用普通琼脂糖电泳检测，实验成本显著降低，不象前人的dCAPS标记需用昂贵的NuSieve GTG琼脂糖电泳检测。通过CAPS标记或测序方法检测突变，可鉴定苹果品种及杂交后代果实着色性状，对苹果杂交后代果实着色性状进行早期选择，舍弃部分植株，节省后代植株的管理与筛选成本。
文档编号C12Q1/68GK102242186SQ201010168149
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月11日 优先权日2010年5月11日
发明者刘庆忠, 苑克俊, 魏海蓉, 黄立香 申请人:山东省果树研究所