专利名称：高活力磷脂酶d及细胞表面展示磷脂酶d酵母全细胞催化剂的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种基因的定点突变和重组，尤其是一种高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备。
背景技术：
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)存在于所有动物、高等植物以及微生物的细胞膜中，是细胞膜磷脂成分之一。PS在动植物和微生物中含量较低，仅占总磷脂的 2-10%。人体中的PS主要集中于大脑，约占大脑磷脂总量的15%。PS在人体内只能少量合成，主要靠从食物中摄取。PS通过直接作用于膜内蛋白质和膜相关蛋白质来调节其受体、 酶、离子通道、信使分子等的活性。PS除了参与调节许多代谢过程(如激活附着于细胞膜上的酶)外，还参与神经信息的传递。PS的出现对于由年龄引起的心智退化和老年性痴呆等疾病有着积极的预防作用，可以提高人的感知力和记忆力。因此PS的合成与调节受到人们的广泛重视。磷脂酰丝氨酸(PQ主要功效包括1、提高大脑机能，改善老年痴呆症随年龄增长，PS和其它重要的脑内化学物质会逐渐减少，从而导致记忆力、认知力减弱，补充PS能增加脑突刺数目、脑细胞膜的流动性及促进脑细胞中葡萄糖代谢，从而使脑细胞更活跃；2、帮助修复大脑损伤，PS是脑部神经的主要成分之一，具有营养和活化脑中各种酶的活性，可延缓神经递质的减少进程，有助于修复、更新大脑受损细胞和清除有害物质；3、缓解压力，促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪。目前工业化生产PS的主流方法是有机溶剂萃取法，存在许多不足1、该方法消耗大量有机溶剂，对环境有一定的危害性；2、大豆中含有多种磷脂成分，各磷脂成分结构相近，性质相似，且PS在含量上相对较少，因此，所提取的PS纯度较低，往往含有其他磷脂，如卵磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺等；3、最后也是最关键的问题就是原料中PS的含量较低，即便是应用含有丰富PS的大豆为原料也存在此问题，大豆中的磷脂类物质占大豆总重的1. 6-2%,这其中PS只占0. 5-1 %，即每千克大豆中只含有80-200mgPS，在加上分离纯化的成本，因此造成产物的价格持续走高。因此PS的制备方法，已成为进行PS应用开发的瓶颈问题。随着人们对健康意识的提高和我国人口老龄化的发展趋势，PS必将受到广泛关注，国外对于PS药物的开发应用已有发展，而我国则刚刚起步。如果能改进生产工艺，利用酶法催化合成PS，将以低价格、高纯度、多功效、无毒副作用等诸多优势用于治疗和大脑有关的疾病，在医药领域拥有广阔的前景。由于传统有机溶液萃取方法存在不足，生产效率极低，人们开始研究PS的合成新方法。磷脂酶DbhospholipaseD，简称PLD) (EC3. 1. 4. 4)，属催化磷酸二脂酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，分布在从细菌到高等动植物的许多生物类群中，其主要生理功能是参与细胞脂质代谢，信号转导及生物膜形成等。近年来，利用磷脂酶D的碱基交换反应特性进行磷脂改性以及制备单一磷脂和稀有磷脂取得重大进展。因此，磷脂酶D的研究工作越来越受到人们的关注。磷脂酶D的研究已开展了近五十年，取得了显著成效。但距工业生产的需要，特别是与其他酶生产和应用相比，存在很大的差距，尤其是我国在这方面的研究工作几乎是空白。究其原因，主要有以下几点1.酶源狭窄且在生物体内含量极微，提纯相当困难；2.酶的稳定性差且只能在异相系统中作用；3.该酶在生物体内的功能及作用机理尚未完全搞清，其应用范围不广。近年来，磷脂酶D在磷脂改性及制备稀有磷脂等方面展现出巨大的潜力和优势又引发了人们新的研究兴趣，特别是高产磷脂酶D菌种的选育，酶的作用机理及工业应用研究已成为当前的研究重点和方向。游离磷脂酶D稳定性差，无法回收利用，酶的固定化技术虽然可以解决以上问题， 但是传统的固定化方法也会产生一些不利因素，例如，固定化过程可能造成酶的活性收率损失；另外，由于固定化操作需用载体，因而增加了载体成本费和固定化操作费用，而酵母细胞表面展示技术为酶的固定化提供了一种新的基于基因重组技术的生物学方法。