专利名称：以海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸生产的疫苗及其制造方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明提供一优化的海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)，及包含其之载体、以其生产的疫苗及其制造方法及用途。
背景技术：
周纤毛虫类原生动物寄生虫海水白点虫(Cryptocaryon irritans)是造成多种海水鱼类感染海水白点病的致病生物，野生鱼类、观赏鱼类或养殖鱼类都有可能遭受感染。目 前海水白点虫已是鱼类养殖场常见的寄生虫，其被认为是造成最严重渔业经济损害的寄生虫的一，不只亚洲养殖渔业(包括中国、台湾、日本、韩国、印度及其他亚洲国家)受到海水白点虫的威胁，澳洲、波斯湾、以色列红海、加勒比海等地亦有海水白点虫的踪迹，造成海水养殖渔业巨大的经济损失。虽然可使用化学药剂预防或治疗受海水白点虫感染的鱼类，但其会造成严重的海洋污染，且对人类健康有危害。海水白点虫的生命周期以四个阶段组成营养体(toophont)期、原分裂前体(protomont)期、分裂囊胞体(tomonts cyst)期及纤毛幼虫(theront)期，早期有关与海水白点虫分属动物分类学上不同门(phylum)的淡水白点虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)的研究显示体液免疫可藉由制动(immobilize)纤毛幼虫达到预防感染的效果。有许多研究指出鱼类血液免疫及皮肤黏膜免疫在对抗海水白点虫上扮演重要角色，对海水白点虫的细胞免疫可由自然受感染鱼体的感染部位上的白血球渗入(Infiltration)及海水白点虫营养体上⑶8+白血球定位(localization)窥知，而对海水白点虫的非专一细胞免疫反应如外围血的嗜酸性白血球(eosinophil)数量降低及表皮层的黏膜细胞增生也在石斑鱼中被发现。许多研究指出对于海水白点虫营养体、原分裂前体及纤毛幼虫的免疫作用可在受感染鱼体中诱发更强的保护免疫力(protective immunity),其中纤毛幼虫期可提供较强的保护免疫力。由于海水白点虫是一绝对寄生虫，作为疫苗的纤毛幼虫仅能从受感染鱼体中得到，因此要搜集到足够量的活体纤毛幼虫用于生产疫苗相当费时费力且不切实际，且截至目前为止，并无技术可以利用离体方式使海水白点虫完成完整的生命周期。制动现象(immobilization phenomenon)是在离体实验中，由经免疫过后的鱼体的血浆及黏膜制动活体纤毛幼虫，此现象可于鱼体内发生并提供鱼体保护，其是抗体结合寄生虫细胞及纤毛表面抗原造成该寄生虫无法移动。制动现象的目标抗原称为致动抗原(immbolization antigens, iAg),其特征在于锚定大量糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol,GPI)的表面膜蛋白。文献中指出，从淡水白点虫中分离出的制动抗原在诱发保护免疫力上扮演重要角色，该致动抗原的重组基因片段已被揭露可于金鱼体内产生对抗淡水白点虫的免疫反应，并有效提供保护免疫力。此外，有研究者曾利用受感染鱼体及产生免疫反应的兔子的抗血清和海水白点虫的营养体及纤毛幼虫，萃取出箝入性膜蛋白(integral membrane protein)与大量的表面抗原，并从血清型(serotype)G37的海水白点虫纯化及选殖出此发生表面凝集/制动现象的抗原。然而因细菌及真核生物无法使用该寄生虫的密码子，使该制动抗原DNA序列在大肠杆菌及真核细胞中难以表达，再者，经优化的制动抗原(CISA-32)亚克隆至PHSG299构筑的密码子仅能在细菌中表达，无法于哺乳类动物细胞、昆虫细胞或酵母菌细胞中表达。于本发明中，该制动抗原的密码子经修饰过后可顺利于大肠杆菌及鱼类细胞中表达该制动抗原重组蛋白，并且其具有免疫原性(immunogenic)。而本发明经由免疫测试证实该密码子经修饰后的制动蛋白可做为预防点带石斑鱼(E. coioides)或其他海水鱼类遭海水白点虫感染的疫苗。脱氧核糖核酸(DNA)疫苗是指注射经基因工程改造的DNA进入生物体引发免疫反应以达到预防感染疾病的效果的技术，核酸疫苗可应用于预防细菌、病毒及寄生虫感染，甚至可用来治疗肿瘤，但目前大部分仍处于实验阶段。相较于传统疫苗，DNA疫苗有许多优点，例如可同时诱发多种免疫反应。以人类而言，疫苗对现代医学有相当大的贡献，例如使天花、小儿麻痹、伤寒(typhus)、轮状病毒(TOtavirus)、A型肝炎、B型肝炎等疾病都藉由疫苗达到良好的控制。 然而，传统疫苗仅能对抗有限数量的疾病，目前仍有许多疾病缺乏有效疫苗防治，例如人类后天免疫不全症候群(AIDS)、C型肝炎、疟疾(malaria)等病症，仍待开发有效疫苗。对动物而言，疫苗及其预防接种是控制动物病原疾病、保障养殖业持续发展的重要手段。鱼类疫苗可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、重组活疫苗、次单位疫苗以及DNA疫苗五大类；十年前已有一些细菌疫苗商品化，但病毒疫苗还很少，而寄生虫疫苗完全没有。