专利名称：一种沙眼衣原体的pcr荧光定量快速检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒及其方法。
背景技术：
沙眼衣原体是一类能通过滤菌器，严格真核细胞内寄生，有独特发育周期的原核细胞型微生物。它能引起沙眼，包涵体包膜炎，泌尿生殖道感染以及性病淋巴肉芽肿。注射沙眼衣原体疫苗后，可以诱发局部特异性免疫，但其保护作用仅能维持1-2年。《伯氏系统手册》(1984)的记载，将沙眼衣原体Chlamydia trachomatis分为3个生物型，即小鼠生物型(biovar mouse)，沙眼生物型(biovar trachoma)和性病淋巴肉芽肿生物型 (biovarlymphogranulomavenereum, LGV)，后二者与人类疾病有关。用间接微量免疫荧光试验，沙眼生物型又分A. B. Ba. C. D. Da. E. F. G. H. I. Ia. J. K14个血清型，LGV生物型又有 Li. L2. L2a. L34个血清型。沙眼生物变种D K血清型和沙眼衣原体LGV生物变种可以导致男性非淋球菌性尿道炎.女性宫颈炎.输卵管炎.不孕症等。目前衣原体感染已经成为一个严重的社会问题。一方面衣原体已成为性病中最多见的一种病原体，另一方面是它可出现严重的持续性感染现象。最高可有70%的妇女宫颈炎和50%的男性尿道感染是无症状的携带者，因无自觉症状，这些人在社会上是一个高危的潜在传染源。有学者报道，经衣原体阳性母亲产道出生的婴儿，有50% 70%的机会可以获得衣原体感染。有鉴于此，西方国家法定衣原体感染是一项孕妇产前必查的常规项目。所以提早诊断衣原体感染，对优生优育有着极大的意义。另外，CT的脂多糖可以诱导TNF-α的产生，刺激吞噬细胞活性，从而导致组织损伤。CT是HIV传播的辅助因子，感染CT的女性发生HIV感染较无CT感染的女性高3 5 倍，治疗CT可降低HIV的传播。作为成人泌尿生殖道的一种常见的寄生微生物，CT可引起人类感染多种疾病。目前已经有多种方法可以利用一定的实验室条件对CT作出及时，准确的诊断。用宫颈或尿道拭子做衣原体培养是检测衣原体的金标准，特异性可达100%，敏感性为80% 90%。最常用的方法是将样本接种于经过环已米特(放线菌酮)处理的McCoy 细胞。培养需要48 72h，用碘染色或吉姆萨染色观察包涵体。如直接免疫荧光法.酶免疫测定(EIA)等，也是用宫颈或尿道拭子做样本。直接免疫荧光法是通过荧光标记特异抗体直接测定衣原体的脂多糖或主要外膜蛋白抗原，特异性96% 100%，敏感性80% 85%。EIA直接测定衣原体脂多糖抗原，与样本中的其它革兰氏阴性菌脂多糖抗原有交叉反应，敏感性相当于培养法的60% 80%，特异性96% 100 %。上述方法若用于尿检时，敏感性只有40 % 50 %，因此不适用于筛查。DNA扩增技术包括聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)，可以直接检测样本中沙眼衣原体质粒或外膜蛋白的核苷酸序列。RNA扩增法扩增的是衣原体核糖体RNA。可以采取尿样做样本，敏感性94% 100%，特异性98% 100%，可用于筛查试验。目前细胞培养的金标准地位正在被PCR和LCR法所取代。随着分子生物学的发展，转录介导的扩增试验、酶放大免疫反应、半巢式PCR-微空板杂交法、巢式PCR、实时荧光PCR定量检测等方法都在应用，提高了检测的准确性和敏感性，为临床提供了无创、灵敏、快速的检测手段，可用于筛查试验。目前，国内主要从事CT核酸检测的研发生产公司多采用荧光PCR方法进行CT-DNA 定量检测，该法操作简便，灵敏度高，结果便于分析。华美生物公司采用传统PCR技术先对 CT目标基因进行扩增，再将扩增产物结合ELISA方法与固定在酶标板的特异性探针进行杂交，之后采用ELISA法进行显色滴定以进行CT-DNA定量，该法的优点在于不需要添置额外的荧光PCR仪，但该法操作繁琐，易造成操作污染。Roche公司最早推出的产品是电泳法分析扩增产物，尔后，在试剂的技术性上有了很大改进，其最明显的是对产物检测的方法的改进，继其电泳法试剂之后正式推出了基于ELISA原理的PCR试剂盒。目前，又有许多公司在研制基于荧光能量转移原理的CTPCR试剂盒，至此，PCR技术用于沙眼衣原体的检测已经发展到非常成熟的阶段。
发明内容
本发明目的是提供一种适用于临床样本中沙眼衣原体的快速检测的试剂盒，可用于沙眼衣原体感染的辅助诊断及疗效监控。为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液含有引物和荧光探针；所述引物分为上游引物和下游引物；上游引物5，-CTGTACATTAGGAGCCACCA-3，；下游引物5，-CAACAGATTGATCAAAGCTC-3，；荧光探针5，-FAM-GATATCTTAAAGGAAATTCAGCATCTTTCAA-TAMRA-3，。作为本发明的进一步设置，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、阳性质控品、弱阳性质控品、阴性质控品、阳性定量参比品、DNA提取液。作为本发明的进一步设置，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针、引物和内参DNA，所述内参照系统包括上游引物序列 SEQ ID NO. 4、下游引物序列=SEQ ID NO. 5和探针序列=SEQ ID NO. 6。