专利名称：一种快速高效筛选l-精氨酸高产菌株的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法，属于工业微生物育种技术领域。
背景技术：
L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，因此在医药和食品工业中具有广泛用途。发酵法生产L-精氨酸是目前商业化生产比较有效和经济的方法，而优良的L-精氨酸高产菌株是发酵生产L-精氨酸的关键。目前L-精氨酸高产菌株的选育主要是通过传统的诱变育种和现代基因工程育种获得，其中基因工程育种因其目的性强，工作量小而倍受研究者们青睐，而诱变育种获得的菌种生产性能往往较稳定，因此仍在生产实践中广泛运用。生产实践中还发现，产L-精氨酸菌种在保存传代过程中，生产性能会逐渐衰退，产酸和转化率会不断下降，因此必须定期进行复壮，即从衰退的菌株中，通过分离、纯化筛选出未衰退的菌株，这样才能保持菌株的高产性能，不断满足生产需要。无论是用传统诱变、用现代基因工程手段对现有L-精氨酸高产菌株的改造，还是高产菌株的复壮，都需要从众多的单菌株中挑选出高产菌株。所以，高产L-精氨酸菌株的选育工作在L-精氨酸的发酵生产中必不可少。传统的L-精氨酸高产菌株的筛选主要是通过筛选抗L-精氨酸结构类似物菌株，抗结构类似物抗性强的菌株其产量相应就会较高。但是，由于L-精氨酸的结构类似物种类较多且价格昂贵，因此使得筛选工作强度大、效率低且成本较高。本发明从另一角度出发，建立了一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的平板显色法。微生物中从L-谷氨酸合成L-精氨酸有3条途径线性途径、循环途径及新发现的利用氨甲酰基转移酶进行L-精氨酸生物合成的新途径，大肠杆菌及古细菌主要以线性途径合成L-精氨酸，而酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌、假单胞菌等微生物则以循环途径合成L-精氨酸，图1。大肠杆菌中，L-精氨酸合成途径中的N-乙酰谷氨酸激酶argB恰好位于精氨酸琥珀酸酶argH的上游，本发明通过敲除argH基因获得L-精氨酸缺陷型大肠杆菌，以 E. coli BL21基因组DNA为模板PCR获得argBH基因片段，在argH内部插入卡那霉素抗性基因(Kan)，实现对argH的敲除从而获得该酶缺失的L-精氨酸缺陷型大肠杆菌。将L-精氨酸缺陷型菌株作为L-精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以TTC为显色剂实现钝齿棒杆菌胞外精氨酸浓度高低的定性筛选，在平板上初筛出合成L-精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株，进而再通过摇瓶发酵复筛，该方法大大提高了菌种选育中的筛选效率而且节约了成本。因此，本发明对筛选高产L-精氨酸菌株有着积极的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于大肠杆菌L-精氨酸缺陷型菌株，快速高效筛选 L-精氨酸高产菌株的方法。
本发明的技术方案首先构建大肠杆菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株，应用该菌株平板显色法筛选L-精氨酸高产菌株。大肠杆菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株构建方法如下(l)argBH 的扩增以 E.coli BL21 基因组 DNA 为樽板，用引物P15’-CGCGAATTCATG AATCCATTAATTATCAAACTGG-3，(EcoR I)、P25，CGCGTCGACTTACCCTAACCGAGC CTGC-3，(Sal I) 扩增argBH基因，扩增循环条件94°C预变性5min，94°C变性40s，56°C退火90s，72°C延伸 90s, 35个循环。(2)质粒pMD-18T-argBH: :Kan的构建PCR获得的argBH基因片段电泳胶回收后与pMD-18T载体16°C过夜连接，转化E. coli JM109,挑取阳性转化子并验证获得E. coli JM109 (pMD-18T-argBH)。将T-Kan用EcoRV酶切后胶回收其中大小约为1. 4kb的包含Kan 抗性基因的片段，并将其与同样用EcoRV酶切后的T-argBH进行连接(EcoRV位点位于argH 内部)，转化E. coli JM109，挑取阳性转化子并验证获得E. coli JM109 (T-argBH: :Kan)。(3)Ε. coliBL21精氨酸缺陷型菌株的获得将质粒T-argBH: :Kan以EcoRI、XhoI 酶切，胶回收得到argBH: :Kan片段。热击转化E.coli BL21，卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子。