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制，使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面。目前，最常见的酵母表面展示表达系统包括凝集素展示表达和絮凝素展示表达，通过酵母表面展示表达技术，将目标蛋白或酶固定化在酵母细胞表面，能够提高酶的稳定性和重复利用性，而无需对蛋白进行复杂的分离纯化。目前多种酶类包括脂酶、生物素连接酶、有机磷水解酶、羧酸酯酶、差向异构酶、环糊精葡聚糖转化酶、淀粉酶、纤维素酶等被成功地展示表达在酵母细胞表面且具有生物活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶活力较高的高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备方法。本发明实现目的技术路线如下一种高活力磷脂酶D，高活力磷脂酶D的氨基酸序列是通过分别使如序列7的核苷酸序列编码的野生型磷脂酶D氨基酸序列中GlU69、kr285的氨基酸位点替换，得到如序列 8的核苷酸序列，序列8经在毕赤酵母细胞表面高效表达后获得高活力磷脂酶D。而且，所述野生型磷脂酶D来源是色褐链霉菌AS 4. 331。一种细胞表面展示磷脂酶D毕赤酵母工程菌，其构建过程包括以下步骤(1)定点突变野生型磷脂酶D的成熟肽基因，得到高活力磷脂酶D基因；( 将高活力磷脂酶D基因序列与载体相连，得到携带高活力磷脂酶D基因的重组载体；(3)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母中，得到细胞表面展示磷脂酶D的毕赤酵母工程菌。而且，所述的重组载体为毕赤酵母展示载体pPIC9K_Flo。
而且，所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。一种细胞表面展示高活力磷脂酶D的毕赤酵母全细胞催化剂，其特征在于使用的酵母工程菌为细胞表面展示磷脂酶D酵母工程菌。而且，制备过程包括以下步骤(1)将培养于YPD琼脂固体平板上的酵母工程菌接种至YPD液体培养基中，30°C、 250r/min培养Mh，以(m/m)的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30°C、250r/min培养 24h,然后在4°C、8000r/min离心IOmin得到菌体，转入BMMY培养基中，30°C、250r/min培养 5d，每隔24h加入终浓度为0. 5% V/V甲醇诱导产酶。(2)然后收集发酵液，离心，取菌体沉淀，用双蒸水洗2次，最后用少量双蒸水重悬，加保护剂，通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。本发明的优点和有益效果为1、本发明使用重叠PCR技术，对野生型磷脂酶D进行定点突变(Gly69Glu、 Ser285Ala)，构建酵母表面展示载体pPIC9K-Flo-pldm，转化毕赤酵母，使磷脂酶D展示在酵母表面，高活力磷脂酶D在37°C下，比野生型磷脂酶D活力提高了 11 %，。2、本发明采用酵母展示系统，将磷脂酶D展示于酵母表面，酵母细胞既作为酶的生产者，又可以充当固定化酶中的载体，免去了酶的纯化和固定等操作，简化了生产环节， 降低了生产成本，使酵母展示技术成为酶法催化卵磷脂生成磷脂酰丝氨酸的一个极具潜力的发展方向。3、本发明的磷脂酶D催化反应是在两相系统中进行的，对于游离酶来讲，有机溶剂常常降低其在非水相催化中的活力，展示酶有力地改善了上述缺点。4、本发明提高了磷脂酶D的活力，并将其展示在毕赤酵母细胞表面，提高其稳定性，具有固定化酶的优点，经检测高活力磷脂酶D酶活较野生型提高11 %，重组菌株GSl 15/ pPIC9K-Flo-pldm高密度发酵制备的全细胞催化剂酶活为120U/(g ·干细胞)。
图1为本发明的磷脂酶D成熟肽基因PCR扩增产物电泳图(其中1为DNA Marker, 2为以色褐链霉菌基因组DNA为模板经PCR扩增到的磷脂酶D成熟肽基因)；图2为本发明pPIC9K-Flo-pldm质粒的构建过程；
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一、野生型磷脂酶D成熟肽基因的获得1、野生型磷脂酶D成熟肽基因来自色褐链霉菌(AS 4. 331)，购于中科院微生物研究所，提取其基因组DNA。其中色褐链霉菌基因组DNA的提取步骤如下(1)将培养至对数期的菌液取lmL，12000r/min离心Imin收集菌体。(2)将菌体悬浮于90 μ L ddH20中，加50mg/mL溶菌酶10 μ L，充分混勻后37°C水浴保温20min。