作为本发明的进一步设置，所述内参照系统为拟南芥内参照系统。作为本发明的进一步设置，所述阳性质控品浓度为10倍梯度IO6Copies/ mL-107copies/mL，所述弱阳性质控品浓度为 10 倍梯度 103copies/mL-104copies/mL。作为本发明的进一步设置，所述DNA聚合酶包括tap酶、UNG酶。本发明的另一个技术方案为提供一种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测方法， 其中PCR扩增所用引物为上游引物序列如SEQ ID NO. 1，下游引物序列如SEQ ID N0. 2，荧光探针序列如SEQ ID N0. 3。作为上述方法的进一步设置，所述荧光探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记 TAMRA淬灭基团。本发明的CT荧光PCR定量检测试剂盒和方法，利用了 Taqman核心技术平台和拟南芥内参照系统，并可有效去除抑制PCR扩增的抑制物，使定量更为准确。与实验室单纯PCR定量检测相比，本产品准确性高、特异性强，而且在重复性、稳定性、灵敏度和精密度都有了很大的改进，提高，显示其具备以下性能(1)准确性检测企业内控参比品Zl-ZlO样本，结果全阴阳性符合率为100%。(2)特异性检测企业内控参比品Tl-TlO样本结果全部为阴性。(3)灵敏度能稳定检测CT-DNA的最低检出限为5. 0 X 102COpieS/mL。(4)精密度检测企业内控参比品S1-S4，每个样本重复5次，计算批内差和批间差均CV值彡10%。(5)稳定性产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定。
图1 灵敏度参比品检测结果图；图2 精密度参比品检测结果图；图3 阳性准确性Z1-Z5参比品检测结果图；图4 :Z6-Z10阴性准确性参比品检测结果图；图5 特异性Tl-TlO参比品检测结果图；图6 :Z6-Z10阴性准确性内参照参比品检测结果7 特异性Tl-TlO内参照参比品检测结果图；图8 试剂盒中阳性对照、临界阳性对照、阴性对照参比品检测结果图；图9 试剂盒中标准品Ie4_le7参比品检测结果图；图10 标准曲线Ie4_le7参比品检测结果图。
具体实施例方式本试剂盒采用聚合酶链式反应(PCR)及荧光标记探针技术，快速检测临床样品中沙眼衣原体特有序列，从而判断沙眼衣原体的存在。对保守序列我们共设计多对引物，并进行了详细的比较，最后选择了灵敏度、特异性和选择性均较好的引物。在引物扩增片段内我们设计了检测CT基因的通用双环探针，使用FAM标记，并且对探针进行全面的质控和初步实验。双扩增体系中所需要的通用标签序列，我们在设计时，随机设计20条GC含量在 55%左右，ATGC四种碱基随机分布的、碱基数量在18-22bp间的寡核苷酸序列，使用软件 Primer 5. 0分析引物自身结构以及与突变特异引物和双环探针间的交叉二聚体形成情况， 从中选择出自身二级结构最少，交叉二聚体AG较低的引物，然后在NCBI网站上Blast确定标签引物的无种属性和无相似核酸序列存在。实施例1试剂盒的组成及配置1.主要原材料来源及制备方法本试剂盒的CT引物和探针序列如下上游引物5‘ -CTGTACATTAGGAGCCACCA-3 ‘；下游引物5‘ -CAACAGATTGATCAAAGCTC-3 ‘；荧光探针5' -FAM-GATATCTTAAAGGAAATTCAGCATCTTTCAA-TAMRA-3'。
本试剂盒的内参照(Sue)引物上游引物序列SEQ ID NO. 4、下游引物序列SEQ ID NO. 5和探针序列=SEQ ID NO. 6，具体如下上游引物5‘ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 ‘；下游引物5‘ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3 ‘；荧光探针5' -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3'。所述试剂盒还包括DNA聚合酶、强阳性质控品、弱阳性质控品.阴性质控品、阳性定量参比品、DNA提取液。1. 1.引物用于PCR反应的引物，紫外检测结果A260nm A280nm彡1. 5可视为合格引物。_20°C保存。1. 2.探针CT探针在寡核苷酸5’端标记FAM，3’端标记BHQ，紫外检测结果 A260nm A280nm彡1. 5，在FAM荧光素的激发波长520nm处有吸收峰。-20°C保存。SUC II探针在寡核苷酸5，端标记HEX，3，端标记BHQ，紫外检测结果 A260nm A280nm彡1. 5，在HEX荧光素的激发波长555nm处有吸收峰。-20°C保存。1. 3. DNA 聚合酶(含 10 X PCR buffer. MgC12)浓度5U/μ 1，含10XPCR Buffer. 25mmol/LMgCl2，根据供应商质量标准本品具有 DNA聚合酶活性，无3’一 5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94°C保温1小时后仍保持50 %活性。-20 0C保存。1. 4. dN(U) TP包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP。根据供应商质量标准为HPLC纯，无DNase和RNase 污染。_20°C保存。1. 5. UNG 酶使用Fermentashtenational INC. (MBI 公司)产品。核对其技术参数SDS-PAGE 检测，纯度> 95%，具有特异降解DNA链中dUTP位点的特性，95°C 10分钟后可将其灭活。 UNG酶的质检与引物同时进行，检测性能符合引物原材料质量标准方可用于产品生产。1. 6.纯水使用泰普公司制备的纯水，肉眼观察清澈无杂质，经DDB-305型电导率仪测定其电阻率取值在1. OM Ω/cm以上。纯水的质检与引物质检同时进行，性能检测符合引物原材料质量标准方可用于产