因为鱼类疫苗存在免疫原力、生产成本和安全性等问题，大部分疫苗停留在实验室使用阶段，还未商品化生产。在开发疫苗过程中，所谓第一代疫苗是指全生物体疫苗(who I e-organ ismvaccine),其可能是活体、经弱化过的活体或死亡状态的生物,灭活疫苗或减毒活疫苗,例如天花及小儿麻痹疫苗，其可诱发细胞毒杀T淋巴球(T。或CTL)、辅助T细胞(Th)活化及抗体产生，但其存在毒性回复(reversion to virulence)的风险，灭活疫苗(killedvaccine)虽不具有此风险，但其无法诱发细胞毒杀T淋巴球活化，且生产上有其对应疾病的限制。为最小化上述风险，第二代疫苗应运而生，例如次单元疫苗(subunit vaccine),其是以已知蛋白质抗原(defined protein antigen)或重组蛋白组成，前者如破伤风(tetanus)疫苗及白喉(diphtheria toxoid)疫苗,后者如B型肝炎疫苗。第二代疫苗可诱发辅助T细胞及抗体产生，但仍然无法诱发细胞毒杀T淋巴球活化。DNA疫苗即第三代疫苗，其是以质粒透过基因工程技术处理，使其可产生一至两个属于病原体的特定抗原或蛋白质，当该DNA被送进体内细胞后，透过该质粒宿主细胞本身机制即可读取该DNA并转译出病原体的特定蛋白质,该蛋白质会被认定为外来蛋白质,便会被宿主细胞呈现至其表面，诱发免疫系统辨认并产生多种免疫反应。1993年以来，DNA疫苗以其高免疫保护率受到了广泛关注。DNA疫苗是指直接把带有目标抗原基因的重组质粒转染或注射到动物体内，使的表达出天然抗原物质。与传统疫苗相比，DNA疫苗的制作相对简单，成本低廉，运输保存容易，不存在毒力回复的现象。与灭活疫苗和次单位疫苗相比，DNA疫苗的效果更好。1996年，Anderson等首次将鱼传染性造血器官坏死症病毒(IPNV)的糖蛋白基因插入真核表达质粒以制成DNA疫苗，并免疫虹鳟鱼，发现能够诱导其产生强烈的保护性免疫反应，抵抗IPNV病毒的攻击。迄今为止，学者仍陆续进行鱼类DNA疫苗相关研究，并有突破性的发展。本发明即提供一种以海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)生产的疫苗及其制造方法及用途，该疫苗即为鱼类抗寄生虫的DNA疫苗，其可用于预防鱼类感染海水白点虫，是于该领域极具新颖性及进步性的发明。
发明内容
本发明提供一种优化(optimize)海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列的方法，其包含a.取得海水白点虫制动抗原的mRNA序列；b.将该mRNA序列转换为cDNA序列；c.根据该cDNA序列中终止码(stop codon)周围的密码子(codons)对应的氨 基酸残基的特定特征推测出终止码特定氨基酸，使该终止码以能转译出该特定氨基酸的密码子取代后，转译出的蛋白与从该海水白点虫纤毛幼虫纯化出的制动抗原两者的免疫原性(immunogenicity)相近；及d.将该终止码(stop codon)以能转译出该特定氨基酸的密码子取代，产生优化的(optimized) cDNA 序列；其中该特定特征是选自终止码周围密码子所对应的氨基酸残基的结构特性、疏水性、电荷分布所组成的群组。本发明所提供的优化(optimize)海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列的方法,其中该特定氨基酸为精氨酸(Arginine)、甘胺酸(Glycine)或丙胺酸(Alanine),以甘胺酸(glycine)置换疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置换可最小化结构改变、精胺酸(arginine)可用以置换带电部分(regionalcharge)。本发明进一步提供一优化的海水白点虫制动抗原互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，其包含SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列,及一载体,其包该优化的海水白点虫制动抗原cDNA 序列，该载体为 pGex2T_iAg 或 pcDNA3. 1-iAg。本发明进一步提供一种核酸疫苗，其包括该优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列，其进一步可以利用几丁聚糖纳米颗粒包裹。本发明进一步提供一种优化的海水白点虫制动抗原cDNA序列用于制备针对海水白点虫的抗体的用途，其特征在于将包含SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的cDNA序列的载体使用于一宿主(host)，促使该宿主产生抗体对该cDNA序列转译出的蛋白质发生免疫反应后，取得该针对海水白点虫的抗体，其中该载体可为为pGex2T-iAg或pcDNA3. 