(3)加入400 μ L裂解液混勻至产生大量泡沫，补加5mol/L NaCl 200 μ L，轻轻颠倒混勻，1200r/min 离心 IOmin0(4)上清转移至另一 Ep管中，加1/2体积苯酚和1/2体积氯仿，温和混勻。12000r/ min 离心 3min。(5)取上清，加入1/2体积的苯酚、氯仿反复抽提，离心，吸上清，重复此步骤直到两相界面看不到白色物质为止。(6)加入等体积的氯仿进行抽提，离心，吸上清。(7)用两倍体积的无水乙醇-70°C沉淀DNA大约30min，12000r/min离心8min， 200 μ L70%乙醇洗涤两次，12000r/min离心5min，室温晾干。(8) DNA 溶于 2O μ LddH2O 中 _20 "C 短期保存。2、根据已报道磷脂酶D成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的磷脂酶D成熟肽基因的扩增引物如下上游Pl CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下划线部分为 MluI 酶切位点)下游Ρ2 :CCGGAATTCctacttatcgtcgtcatccttgtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC (下划线部分为EcoRI酶切位点，小写为flag标签)扩增模板为色褐链霉菌基因组DNA，其扩增的反应条件为95°C 5min;94°C lmin，60°C lmin40s，72°C lmin，30 个循环；72°C延长 IOmin ；扩增体系50μ L :ddH20 7. 5 μ L, 2 X buffer 25 μ L, dNTPs 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L 5 μ L，下游弓丨物 10 μ mol/L 5 μ L, DNA 模板 2 μ L, LA TaqDNA 聚合酶 0. 5 μ L ；PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳，得到1500bp左右的条带(图1)，用小量 DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到本发明的野生型磷脂酶D成熟肽基因pld，见序列7。二、高活力磷脂酶D基因获得。(1)野生型磷脂酶D基因连接入T载体。将PCR扩增得到的目的基因进行纯化，将其连入T载体，利用电转化法将该重组质粒转入大肠杆菌JM109中，EcoRI、MluI双酶切和PCR验证结果表明野生型磷脂酶D基因已成功克隆到T载体上。将其测序可知扩增到磷脂酶D基因序列，见序列7。(2)定点突变基于重叠PCR技术进行定点突变，构建高活力磷脂酶D基因。Gly69 — Glu、 Ser285 — Ala设计引物如下上游CCGACGCGTGCCGACCAGGCGCCCGCCTTCCT (下划线部分为 MluI 酶切位点)下游CCGGAATTCctacttatcRtcRtcatccttRtaatcCACGGGGTCGTAGGTGCGC(下划线部分为EcoRI酶切位点，小写为flag标签)重叠弓丨物 P3 :5，-cacgcgccgagagcgaccacacc-3，重叠弓丨物 P4 :5，-ggtgtggtcgctctcggcgcgtg-3，重叠弓丨物 P5 :5，-caggccgccacggccagcggt-3，重叠弓丨物 P6 :5，-accgctggccgtggcggcctg-3，在上游引物和下游引物5’端分别引入MluI和EcoRI酶切位点。重叠引物P3与重叠引物P4互补，重叠引物P5与重叠引物P6互补。重叠引物P3与P4中包含了对69位氨基酸残基的突变。而重叠引物P5与P6中则包含了对285位氨基酸残基的突变。Gly69 — Glu用引物PI、P4扩增上游片段pldl，P3、P2扩增下游片段pld2。PCR反应体系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5yL，重组质粒pUC-T-pld IOOng, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，无菌去离子水补充至 50 μ L0PCR扩增条件为94 V预变性5min，共1个循环；94 °C变性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸lOmin，共1个循环。