专利名称：一种毛栓菌及其产纤维素酶的方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种毛栓菌(Trametes trogii) Cellulase 1号及其产纤维素酶的方法。该菌株保藏号为CGMMC No. 4587 ；该菌株以玉米芯，玉米秸秆， 小麦麸皮为主要原料，添加适量可利用碳源如葡萄糖或淀粉等，以及添加适量可利用氮源如硫酸铵、酵母膏或蛋白胨等进行静置或兼性厌氧发酵产纤维素酶。
二、背景技术 纤维素广泛存在于自然界中，是地球上最丰富的可再生资源，被开发利用的纤维素全世界不足2%，我国约有50%以上作物秸秆被直接焚烧，严重污染了环境同时也造成资源的极大浪费。将纤维素降解为小分子可溶性糖，然后利用微生物转化为有机酸、醇、醋及甲烷、氢气等化工原料和能源，对解决当今所面临的能源危机、资源匮乏和环境污染问题具有重大的现实意义。纤维素酶是一组能够将纤维素分解成纤维二糖、葡萄糖等可溶性糖的酶的总称。 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、微生物都能产生纤维素酶，其中微生物发酵生产纤维素酶是一种非常有效的方法。目前，微生物发酵产纤维素酶菌种主要集中在曲霉属如黑曲霉、根霉属如米根霉、木霉属如绿色木霉，里氏木霉，康氏木霉，康宁木霉等，而这些微生物在进行纤维素酶发酵生产时主要采用的是好氧发酵，需要搅拌，消耗大量能量，此外，目前所报道的产纤维素酶菌株发酵周期多数为5-7天。利用所分离、筛选和鉴定的毛栓菌(Trametes trogii)进行静置或兼性厌氧发酵产纤维素酶是首创，国内外未见报道。静置或兼性厌氧发酵产纤维素酶很大程度上降低了发酵过程中的搅拌电力消耗，节省了能源，此外，该菌株发酵周期相对较短，所产酶活相对较高，一定程度实现了较高的生产效率，具有很好的潜在应用价值。
发明内容
本发明目的是利用所筛选并经鉴定的一株毛栓菌(Trametes trogii)进行纤维素酶的静置或兼性厌氧发酵，降低发酵过程中的能源消耗，缩短发酵周期，提高纤维素酶发酵的生产效率。本发明的具体技术方案1. 一种毛栓菌cellulase 1号的分离与鉴定取来自于小庄农户家中刚宰杀的羊瘤胃液lmL，置于IOOmL无菌水的三角瓶中，摇勻，从中取 ImL 菌液，10 倍梯度稀释为 IO"1,10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，分别取 10_5 和 10_6 两个稀释倍数的稀释液0. Iml涂布到PDA培养基上，30°C 37°C培养3 4天；待PDA培养基上长出菌落后，分别挑取单菌落，接种到复筛培养基上(其组成为 CMC-NalOg/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁0. 5g/L，蛋白胨lg/L，琼脂18g/L，pH 自然)，30°C 37°C培养3 4天(图1)；将复筛得到的菌落，采取平板点种法接种到纤维素刚果红培养基中，30°C 37°C培养4天，无菌水缓慢冲洗平板至流出水为无色，加入适量lmol/L氯化钠溶液浸泡30分钟洗涤，观察水解圈，选择水解圈较大的菌落(图2)，并对该菌株进行rRNA序列测定，经鉴定为毛栓菌(Trametes trogii)，菌株编号为Cellulase 1号，其特征是菌落在麦芽浸膏琼脂(MEA)培养基上菌落生长迅速，黑暗条件下25°C培养14天，菌落直径75_85mm，白色，絮状，平铺；背面浅褐色，无水溶性色素(图3)。菌丝壁平滑或稍粗糙，多分枝，具分隔， 1. 5-4. 5μπι宽，未见锁状联合现象，未见任何类型孢子(图4)。该菌株已于2011年5月12 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4857。2. 一种毛栓菌Cellulase 1号产纤维素酶方法将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量2. 5g 12. 5g装入250ml三角瓶中，加入50ml IOOml自来水，加入1 % 10%淀粉或葡萄糖等可利用性碳源和0. 0.5%硫酸铵或蛋白胨或酵母膏等可利用性氮源，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼5 8块，菌饼直径8mm，30°C 37°C静置或兼性厌氧发酵3 4天，发酵液3000 3500rpm离心10 15min，取上清为粗酶液。(图5)3.纤维素酶活测定、酶活定义与计算方法利用DNS测定CMC-Na酶活，即取适当稀释的酶液ImL加入2mL 1% (w/v)的 CMC-Na溶液(此溶液由pH = 5. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置)，50°C反应30min后加入2mLDNS溶液终止反应，沸水浴5min，流水冷却，500nm处测定吸光值。空白对照为在加入ImL酶液前，先加入2mL的DNS溶液终止反应，沸水浴5min，流水冷却，然后测定500nm处的吸光值。酶活定义ImL粗酶液在Imin分解底物产生Iug葡萄糖为1个酶活单位(U)。 酶活计算方法酶活=稀释的酶活测定值X 1000X稀释倍数/反应时间。本发明的优势(1)毛栓菌Cellulase 1号菌株是一种新发现的产纤维素酶菌株，具有发酵周期短，产纤维素酶活力高的优点。(2)本发明采用的是静置或兼性厌氧液体发酵，很大程度上节省了发酵过程中的搅拌电力消耗，降低了生产成本，提高了生产效率。本发明的效果(1)发酵周期与以往报道的木霉属菌株相比，缩短2 3天。(2)产纤维素酶活力静置或兼性厌氧发酵3 4天，CMC-Na酶活可达70U/ml 110U/ml。
四.
