专利名称：羊魏氏梭菌pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒。
背景技术：
魏氏梭菌，又称产气荚膜梭菌ipiostridium prerfringens)属于腐生性厌氧芽胞致病菌，是引起畜禽猝死症、坏死性肠炎、肠毒血症、气性坏疽的主要致病菌(W Muller, 1998)。该菌分A、B、C、D、E 5个不同的菌型(Laetitia Petit等，1999)致病性主要与其形成的毒素有关，产生的毒素共有12种，α毒素是由其共同产生的一种坏死、致死性毒素，有人认为其是家畜“猝死症”的主要致病因(Rood JI等，1991 ；Hale MI等，1999)。由魏氏梭菌引起的羊魏氏梭菌病，主要发生于羊的毒血症，包括羊猝狙、羊肠毒血症、羔羊痢疾等。该病病死率较高，用抗菌药物治疗疗效不明显，而且不同菌型的魏氏梭菌常常混合感染(王选等，2004 ；刘芳等，2007 ；陈小平等，2008)。随着近年来规模化养羊的不断发展，羊流动大、流速快，外引羊群多水土不服，加之冬春草料短缺，饲养管理不当，羊抵抗力下降，魏氏梭菌感染在山羊群中有上升蔓延趋势。且魏氏梭菌A、B、C、D、E型，皆为土壤常在菌，主要存在于土壤和污水中，当山羊抵抗力较低时，病原菌在肠道内迅速繁殖而产生大量毒素，毒素大量进入血液而引起发病。各型魏氏梭菌均产生α毒素，α毒素为魏氏梭菌的主要致死性毒素，具有致死、坏死及溶血等活性，其作用于红血球引起溶血，作用于毛细血管致使渗透作用发生障碍，引起水肿、出血及局部坏死等一系列病变。本研究设计的引物是针对魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因，A、B、C、D、E型均能扩增出特异性条带。王三虎等(2002)根据α毒素基因建立聚合酶链反应诊断魏氏梭菌病，但只检测了 A型魏氏梭菌。王磊等(2006)根据源魏氏梭菌的α、 β、ε、ι毒素基因，应用多重PCR检测圈养牛、猪和羊源魏氏梭菌，但敏感性未见其报道。现在市场缺少一种能对临床样品的羊魏氏梭菌进行简便、快捷、灵敏、准确、重复性的检测的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊魏氏梭菌PCR诊断试剂盒，它可以快速检测羊魏氏梭菌，并且简便、灵敏、准确、特异性强。本发明是这样实现的羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，它包括250 μ L的PCR premix 缓冲液，150 μ L超纯水，50 μ L的Marker DL2000,40 μ L浓度为9 IlMmol/L的上引物及 40 μ L浓度为9 llMmol/L的下引物，20 μ L阴性对照以及20 μ L阳性对照。PCR premix 缓冲液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/yL 的 Tris-HCl 及 0. 2 0. 5U Taq DNA polymerase/μ L 组成，其 PH 值为 ρΗ8· 3。上引物的序列号为LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG _ 3，，下引物的序列号为 5' -CATAATCCCAATCATCCCAACTA-S'o阴性对照为超纯水。
3
阳性对照为标准羊魏氏梭菌的PCR产物。羊魏氏梭菌PCR诊断方法的建立 1材料与方法
1.1细菌
羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型，羊大肠杆菌，羊链球菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌为贵州省畜牧兽医研究所畜禽重大疫病监测防制重点实验室保存。1.2主要试剂
Goldview、Tris、EDTA、DL2000、PCR premix缓冲液等购自宝生物(大连)工程有限公司； TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。1.3细菌基因组的抽提
取待检粪便样品共约500 mg，加入50(^LPBS缓冲液，待检样品研磨后12000 r/min离心取上清用于细菌基因组的提取。细菌基因组的提取参照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA - 20°C保存。1.4 PCR 扩增
参照GenBank中羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因，应用DNAMar软件，设计了 1对引物，用于扩增A、B、C、D、E型共有的α毒素目的基因片段。上游引物5，-TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，； 下游引物5，- CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，。PCR反应在25 μ 体系中进行，试剂盒中的上引物和下引物各2PL、PCR premix缓冲液12. 5μ 、抽提的DNA模板WL加超纯水7. 5μ 至25 μ ,反应条件94°C预变性5 min ； 940C变性30s，55°C退火1 min，72°C延伸1 min，30个循环；最后72°C延伸10 min。取 5PLPCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。1.5敏感性试验