PCR产物切胶回收，适当稀释。以pldl、pld2为引物，进行PCR。PCR反应体系为 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pldl、pld2 各 1 μ L，LA Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，无菌去离子水补充至48 μ L。PCR扩增条件为94°C预变性5min，1个循环；94°C变性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5个循环；加入引物P1、P2各1 μ L，进行PCR，PCR扩增条件为-MV 预变性5min, 1个循环；94°C变性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30个循环；72°C 延伸lOmin，共1个循环。对PCR反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。得到Gly69 — Glu 的磷脂酶D突变体。Ser285 — Ala用磷脂酶D突变基因Gly69 — Glu为模板，引物P1、P6扩增上游片段pld3，P5、P2 扩增下游片段Pld4。PCR反应体系包括2 Xbuffer 25 μ L, dNTP 2 μ L，上游引物P1、P3/下游引物P2、 P4各5 μ L，磷脂酶D突变基因Gly69 — Glu 2 μ L, LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L，无菌去离子水补充至50 μ L0PCR扩增条件为94 V预变性5min，共1个循环；94 °C变性lmin，60 °C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸lOmin，共1个循环。PCR产物切胶回收，适当稀释。以pld3、pld4为引物，进行PCR。PCR反应体系为 2Xbuffer25y L, dNTP 2 μ L, pld3、pld4 各 1 μ L, LA Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ L，无菌去离子水补充至48 μ L。PCR扩增条件为94°C预变性5min，l个循环；94°C变性lmin，60°C退火 lmin40s，72°C延伸lmin，5个循环；加入引物P1、P2各1 μ L，进行PCR，PCR扩增条件为-MV 预变性5min, 1个循环；94°C变性lmin，60°C退火lmin40s，72°C延伸lmin, 30个循环；72°C 延伸lOmin，共1个循环。对PCR反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。得到 Gly69 — Glu、Ser285 — Ala的高活力磷脂酶D基因ρIdm,见序列8。三、磷脂酶D基因工程菌的构建1、重组质粒pPIC9K-Flo-pldm的构建与鉴定将重叠PCR纯化产物与载体pPIC9K_Flo经MluI和EcoRI双酶切后，分别用小量 DNA回收试剂盒回收酶切产物，应用DNA连接试剂盒的Solution I在16°C的条件下连接 12h，将高活力磷脂酶D基因定向连接至载体pPIC9K-Flo，将连接产物应用化学转化法转化到E. coliDH5a感受态中，在含有Amp的LA培养基中筛选培养，挑取阳性转化子，培养后提质粒，用MluI和EcoRI双酶切鉴定，测序，命名为pPIC9K-Flo-pldm。
其中大肠杆菌化转感受态的制备方法(1)从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落，接种于2mL LB培养基试管中，37 °C 180r/min摇床培养过夜；(2)取500yL菌液转接到一个含有50mL LB培养基的250mL锥型瓶中，37 °C 180r/min摇床培养2 3h。(3)将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置IOmin ；(4)4°C,4000r/min离心lOmin，回收菌体细胞，倒出培养液，将管倒置lmin，以便