图1.复筛培养基上毛栓菌Cellulase 1号菌落形态图2.毛栓菌Cellulase 1号的纤维素刚果红水解圈图3.毛栓菌Cellulase 1号显微特征图4. MEA培养基上毛栓菌Cellulase 1号菌 落形态图5.毛栓菌Cellulase 1号产纤维素酶过程曲线
五.具体实施方式
实施例1.毛栓菌Cellulase 1号的分离与鉴定将取自新乡市郊小庄村一农户家的羊瘤胃液，进行分离、富集和培养，进一步利用纤维素刚果红筛选培养基进行筛选和分离，于30°C 37°C恒温培养箱中培养，观察水解圈，并对该菌株rRNA进行序列测定，经鉴定为毛栓菌(Trametes trogii)，菌株编号为 Cellulasel号，其特征是菌落在麦芽浸膏琼脂(MEA)培养基上菌落生长迅速，黑暗条件下 25°C培养14天，菌落直径75-85mm，白色，絮状，平铺；背面浅褐色，无水溶性色素。菌丝壁平滑或稍粗糙，多分枝，具分隔，1. 5-4. 5 μ m宽，未见锁状联合现象，未见任何类型孢子。该菌株已于2011年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No. 4857。实施例2.毛栓菌静置发酵产纤维素酶将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量2. 5g装入250ml三角瓶，加入 50ml自来水，加入1 %的可溶性淀粉和0. 05 %硫酸铵，115°C高压灭菌15 20min后，冷却， 无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼5 8块，菌饼直径8mm，30°C 37°C静置发酵3 4天，发酵液3000 3500rpm离心10 15min，取上清测酶活，值为73. 2U/ml.实施例3.毛栓菌静置发酵产纤维素酶按照实施例2中的步骤，将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量2.5g 装入250ml三角瓶，加入50ml自来水，加入1 %的小麦淀粉和0. 05%硫酸铵，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼5 8块，菌饼直径8mm，30°C 37°C静置发酵3 4天，发酵液3000 3500rpm 离心10 15min，取上清测酶活，值为79. 8U/ml。实施例4.毛栓菌静置发酵产纤维素酶按照实施例2中的步骤，将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量5g 装入250ml三角瓶，加入60ml自来水，加入5%的可溶性淀粉和0. 05%硫酸铵，0. 5%蛋白胨，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3 4天的 Cellulase 1号菌株的菌饼5 8块，菌饼直径8mm，30°C 37°C静置发酵3 4天，发酵液 3000 3500rpm离心10 15min，取上清测酶活，值为90. 3U/ml。实施例5.毛栓菌静置发酵产纤维素酶按照实施例2中的步骤，将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量7.5g 装入250ml三角瓶，加入80ml自来水，加入5 %的葡萄糖和0. 5 %酵母膏，0. 5 %蛋白胨， 1150C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3 4天的 Cellulasel号菌株的菌饼5 8块，菌饼直径8mm，30°C 37°C静置发酵3 4天，发酵液 3000 3500rpm离心10 15min，取上清测酶活，值为100. 7U/ml。实施例6.毛栓菌静置发酵产纤维素酶按照实施例2中的步骤，将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量12. 5g 装入250ml三角瓶，加入IOOml自来水，加入10%的葡萄糖和0. 2%硫酸铵，0. 5%酵母膏， 0. 5 %蛋白胨，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养 3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼5 8块，菌饼直径8mm，30°C 37°C静置发酵3 4天，发酵液3000 3500rpm离心10 15min，取上清测酶活，值为116. 2U/ml。
实施例7.毛栓菌兼性厌氧发酵产纤维素酶将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量1155g装入IOL发酵罐，加入 8L自来水，加入6%的葡萄糖和0. 5%酵母膏，0. 5%蛋白胨，0. 2%玉米浆，115°C高压灭菌 15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼35 40块，菌饼直径10mm，30°C 37°C兼性厌氧发酵3 4天，前1 2天通气发酵，通风比为1 0.2，直至发酵结束，发酵液3000 3500rpm离心10 15min，取上清测酶活，值为100. 3U/ml。实施例8.毛栓菌兼性厌氧发酵产纤维素酶按照实施例7中的步骤，将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量1205g 装入IOL发酵罐，加入8L自来水，加入10%的可溶性淀粉和0.5%酵母膏，0.5%蛋白胨， 0. 