专利名称：小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测技术的制作方法
技术领域：
本发明属于一种小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，可用于评价禾谷 镰孢菌对小麦的危害程度。
背景技术：
赤霉病是小麦上的重要真菌性病害，发生范围遍布全球。尽管很多Fusarium属的 病原菌也能引起赤霉病，但是在中国，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum Schwabe)是引 起小麦赤霉病的最主要的病原菌。近年来该病在亚洲、加拿大、欧洲和南美洲连续爆发，导 致的禾谷类作物产量损失有10% _70%，正威胁着全球的粮食安全。禾谷镰孢菌除了导致 谷物产量下降外，还因产生DON真菌毒素而降低谷物品质。如果人、畜食用了真菌毒素污染 的粮食就会产生急性或慢性中毒现象，因此真菌毒素污染问题已引起人类的严重关切。在 欧洲、北美和中国，DON类毒素是污染粮食的主要真菌毒素。为此，世界卫生组织制定标准 规定粮食和饲料中的DON毒素含量不得超过lmg/kg和5mg/kg。我国卫生部制定的国家标 准(GB16329-1996)也规定食用小麦面粉中DON的毒素含量不得超过lmg/kg。为了防治赤霉病并避免禾谷镰孢菌DON真菌毒素污染对人畜的危害，人们一方面 采用各种综合防治技术，包括培育和种植抗病品种、喷施化学杀菌剂和生物制剂、改善环境 条件等减轻病害发生。另一方面，制定商品粮赤霉病病粒率或毒素含量最大允许标准。例 如，我国商业部门制定的国家标准规定了收购的小麦中赤霉病病粒率不得超过4%。然而， 发明人经过细致研究发现小麦赤霉病病粒率与DON毒素含量的相关性并不稳定，一些存在 潜伏侵染菌丝的“健康”麦粒含有毒素，甚至在看似健康的小麦样品中，DON毒素含量也可能 已达损害人体健康的水平。进一步研究发现DON毒素含量与麦粒中禾谷镰孢菌的侵染量密 切正相关，这些“无病”麦粒的潜伏菌丝量与小麦灌浆期的温湿度有关。本发明利用实时定量PCR(Real_time quantitative PCR)方法检测小麦谷粒中禾 谷镰孢菌的侵染量，包括样品的前处理、基因组DNA的提取和实时定量PCR扩增过程只需要 6小时，即可对谷物中禾谷镰孢菌的侵染量进行精确定量。该技术操作不仅相对简单，而且 还具有高通量、实时性、高效性等优点。因此，该技术可以准确评估禾谷镰孢菌危害小麦谷 粒严重程度和评价抗病品种、生物防治、化学防治等技术的实际效果。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供小麦谷粒中禾谷镰孢菌量的一种高通量、快速 分子检测方法。现有技术针对微管蛋白基因设计的引物对镰刀菌属真菌检测特异性较 差。本发明以禾谷镰孢菌DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)为靶基因， 重新设计Real-time PCR引物对，优化反应体系，使实时定量PCR(Real_time quantitative PCR)检测技术能够在6小时内完成从收集样品到出具检测报告的所有过程，检测准确率 高，对准确评估小麦谷粒中禾谷镰孢菌危害程度，避免DON污染小麦流入食品市场危害人 体健康，具有实用价值。
技术方案禾谷镰孢菌量的检测基因为该病原菌DON毒素合成关键基因Tri5，核 苷酸全长为1368bp，编码含376个氨基酸残基的单端孢霉二烯合酶。特异性检测小麦谷粒中禾谷镰孢菌菌量的方法共分三步第一步采用常规的苯酚 氯仿 异戊醇法，分别提取实验室培养的禾谷镰孢菌菌 丝DNA和待测谷物样品DNA。第二步运用禾谷镰孢菌DON毒素合成关键基因Tri5 (编码单端孢霉二烯合酶) 的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，建立禾谷镰孢菌菌 丝检测量的标准曲线。小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的实时定量PCR检测关键在于采用实时定量 PCR(Real-time quantitativePCR)技术检测谷粒中禾谷镰孢菌菌丝Tri5DNA的量，故引物 设计需对禾谷镰孢菌Tri5基因PCR扩增具有特异性。然后，根据Tri5DNA的量与菌丝量之 间的关系，进而获得禾谷镰孢菌菌丝检测侵染量的标准曲线。
扩增禾谷镰孢菌Tri5基因片断的特异性引物对 上游引物 Tr5F :5’ -AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3’ 下游引物 Tr5R :5’ -AAACCATCCAGTTCTCCATCTG-3’ 实时定量PCR(Real-time quantitative PCR)反应体系及其扩增条件 禾谷镰孢菌菌丝Tri5 DNA检测量的标准曲线 反应体系 dH20(灭菌蒸馏水)
权利要求
小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real time quantitative PCR)技术检测谷粒中禾谷镰孢菌菌丝的侵染量。谷粒中禾谷镰孢菌检测方法，共分三步第一步采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取实验室培养的禾谷镰孢菌菌丝DNA和待测谷物样品DNA。第二步运用禾谷镰孢菌特异性DON毒素合成关键基因Tri5(编码单端孢霉二烯合酶)的特异性检测引物和SYBR Green I为发光材料进行实时定量PCR反应，建立禾谷镰孢菌菌丝检测量的标准曲线。实时定量PCR反应体系及其扩增条件禾谷镰孢菌菌丝检测量的标准曲线反应体系dH2O(灭菌蒸馏水) 9.5μLPlatinumTM SYBR Green qPCR SuperMix UDG12.5μLTr5F(10μM)0.5μLTr5R(10μM)0.5μLROX Reference Dye 1μLDNA模板1μL 总体积 25μL扩增条件预热50℃2min预变性 95℃2min ↓变性95℃15s退火60℃30s延伸72℃45s35个循环 ↓最后一步延伸72℃5min熔解温度59℃第三步待测样品完成实时定量PCR反应后，应用第二步中已经建立好的标准曲线，计算出待测样品中禾谷镰孢菌的菌丝量。
2.根据权利要求1，小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，其特征在于基于 DNA与菌量成正比的原理，利用了所研发的能够特异性扩增禾谷镰孢菌Tri5基因的引物对 (上游引物 Tr5F :5，-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3，和下游引物 Tr5R 5，-AAACCATCCAGTTCTCC ATCTG-3’ )测定待测样品中禾谷镰孢菌的量。
3.根据权利要求1和2，小麦谷粒中禾谷镰孢菌侵染量的定量检测方法，其特征在于 利用禾谷镰孢菌侵染量的PCR检测结果评价小麦罹病程度和有关防治技术的效果。
全文摘要
本发明属于小麦谷粒中禾谷镰孢菌(Gibberella zeae，无性态Fusarium graminearum)的定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测方法，专门用于特异性测定麦粒中禾谷镰孢菌侵染量。该法先建立禾谷镰孢菌的实时定量PCR检测的标准曲线，然后对待测麦粒提取DNA，进行实时定量PCR反应，根据所建立的标准曲线获得待测样品中该病原菌侵染量。整个过程只需6h，检测准确率达99％以上；具有快速、简便、准确、灵敏的特点，可用于更加科学地评估麦粒赤霉病病害严重度及有关防治技术的实际效果。
文档编号C12Q1/68GK101988121SQ20101024705
公开日2011年3月23日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者周明国, 张艳军, 王建新, 陈长军 申请人:南京农业大学