将得到的阳性转化予分别点种于基本培养基(MM)平板和补充培养基(SM)平板对比培养，在匪平板上无法生长，在添加了 L-精氨酸的SM平板上正常生长的初步认为是 L-精氨酸缺陷菌株。提取转化子的染色体DNA，用argBH基因的引物扩增argBH: :Kan，验证阳性转化子。由此获得E.coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株。快速筛选高产L-精氨酸菌株平板显色法的建立所述的快速筛选平板显色法用到的基本培养基(g/L):葡萄糖10，(NH4)2S043, KH2PO4I, MgSO4 · 7H20 0. 5，FeSO4 · 7H20 0. 02，MnSO4 · H2O 0. 02，琼脂 20，生物素 8 X 10_5，硫胺素 2X1(T4，L-组氨酸 5X1(T4。pH 7. O 7. 2，1 X IO5Pa 灭菌 20min。所述的快速筛选平板显色法用到的补充培养基(g/L)基本培养基中以20mg/L添加 L-精氨酸，pH 7. O 7. 2，1 X IO5Pa 灭菌 20min。所述的快速筛选平板显色法用到的筛选培养基基本培养基中以IO5个/mL细胞浓度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株。所述的快速筛选平板显色法是在基本培养基中以IO5个/mL细胞浓度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株制成筛选平板，将本实验室保藏L-精氨酸产量不等的4株钝齿棒杆菌以相同量点种至筛选平板，30°C培养5-7d，于超净工作台均勻喷洒无菌lyg/mL TTC 溶液(膜过滤除菌)，37°C放置l_2h，观察平板上显色情况。快速筛选高产L-精氨酸菌株平板显色法的应用基本培养基中以IO5个/mL细胞浓度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株制成筛选平板，将待筛选的菌株制成一定浓度的菌悬液，10倍系列稀释涂布于该平板上，30°C培养5-7d，于超净工作台均勻喷洒无菌1 μ g/mL TTC溶液(膜过滤除菌)，37°C放置l_2h，观察平板上显色情况。本发明的有益效果传统的L-精氨酸高产菌株的筛选方法是筛选抗L-精氨酸结构类似物菌株，本发明根据高产L-精氨酸菌株特点，利用L-精氨酸缺陷型菌株与L-精氨酸生产菌株之间的交互供养，以TTC为显色剂，间接直观、快速筛选出L-精氨酸高产菌株， 大大提高了筛选工作效率并且节约了成本。
图 1 质粒 pMD-18T_argBH: :Kan 的构建图2微生物L-精氨酸的合成途径图 3a argBH 基因的扩增 1 XDNA/Hindlll ；2 :argBH gene. 3b T-EcargBH :Kan 酶切验 iiE 1. DL2000 ；2. T-EcargBH: Kan/EcoRI+Sal I ；3. T-EcargBH/EcoRV ； 4. T-EcargBH: :Kan/EcoRV ；5. T-EcargBH: :Kan/EcoRI ；6. λ DNA/HindIII图4argBH基因敲除转化子的PCR鉴定1 5 argBH PCR of 1 5transformants6 7 :kan PCRof 1 2transformants ；8 λ HindIII Marker图5L-精氨酸产量不等的4株钝齿棒杆菌缺陷型菌株平板显色法结果
具体实施例方式实施例1 卡那霉素抗性基因(Kan)插入大肠杆菌BL21L-精氨酸合成途径中精氨酸琥珀酸酶基因内部实现敲除目的获得缺陷型菌株argBH的扩增及质粒pMD_18T_argBH: :Kan的构建根据GeneBank中公布的argBH 序列设计 PCR 获得 argBH 的引物 P15，-CGCGAATTCATGAATCCATTAATTATCAAACTGG-3> (EcoR I)P25' CGCGTCGAC TTACCCTAACCGAGCCTGC-3，(Sal I)。以 Ε· coli BL21 基因组 DNA 为模板，用引物Pl、P2扩增argBH基因，扩增循环条件94°C预变性5min，94°C变性40s, 56°C 退火90s，72°C延伸90s，35个循环，扩增产物通过0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，如图3a所示，可以看出在2. 2kb处有一明亮的带，这与argBH基因预期大小一致。PCR获得的argBH 基因片段电泳胶回收后与PMD-18T载体16°C过夜连接，转化E. coli JM109，得到E. coli JM109 (pMD-18T-argBH)。重组质粒 pMD_18T_argBH 用 EcoRV 酶切，线性化后胶回收 4. 7kb 的T-argBH片段，将T-Kan用EcoRV酶切后胶回收其中大小约为1. 4kb的包含Kan抗性基因的片段，并将其与同样用EcoRV酶切后的T-argBH进行连接，得到T-argBH: :Kan，酶切验证结果见图北，可以看到，第三泳道质粒T-EcargBH以EcoRV酶切释放4. 