2 %玉米浆，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养 3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼35 40块，菌饼直径10mm，30°C 37°C兼性厌氧发酵3 4天，前1 2天通气发酵，通风比为1 0.2，直至发酵结束，发酵液3000 3500rpm 离心10 15min，取上清测酶活，值为96. 8U/ml。实施例9.毛栓菌兼性厌氧发酵产纤维素酶按照实施例7中的步骤，将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量1205g 装入IOL发酵罐，加入8L自来水，加入10%的可溶性淀粉和0.5%酵母膏，0.5%蛋白胨， 0. 2%玉米浆，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养 3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼35 40块，菌饼直径10mm，30°C 37°C兼性厌氧发酵3 4天，前1 2天通气发酵，通风比为1 0.3，直至发酵结束，发酵液3000 3500rpm 离心10 15min，取上清测酶活，值为106. 8U/ml。实施例10.毛栓菌兼性厌氧发酵产纤维素酶按照实施例7中的步骤，将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量1205g 装入IOL发酵罐，加入8L自来水，加入10%的可溶性淀粉和0.5%酵母膏，0.5%蛋白胨， 0. 2%玉米浆，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养 3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼35 40块，菌饼直径10mm，30°C 37°C兼性厌氧发酵3 4天，前1 2天通气发酵，通风比为1 0.4，直至发酵结束，发酵液3000 3500rpm 离心10 15min，取上清测酶活，值为95. 2U/ml。
权利要求
1.一种毛栓菌(Trametes trogii)，菌株编号为Cellulase 1号，该菌株已于2011 年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4857。
2.根据权利要求1所述的毛栓菌Cellulase1号菌株产纤维素酶的方法，其特征是将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量加入自来水配成2. 5% 12. 5%的发酵培养基，加入1 % 10 %淀粉或葡萄糖等可利用性碳源和0. 1 % 0. 5 %硫酸铵或蛋白胨或酵母膏等可利用性氮源，115°C高压灭菌15 20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3 4天的Cellulase 1号菌株的菌饼适量，菌饼直径为8_ 10mm，30°C 37°C 静置或兼性厌氧发酵3 4天，通风比1 0.2 0.4，发酵结束，发酵液3000 3500rpm 离心10 15min，得上清为粗酶液。
3.根据权利要求2所述的Cellulase1号菌株产纤维素酶的方法，其特征是利用DNS 法3，5- 二硝基水杨酸法)测定CMC-Na酶活，即取适当稀释的酶液ImL加入2mL 1 % (w/v) 的CMC-Na溶液(此溶液由pH = 5. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配置)，50°C反应30min 后加入2mLDNS溶液终止反应，沸水浴5min，流水冷却，500nm处测定吸光值。空白对照为在加入ImL酶液前，先加入2mL的DNS溶液终止反应，沸水浴5min，流水冷却，然后测定500nm 处的吸光值。
4.根据权利要求2所述的Cellulase1号菌株产纤维素酶的方法，其特征是酶活定义为ImL粗酶液在Imin分解底物产生Iug葡萄糖为1个酶活单位(U)。酶活计算方法为酶活=稀释的酶活测定值X1000X稀释倍数/反应时间
5.根据权利要求2所述的Cellulase1号菌株产纤维素酶的方法，其特征是所产 CMC-Na 酶酶活为 75U/ml IlOU ml。
全文摘要
本发明属于微生物技术领域，尤其是利用所筛选并经鉴定的一株毛栓菌(Trametes trogii)Cellulase1号进行纤维素酶发酵的方法。将玉米芯或玉米秸秆或小麦秸秆粉碎过40目，称量加入自来水配成2.5％～12.5％的发酵培养基，加入1％～10％淀粉或葡萄糖等可利用性碳源和0.1％～0.5％硫酸铵或蛋白胨或酵母膏等可利用性氮源，115℃高压灭菌15～20min后，冷却，无菌操作，接入在复筛培养基上已培养3～4天的Cellulase 1号菌株的菌饼适量，菌饼直径为8mm～10mm，30℃～37℃静置或兼性厌氧发酵3～4天，通风比1∶0.2～0.4，发酵结束，离心发酵液取上清于500nm处，测吸光值得CMC-Na酶活。毛栓菌Cellulase 1号静置或兼性厌氧发酵产纤维素酶，降低了发酵过程中的电力能源消耗，缩短了发酵产酶周期，提高了生产效率具有巨大潜在应用价值。
文档编号C12N1/14GK102268379SQ201110202609
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月10日 优先权日2011年7月10日
发明者华承伟, 张玉辉, 朱黎娅, 贾翠英, 赵俊杰, 赵娅珺 申请人:贾翠英