液体培养基流尽；(5)用冰冷的0. ImoVLCaCl2溶液IOmL悬浮沉淀，立即放在冰上保温30min ；(6) 4°C、4000r/min 离心 lOmin，回收菌体细胞；(7)用冰冷的0. ImoVLCaCl2和15%的甘油混合液2mL重悬细胞；(8)分装细胞，每份50 μ L，即得到感受态细胞。其中重组质粒pPIC9K-Flo-pldm化学转化E. coli DH5 α感受态的具体步骤为(1)加入IOyL质粒DNA连接产物于100 μ L感受态中，充分混勻；(2)冰上放置 30min，42°C水浴 90s ；(3)冰上放置1 2min ；(4)将感受态细胞加入800 μ LLB培养基中，摇床37°C，180r/min复苏培养Ih ；(5)复苏培养后，取菌液8000r/min离心2min，吸掉1/3上清液后，将菌体重悬，涂布于Amp抗性平板，37°C倒置培养12 16 ；2、毕赤酵母GS115基因工程菌的构建将测序正确的重组质粒经MlI线性化后，LiCl法转化毕赤酵母GS115，MD平板筛选重组子，挑取阳性转化子，进行诱导表达。其中毕赤酵母GS115感受态的制备方法为(1)在YPD平板上划线培养，挑取单菌落，接种于50mLYPD液体培养基中，30°C， 250r/min 振荡培养至 OD600 = 0 . 8 1. 2。(2)收集菌体细胞，用30mL的无菌水冲洗3次，4°C，5000r/min离心lOmin。(3)除净无菌水后用ImL 0. lmol/L的LiCl轻轻重悬菌体细胞。(4)在超净工作中将菌体细胞悬浊液转移至1. 5mL无菌的离心管中。(5)室温12000r/min离心lmin，沉淀菌体细胞并用无菌枪头除净LiCl。(6)加入400 μ L 0. lmol/L的LiCl重悬菌体细胞。(7)将50 μ L的细胞悬浊液分装到1. 5mL的无菌离心管中。其中重组质粒pPIC9K-Flo-pldm化学转化GS115感受态的具体步骤为(1)煮沸单链DNA5min，快速置于冰上冷却。(2)取新制备的感受态细胞12000r/min离心IOmin除净LiCl。(3)将每个转化的样品按顺序加入以下试剂240μ 40%的PEG，36yL IM LiCl，10μ LDNA。(4)剧烈涡旋细胞沉淀至其完全混勻(大约需:3min左右)。(5)在30°C的水浴中静止放置30min。(6)在42°C的水浴中热击20 25min。
8
(7)30°C，6000r/min 离心 5min，除净上清溶液。(8)用0. 5mL的无菌水重悬菌体细胞沉淀。(9)在MD平板上均勻涂布100 300 μ L的重悬细胞溶液，在30°C倒置培养48 96h。其中诱导表达的具体方法为将重组毕赤酵母pPIC9K-Flo-pldmGS115接种于20mL含有0. 5%甘油的BMGY培养基中，28°C，250r/min振荡培养Mh，然后每隔24h向培养基中加入终浓度0. 5% (V/V)的甲醇，继续在，250r/min条件下振荡培养120h。四、全细胞催化剂的制备及其水解活力的测定1、全细胞催化剂的制备(1)将培养于YPD琼脂固体平板上的毕赤酵母重组菌株接种至YPD液体培养基中， 30°C、250r/min培养Mh，以的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30°C、250r/min培养 24h,然后在4°C、8000r/min离心IOmin得到菌体，转入BMMY培养基中，30°C、250r/min培养 5d，每隔24h加入终浓度为0. 5% (V/V)甲醇诱导产酶。(2)然后收集发酵液，离心，取菌体沉淀，用双蒸水洗2次，最后用少量双蒸水重悬，加保护剂，通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。2、全细胞催化剂水解活力的测定采用酶联比色法进行活性检测磷脂酶D催化水解L-α -卵磷脂生成胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化酶的作用下与4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质，在A = 500nm下具有吸光值。反应体系将220mg的L- α -卵磷脂溶于含有3mL 50mM的SDS溶液、6mL IM NaOAc缓冲液(pH = 8. 0)、39mL的去离子水、 0. 272mL17. 9%的乙醇溶液(终浓为)的混合体系作为底物溶解液。