将提取的羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型基因组用蛋白质核酸仪测定浓度后，经10倍系列稀释的核酸用于PCR反应，以确定建立的PCR的敏感性。1.6特异性试验
以羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型，羊大肠杆菌，羊链球菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌，空白水对照为模板进行PCR反应，以确定建立的PCR的特异性。1.7重复性试验
应用建立多重PCR方法，重复检测DNA样品3次以检验结果的可靠性。1. 8 PCR对临床样品的检测
对2009 2011年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、瓮安县几个规模化养羊场和养羊专业户采集的M份病料进行检测，同时进行细菌学和生化检验。2 结果
2.1 PCR产物的鉴定
PCR扩增片段经胶回，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段为羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因片段。2. 2 PCR 反应结果PCR反应在25PL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55°C，引物浓度lOMmol/ L，羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型均有效扩增出了其目的片段，其结果如图1所示，片段大小为 255bp02. 3敏感性试验
在PCR反应中，将提取的羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型基因组用蛋白质核酸仪测定浓度后， 经10倍系列稀释的核酸用于PCR反应，A型为0. 39ng/L、B型为0. 62ng/L、C型为0. 52ng/ L、D型为0. 87ng/L、E型为0. 92ng/L, A型羊魏氏梭菌敏感性试验结果如图2所示。2. 4特异性试验
如图3所示，羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型为模板均扩增出的特异性条带，而以羊大肠杆菌，羊链球菌，金黄色葡萄球菌，羊多杀性巴氏杆菌，空白水对照为模板进行PCR反应均为阴性。2. 5重复性试验
应用建立PCR方法，重复检测羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型细菌基因组3次结果均一致。2. 6 PCR对临床样品的检测
54份临床病料利用建立的羊魏氏梭菌PCR方法进行检测，共检测出40份阳性样品，高于与细菌学和生化检验结果的26份阳性样品。3 结果
本研究中5个型的魏氏梭菌敏感性差异可能和引物序列以及PCR反应条件有关。本研究中临床病料检测结果显示，灵敏高于与细菌学和生化检验，这与魏氏梭菌分离培养对厌氧条件要求较高有关。且细菌的生理生化特性由于寄主不同、环境不同以及实验室培养条件等方面的不同而产生差异，从而难以鉴定。根据上述实验结果表明，本发明的灵敏性高、 特异性强、重复性好，可用于羊魏氏梭菌病的早期快速诊断，对羊魏氏梭菌病的预防和治疗具有重要的意义。由于采用了上述技术方案，本发明对PCR反应条件进行优化，采用常规PCR法取代了费工费时的生化试验和血清学监测，研制了用于检测羊魏氏梭菌病的PCR试剂盒，该试剂盒可以检测羊魏氏梭菌病，可用于羊魏氏梭菌病的早期快速诊断，对羊魏氏梭菌病的预防和治疗具有重要的意义，能避免了人为判定带来的误差，缩短了羊魏氏梭菌病的检出时间，具有快速、灵敏性高、特异性强等特点。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。
图1为魏氏梭菌PCR试验
M: DL2000 ;1 阴性对照；2:A型PCR结果；3: B型PCR结果；4:C型PCR结果；5: D型 PCR结果；6 =E型PCR结果；
图2为A型羊魏氏梭菌PCR敏感性试验 M: D2000 ；1 7 10-1 10"稀释的 DNA PCR 结果图3为PCR特异性试验
M: DL2000 ；1 5 羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型；6 大肠杆菌PCR产物；7 羊链球菌PCR 产物；8 金黄色葡萄球菌PCR产物；9:羊多杀性巴氏杆菌PCR产物；10:空白水对照。