7kb大小的片段， 表明T-EcargBH构建成功，第二泳道质粒T-EcargBH: :Kan以EcoRI、Sail双切释放3. 4kb 和2. 7kb大小的片段，第四泳道T-EcargBH: :Kan以EcoRV酶切释放4. 7kb和1. 4kb大小的片段，表明T-EcargBH: :Kan构建成功。E. coli BL21精氨酸缺陷型菌株的获得将质粒T-argBH:: Kan以EcoRI、BioI酶切，胶回收得到argBH: :Kan片段。热击转化E.coli BL21，卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子。将得到的阳性转化予分别点种于基本培养基(MM)平板和补充培养基(SM)平板对比培养，在MM平板上无法生长，在添加了 L-精氨酸的SM平板上正常生长的初步认为是 L-精氨酸缺陷菌株。提取转化子的染色体DNA，用argBH基因的引物扩增argBH: :Kan，验证阳性转化子，验证结果如图4所示阳性转化子的原argBH基因被含有Kan片段长度大约为 3. 4kb的argBH: Kan替换，而原始对照菌株argBH基因长度约2. 21Λ，两者相差约1. 21Λ。说明阳性转化子已经成功的用argBH: :Kan片段替换了原argBH基因，达到了对argH基因敲除的目的。实施例2 利用L-精氨酸缺陷型大肠杆菌，以TTC为显色剂，快速筛选高产L-精氨酸菌株平板显色法的建立基本培养基中以IO5个/mL细胞浓度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株制成筛选平板，将本实验室保藏L-精氨酸产量不等的4株钝齿棒杆菌以相同量点种至筛选平板，30°C培养5-7d，于超净工作台均勻喷洒无菌lyg/mL TTC溶液(膜过滤除菌)，37°C放置l_2h，观察平板上显色情况。如图5所示，实验结果表明红色圈大小与菌株L-精氨酸产量呈正比，表明此方法用于筛选高产L-精氨酸突变株有效可行。实施例3 快速筛选高产L-精氨酸菌株平板显色法的应用基本培养基中以IO5个/mL细胞浓度混入E. coli BL21L-精氨酸缺陷型菌株制成筛选平板，将待筛选的菌株制成一定浓度的菌悬液，10倍系列稀释涂布于该平板上，30°C培养5-7d，于超净工作台均勻喷洒无菌1 μ g/mL TTC溶液(膜过滤除菌)，37°C放置l_2h，观察菌株生长情况。
权利要求
1.一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法，其特征在于构建一株大肠杆菌 BL21L-精氨酸缺陷型菌株将其作为L-精氨酸分泌的指示菌，指示L-精氨酸生产菌株胞外L-精氨酸多少，初筛出L-精氨酸高产菌株。
2.权利要求1所述的大肠杆菌BL21L-精氨酸缺陷型菌株构建方法如下在大肠杆菌中，L-精氨酸合成途径中的N-乙酰谷氨酸激酶argB恰好位于精氨酸琥珀酸酶argH的上游，以下简称argBH。以E.coli BL21基因组DNA为模板扩增argBH基因，在 argH内部插入卡那霉素抗性基因(Kan)，实现对argH的敲除从而获得该酶缺失的L-精氨酸缺陷型大肠杆菌。
3.权利要求1所述的快速筛选高产L-精氨酸菌株平板显色法的建立方法如下 将权利要求1所述的L-精氨酸缺陷型菌株作为L-精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以活细胞指示剂TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)为显色剂实现钝齿棒杆菌胞外精氨酸浓度高低的定性筛选，在平板上筛选出合成L-精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株。
全文摘要
本发明公开了一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法，属于工业微生物育种技术领域。传统的L-精氨酸高产菌株的筛选方法是通过筛选抗L-精氨酸结构类似物的菌株。本发明构建了一株大肠杆菌L-精氨酸缺陷型菌株作为L-精氨酸分泌的指示菌，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是一种活细胞指示剂，它能被活细胞产生的还原氢还原成红色。将上述L-精氨酸缺陷型菌株作为L-精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以TTC为显色剂实现L-精氨酸生产菌株胞外L-精氨酸浓度高低的定性筛选，在平板上初筛出合成L-精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株，该方法大大提高了菌种选育中的筛选效率而且节约了成本。
文档编号C12N15/70GK102367468SQ20111028981
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者徐美娟, 杨娟, 窦文芳, 许正宏, 饶志明 申请人:江南大学