将39mg 4-氨基氨替比林、80mg苯酚及8mg过氧化物酶溶于5. 5mL的IOOmM Tris HCl (pH = 8)缓冲液中作为胆碱显色剂。取2. 4mL底物溶液、0. 3mL的500mM CaCl2溶液、0. 2mL的去离子水混合并置于 37°C水浴。然后加入0. ImL的酶液，混合均勻，于37。C反应lOmin，沸水浴终止反应，待冷却至室温加入0. 05mL 2M Tris-HCl (pH = 9)缓冲液，混合并离心后，上清液用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取滤液2mL与0. ImL胆碱显色剂、0. ImL胆碱氧化酶溶液室温反应2.证。在反应混合物中加入2. OmL去离子水，离心得到澄清透亮的粉红色溶液，最后于A5tltlnm检测吸光值。 酶活定义pH = 8.0、T = 37°C时，磷脂酶D Imin内催化水解L-α -卵磷脂释放l.Oymol 的胆碱所需要的酶量。测得表面展示高活力磷脂酶D的全细胞催化剂酶活为120U/(g·干细胞)，较野生型磷脂酶D提高了 11%。SEQUENCE LISTING<110>天津科技大学<120>高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备<130>2011-07-14<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1
<211>32<212>DNA<213>P1上游引物序列<400>1ccgac gcgtg ccgac caggc gcccg ccttc ct32<210>2<211>52<212>DNA<213>P2下游引物序列<400>2ccgga attcc tactt atcgt cgtca tccttgtaat ccacg gggtc gtagg tgcgc 55<210>3<211>23<212>DNA<213> 引物序列 P3<400>3cacgc gccga gagcg accac acc 23<210>4<211>23<212>DNA<213> 引物序列 P4<400>4ggtgt ggtcg ctctc ggcgc gtg 23<210>5<211>21<212>DNA<213> 引物序列 P5<400>5caggc cgcca cggcc agcgg t21<210>6<211>21<212>DNA<213> 引物序列 P6<400>6accgc tggcc gtggc ggcct g21<210>7<211>1533<212>DNA<213>野生型磷脂酶D成熟肽基因0169]<400>70170]gccgaccaggCgCCCgCCttcctgcacggc0171]gtcctgctgtggacccgggtgaccccggtg0172]ccggacaccgaggtcggctgggtcgtcgcc0173]aagggctcgaccaccgcacgcgccgggagc0174]CtggCCCCggccaccgactactggttccgc0175]gcgcgcacccgcaccgcgccggcggcggac0176]gtgtcctgcgccaactgggaggcgggctac0177]aacgacctggacgcctggctgcacctcggc0178]tacgcggcccggggcaccgtCgtgCggCCg0179]gccgactaccgcacccggcacgccaagtac0180]ctgaaggcgccggtcatcgcgatctgggac0181]ggcggcgcggtgaaccacaccgagggcgcc0182]gccaagcaggcctacttcgagtggatgccg0183]CggCggCtgCgcttcggcaagctcgccgac0184]tcccagcaggcctccacggccagcggttcg0185]cgcgcgcagctcgactggctcaaggccggc0186]gtcggcaactccgtgatgatctcgccgttc0187]aagccgctcgccaagctgctgggcctgccg0188]tgggacggctacaccgacgaccggcgcgaa0189]ggcaacaccgtcttcctgaccggtgacatc0190]gacgcgggcacctatccgctgtcggcgtcc0191]acctccgacaacctcgacgacatcgtgaag0192]tcgccggtcatcaaggccgccaaccggcac0193]tacggcgtgctggacatcaccgccgaccgc0194]cgcaccgacgcgaacgcgacCtCggCgtgg0195]cagcgggtagagcgcacctacgaccccgtg0196]<210>80197]〈211>15330198]<212>DNA0199]〈213〉高活力磷脂酶D基因0200]〈400>80201]gccgaccaggCgCCCgCCttcctgcacggc0202]gtcctgctgtggacccgggtgaccccggtg0203]ccggacaccgaggtcggctgggtcgtcgcc0204]aagggctcgaccaccgcacgcgccgagagc0205]CtggCCCCggccaccgactactggttccgc0206]gcgcgcacccgcaccgcgccggcggcggac0207]gtgtcctgcgccaactgggaggcgggctac
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1.一种高活力磷脂酶D，其特征在于高活力磷脂酶D的氨基酸序列是通过分别使如序列7的核苷酸序列编码的野生型磷脂酶D氨基酸序列中GlU69、kr285的氨基酸位点替换， 得到如序列8的核苷酸序列，序列8经在毕赤酵母细胞表面高效表达后获得高活力磷脂酶 D0
2.根据权利要求1所述的高活力磷脂酶D，其特征在于所述野生型磷脂酶D来源是色褐链霉菌AS 4. 331。
3.一种细胞表面展示磷脂酶D毕赤酵母工程菌，其特征在于其构建过程包括以下步骤(1)定点突变野生型磷脂酶D的成熟肽基因，得到高活力磷脂酶D基因；(2)将高活力磷脂酶D基因序列与载体相连，得到携带高活力磷脂酶D基因的重组载体；(3)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母中，得到细胞表面展示磷脂酶D的毕赤酵母工程菌。
4.根据权利要求3所述的细胞表面展示磷脂酶D毕赤酵母工程菌，其特征在于所述的重组载体为毕赤酵母展示载体pPIC9K-Flo。
5.根据权利要求3所述的细胞表面展示磷脂酶D毕赤酵母工程菌，其特征在于所述的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
6.一种细胞表面展示高活力磷脂酶D的毕赤酵母全细胞催化剂，其特征在于使用的酵母工程菌为细胞表面展示磷脂酶D酵母工程菌。
7.根据权利要求6所述的细胞表面展示高活力磷脂酶D的毕赤酵母全细胞催化剂，其特征在于制备过程包括以下步骤(1)将培养于YPD琼脂固体平板上的酵母工程菌接种至YPD液体培养基中，30°C、250r/ min培养Mh，以的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30°C、250r/min培养Mh，然后在 4°C、8000r/min离心IOmin得到菌体，转入BMMY培养基中，30°C、250r/min培养5d，每隔24h 加入终浓度为0. 5% V/V甲醇诱导产酶。(2)然后收集发酵液，离心，取菌体沉淀，用双蒸水洗2次，最后用少量双蒸水重悬，加保护剂，通过真空冷冻干燥得到全细胞催化剂干粉。
全文摘要
本发明涉及一种高活力磷脂酶D及细胞表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备，属于用重组DNA技术定点突变野生型磷脂酶D，以改善其活性，并将突变后基因与酵母展示载体pPIC9K-Flo连接，将其在毕赤酵母细胞表面高效展示的方法，涉及具有高活力磷脂酶D及表面展示磷脂酶D酵母全细胞催化剂的制备方法。本发明提高了野生型磷脂酶D的活力，并将其展示在酵母细胞表面，提高其稳定性，具有固定化酶的优点。其技术方案是从微生物特别是色褐链霉菌中分离野生型磷脂酶D基因，对其Glu69、Ser285的氨基酸残基进行突变，经在毕赤酵母细胞表面高效表达，检测高活力磷脂酶D酶活较野生型磷脂酶D提高11％，重组菌株GS115/pPIC9K-Flo-pldm高密度发酵制备的全细胞催化剂酶活为120U/(g·干细胞)。
文档编号C12N9/16GK102286440SQ20111020648
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者刘逸寒, 王建玲, 王春霞, 薄嘉鑫, 路福平 申请人:天津科技大学