品生产。2. PCR反应液的制备2. 1配液前准备(l)dN(U) TP将购买的IOOmM 的 dATP、dUTP、dGTP、dCTP，按照 1 : 1· 5 : 1 : 1 (体积比)混合，混合液各成分浓度分别为10mM. 15mM. IOmM. IOmM取0. 5mL离心管，分装成每管100 μ L dN(U) TP的母液。(3)引物
将合成的引物13000rpm离心lmin，加入适量纯水(根据合成量计算)将引物溶解成100 μ M，取0. 5mL离心管，分装成每管100 μ L的引物母液。进行生产前需加入适量纯水配制成10 μ M使用液。(3)探针将合成的探针13000rpm离心lmin，加入适量纯水(根据合成量计算)将探针溶解成100 μ M，取0. 5mL离心管，分装成每管100 μ L的探针母液。进行生产前需加入适量纯水配制成10 μ M使用液。2. 2. PCR反应液配液1.如表1为本发明PCR反应液配方。表1 CT-PCR反应液配方
权利要求
1.一种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液含有引物和荧光探针；所述引物分为上游引物和下游引物上游引物5’ -CTGTACATTAGGAGCCACCA-3’ ；下游引物5，-CAACAGATTGATCAAAGCTC-3，；荧光探针5，-FAM-GATATCTTAAAGGAAATTCAGCATCTTTCAA-TAMRA-3，。
2.按权利要求1所述的沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、阳性质控品、弱阳性质控品、阴性质控品、阳性定量参比品、DNA 提取液。
3.按权利要求1所述的沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性，内参照系统包括内参探针、引物和内参DNA。
4.按权利要求3所述的沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，所述内参照系统包括上游引物序列SEQ ID NO. 4、下游引物序列 SEQ ID NO. 5 和探针序列SEQ ID NO. 6。
5.按权利要求1所述的沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品浓度为10倍梯度106COpies/mL-107COpies/mL，所述弱阳性质控品浓度为10倍梯度 103copies/mL_104copies/mLo
6.按权利要求1所述的沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，其特征在于，所述 DNA聚合酶包括tap酶、UNG酶。
7.—种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测方法，其特征在于，其中PCR扩增所用引物为上游引物序列如SEQ ID NO. 1，下游引物序列如SEQ ID NO. 2，荧光探针序列如SEQ ID NO. 3。
8.按权利要求7所述的沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测方法，其特征在于，所述荧光探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。
全文摘要
本发明目的是提供一种适用于临床样本中沙眼衣原体的快速检测的试剂盒，可用于沙眼衣原体感染的辅助诊断及疗效监控。本发明的技术方案为提供一种沙眼衣原体的PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液含有引物和荧光探针；所述引物分为上游引物和下游引物，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、强阳性质控品、弱阳性质控品、阴性质控品、阳性定量参比品、DNA提取液。本发明的CT荧光PCR定量检测试剂盒和方法，利用了Taqman核心技术平台和拟南芥内参照系统，检测的灵敏度更高。并且准确性、特异性、重复性、稳定性、灵敏度和精密度相对现有产品有了提高。
文档编号C12Q1/68GK102329866SQ201110279330
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者何东华, 蔡晓沂 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司