具体实施例方式本发明的实施例1 羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，它包括250 μ L的PCR premix 缓冲液(PCR premix 缓冲液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0. 2U Taq DNA polymerase/ μ L 组成，其 PH 值为 ρΗ8· 3)，150 μ L 超纯水，50μ L的Marker DL2000, 40yL浓度为10Mmol/L的上引物(上引物的序列为LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，)及 40 μ L 浓度为 10Mmol/L 的下引物(下引物的序列为5，- CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，)，20 μ L超纯水作为阴性对照以及20 μ L标准羊魏氏梭菌的PCR产物作为阳性对照。本发明的实施例2 羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，它包括250 μ L的PCR premix 缓冲液(PCR premix 缓冲液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0. 5U Taq DNA polymerase/ μ L 组成，其 PH 值为 ρΗ8· 3)，150 μ L 超纯水，50μ L的Marker DL2000, 40 μ L浓度为9Mmol/L的上引物(上引物的序列为LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，)及40 μ L浓度为9Mmol/L的下引物(下引物的序列为 5， - CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，)，20 μ L超纯水作为阴性对照以及20 μ L标准羊魏氏梭菌的PCR产物作为阳性对照。本发明的实施例3 羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，它包括250 μ L的PCR premix 缓冲液(PCR premix 缓冲液由 3 mmol/μ L 的 MgCl2, 500pmol/μ L 的 dNTP，25mmol/ μ L 的 Tris-HCl 及 0. 4U Taq DNA polymerase/ μ L 组成，其 PH 值为 ρΗ8· 3)，150 μ L 超纯水，50μ L的Marker DL2000, 40yL浓度为llMmol/L的上引物(上引物的序列为LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，)及 40 μ L 浓度为 llMmol/L 的下引物(下引物的序列为5，- CATAATCCCAATCATCCCAACTA - 3，)，20 μ L超纯水作为阴性对照以及20 μ L标准羊魏氏梭菌的PCR产物作为阳性对照。
权利要求
1.一种羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，其特征在于它包括250 μ L的PCR premix缓冲液，150 μ L超纯水，50 μ L的Marker DL2000，40 μ L浓度为9 IlMmol/L的上引物及40 μ L 浓度为9 llMmol/L的下引物，20 μ L阴性对照以及20 μ L阳性对照。
2.根据权利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，其特征在于PCRpremix缓冲液由 3mmol/y L的MgCl2，500pmol/y L 的 dNTP，25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0. 2 0. 5U Taq DNA polymerase/μ L 组成，其 PH 值为 ρΗ8· 3。
3.根据权利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，其特征在于上引物的序列号为LPF 5，- TAATGTTACTGCCGTTGATAGCG - 3，，下引物的序列号为 5' -CATAATCCCAATCATCCCAACTA-S'o
4.根据权利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，其特征在于阴性对照为超纯水。
5.根据权利要求1所述的羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，其特征在于阳性对照为标准羊魏氏梭菌的PCR产物。
全文摘要
本发明公开了一种羊魏氏梭菌PCR检测试剂盒，它包括250μL的PCRpremix缓冲液，150μL超纯水，50μL的MarkerDL2000，40μL浓度为10μmol/L的上引物及40μL浓度为10μmol/L的下引物，20μL阴性对照以及20μL阳性对照。本发明对PCR反应条件进行优化，采用常规PCR法取代了费工费时的生化试验和血清学监测，研制了用于检测羊魏氏梭菌病的PCR试剂盒，该试剂盒可以检测羊魏氏梭菌病，可用于羊魏氏梭菌病的早期快速诊断，对羊魏氏梭菌病的预防和治疗具有重要的意义，能避免了人为判定带来的误差，缩短了羊魏氏梭菌病的检出时间，具有快速、灵敏性高、特异性强等特点。
文档编号C12Q1/04GK102242221SQ20111020361
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者余波, 冉懋韬, 徐景峨, 艾玉萍, 谭诗文, 魏赐开 申请人:贵州省畜牧兽医研究所