专利名称：一对家养鹧鸪(石鸡)源性成分pcr检测用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测家养鹧鸪(石鸡)细胞线粒体核苷酸序列的引物。
背景技术：
世界各国政府大多将食品安全、饲料安全视为涉及国家公共安全的问题，并纷纷加大监管力度，特别是在出入境和市场的畜禽肉类食品、饲料及其商品的检验检疫工作方面，加强了监控畜禽肉类食品及其饲料的动物源性产品安全监测技术研究，该检测技术的研究与应用越来越受到重视。利用本发明引物进行的PCR扩增目的片段是线粒体DNA序列。线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质，是一个比较理想的用于物种鉴别检测的靶基因序列，其主要原因是(1)在所有组织细胞中均含有大量的线粒体，可以获得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物种间具有高度的变异性；每个动物细胞中存在许多拷贝的线粒体基因组，在采取相同体积的DNA样品进行PCR检测时，线粒体基因组的模板数大大高于细胞核基因组的模板数，这就大大提高了 PCR检测的灵敏度。0)mtDNA主要以编码序列构成，种内的异质基因很少。不同种类的动物线粒体基因组序列虽然高度同源，存在高度保守区域，但也存在一定的变异区域。
发明内容
本发明的目的在于提供一对检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的引物。以解决准确、 快速、可靠的用PCR技术鉴定家养鹧鸪(石鸡)源性成分。本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现1.设计引物用于检测石鸡源性成分的引物是根据线粒体DNA中高度保守的12S rRNA序列进行设计，具体引物序列如下上游引物F 5，-GCCCCGGCTAAAGACGAGGTAA-3，；下游引物R 5，-GAATTTTTGATATTTAGGGTGAG-3，。2.提取样品DNA 采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒提取样品DNA。3.采用步骤1设计的引物进行PCR扩增PCR反应体系为25yL，包括12. 5μ L 2XPCRBuffer,5y L dNTPs (2mmol/L), 1 μ L KOD FX DNA 聚合酶(IU/μ L)，上下游引物 F/R 各1 μ L (终浓度为0. 4 μ Μ)，DNA模板2 μ L，超纯水补至25 μ L0可采用商业化的PCR反应母液。PCR 反应程序为预变性 94°C anin;然后 94°C 30sec,57°C 30sec,72°C 40sec 循环 35次；72°C :3min。反应完成后在4°C下保存。4.电泳检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。若动物产品和饲料中含有家养鹧鸪(石鸡)源性成分，则在电泳图184bp位置处出现扩增目的条带。本发明的有益效果是，对活动物、食用性动物产品、非食用性动物产品、动物源性
3饲料及饲料添加剂等进行品种鉴定。利用本发明的引物采用PCR方法可以有效检出动物产品和饲料中的家养鹧鸪(石鸡)源性成分，并进行鉴别检测，其扩增目的条带长度为184bp， 检测最低限为0.01%。
图1家养鹧鸪(石鸡)引物特异性PCR检测电泳中M. Marker ；1.鸡；2.鸭；3鹅；4.火鸡；5.鸽；6.鸵鸟；7.鹌鹑8.牛；9.山羊；10.猪；11.绵羊；12.兔；13.鱼；14.鹿15.狗；16.驴；17.马；18.石鸡；19.阴性对照；M图2家养鹧鸪(石鸡)引物灵敏度PCR检测电泳中 M:marker DL100 ；1 :10.00% (石鸡 DNA) ；2 :1.00% ；3 0. 1% ；4 0. 01% ；5 0. 001% ；6 0. 0001% ；7 0. 00001% ；8 0. 000001%
具体实施例方式以下据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。1.引物的设计通过在动物分类学中相近的种如鸡和鹌鹑线粒体基因序列比较分析，选择高保守区段的12S rRNA基因，设计并优化引物，序列如下上游引物F 的序列为5，-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3，；
下游引物 R 的序列为5，-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3，。2.样品总DNA的提取采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒，提取鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、鸵鸟、鹌鹑、 牛、山羊、猪、绵羊、兔、鱼、鹿、狗、驴、马、石鸡动物的基因组DNA，提取的基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD26tZOD28tl值均为1. 8左右，说明DNA纯度较高符合 PCR扩增要求。3.家养鹧鸪(石鸡)源性成分PCR反应利用步骤1设计的特异性引物，以石鸡DNA等为模板进行PCR扩增。3. IPCR 反应体系为 25μ L，包括 12. 5μ L 2 X PCR Buffer,5y L dNTPs (2mmol/L),
1μ LKOD FX DNA聚合酶(IU/ μ L)，上下游引物F/R各1 μ L (终浓度为0. 4 μ Μ)，DNA模板
2μ L，超纯水补至25 μ L0可采用商业化的PCR反应母液。3. 2PCR 反应程序为预变性 94°C 2min ；然后 94°C 30sec, 57°C 30sec, 72°C 40sec 循环 35 次；72 °C 3min。4.电泳检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。5.引物的特异性验证利用所设计鉴定检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的特异性引物，分别以鸡、鸭、鹅、 火鸡、鸽子、鸵鸟、鹌鹑、牛、山羊、猪、绵羊、兔、鱼、鹿、狗、驴、马、石鸡等动物的总DNA为模板，按上述3进行PCR反应，验证引物的特异性。电泳检测结果如图1所示，18号样品在 184bp位置处出现目的扩增条带，其它样品没有石鸡源性成分DNA，则无目的扩增条带，显示上述引物有良好的特异性。
6. PCR的灵敏度验证用超纯水10倍梯度稀释纯石鸡肉样DNA，直至10_7，按上述3进行PCR反应，电泳结果如图2。可知其检测低限至少可达0.01%纯石鸡肉样DNA浓度，该引物的灵敏度可达 0.01%纯石鸡肉样品。
权利要求
1. 一对用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的引物，其特征在于所述的引物序列包括上游引物 F :5’ -GCCCCGGCTAAAGACGAGGTAA-3’ 下游引物 R:5’ -GAATTTTTGATATTTAGGGTGAG-3，。
全文摘要
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测家养鹧鸪(石鸡)细胞线粒体核苷酸序列的引物。本发明旨在鉴定饲料、食品等产品中是否含有家养鹧鸪(石鸡)源性成分。通过设计特异性扩增引物，利用PCR技术检测遗传上相对独立，没有重复序列，生物个体内无组织特异性的线粒体DNA，建立了家养鹧鸪(石鸡)源性成分PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定家养鹧鸪(石鸡)源性成分的目的。
文档编号C12N15/11GK102337336SQ20111029047
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者刘建利, 卢体康, 吕建强, 宗卉, 张彩虹, 曹琛福, 杨俊兴, 花群义 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心