1-iAg，并可以几丁聚糖包裹成纳米颗粒，而其中使用于该宿主的方式可为混入饲料或食饵中、混入水中浸泡该宿主或注射该宿主；而其中该宿主为水生生物，尤其是鱼类，例如黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)、异臂花鯧(Caprodon schlegelii)、红点九刺鯧(Cephalopholis aurantia)、青星九刺鯧(Cephalopholis miniata)、细点牙鲷(Dentex dentex)、欧洲海鱼卢(Dicentrarchus Iabrax)、尖吻重牙鲷(Diploduspuntazzo)、单斑重牙鲷(Diplodus sargus)、青石斑(Epinephelus awoara)、点带石斑(Epinephelus coioides)、革安带石斑(Epinephelus Ianceolatus)、三斑石斑(Epinephelus trimaculatus)、黑毛瓜子腊(Girella leonina)、臀斑髭鲷(Hapalogenysmucronatus)、棘箱純(Kentrocapros aculeatus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、尖吻鱼卢(Lates calcarifer)、银纹笛鲷(Lutianus argentimaculatus)、赤鳍笛鲷(Lutjanuserythopterus)、白星笛鲷(Lutjanus stellatus)、角鳞飩(Melichthys vidua)、真鲷(Pagrus major)、花软唇(Plectorhynchus cinctus)、茉莉花鎌(Poecilia Iatipinna)、魔鬼養鱼由(Pterois volitans)、黄锡鲷(Rhabdosargus sarba)、金钱鱼(Scatophagusargus)、红甘錄(Seriola dumerili)、银篮子鱼(Siganus oramin)、金头鲷(Sparusaurata)、布氏鲳錄(Trachinotus blochii)、海鲡(Rachycentron canadum)、青甘錄(Seriola quinqueradiata)、克氏海葵鱼(Amphiprion clarkii)、白条海葵鱼(Amphiprionfrenatus)、鞍斑海葵鱼(Amphiprion polymnus)或眼斑海葵鱼(Amphiprion ocellaris)。
图I是Chiayi品系海水白点虫的制动抗原核苷酸序列(GenBank FJ167511)及其对应的氨基酸序列。预测的信号肽以方框表示，终止密码子以深灰底表示，预测穿膜片段以浅灰底表示，以灰底方框表示者为糖基化磷脂酰肌醇固定位置(第302个氨基酸丝氨酸)， 左侧数字为核苷酸序列、右侧数字为氨基酸序列。图2是以RT-PCR侦测制动蛋白转录产物(受转染24小时、48小时及72小时后的GF-I转录产物)，泳道(Lane)M为DNA marker ;泳道24、48、72分别为受转染24小时、48小时及72小时后的结果。图3是以RT-PCR侦测制动蛋白转录产物(受注射的鱼体肌肉细胞的转录产物)，泳道M为DNA marker ;泳道1、2、3分别为注射质粒模板(plasmid template)、对照组质粒(mock plasmid)及制动抗原质粒(iAg plasmid)的结果。图4是以西方墨点法侦测大肠杆菌表达重组制动抗原蛋白。泳道I为Marker ;泳道2为未经IPTG诱导的大肠杆菌；泳道3为经IPTG诱导的大肠杆菌以小鼠抗GST抗体辨认，其中55kDa箭头指示处为GST融合制动抗原蛋白、25kDa箭头指示处为GST蛋白。图5是以西方墨点法侦测大肠杆菌表达重组制动抗原蛋白。泳道I为Marker ;泳道2箭头指示处为GST融合制动抗原蛋白以兔子抗海水白点虫纤毛幼虫抗体辨认。图6为透过共轭焦雷射扫描显微镜观察以兔子抗海水白点虫纤毛幼虫免疫球蛋白的(A)白光(bright) ; (B)DAPI染色部份；(C)FITC染色部份；(D)前两者重迭的石斑鱼GF-I细胞(a至d为以pcDNA3. 1-optiAg转染的GF-1细胞；e至h为以pcDNA3. I转染的GF-I细胞；i至I为未经转染的GF-I细胞；Bar = 50微米)。图7以Kaplan-Meier存活曲线表达经制动抗原刺激免疫反应的实验鱼体只存活率，其中经制动抗原刺激免疫反应的对数等级(log rank)的显著性为0. 008。图8以Kaplan-Meier存活曲线表达经重组制动抗原刺激免疫反应的实验鱼体只存活率，其中经重组制动抗原蛋白加强(boost)的对数等级(log rank)的显著性为0.008。
具体实施例方式寄生虫体收集与培养于台北地区的鱼市场收集受海水白点虫(Cryptocaryon irritans)感染的鱼类后培养于水槽中，从该水槽底部收集囊胞体(tomont)后，培养于从台湾南部地区购买的点带石斑鱼(grouper Epinephelus coioides)幼鱼(平均每尾重量2. 6公克)上。本发明所使用的寄生虫体培养的流程如下利用小型油漆刷从该水槽底部轻轻地扫取并收集海水白点虫的囊胞体，并利用海水洗去多余的残渣或黏膜后，将该囊胞体利用过滤过的海水培养于培养皿(petri plates)上，并于室温培养三至七天。海水白点虫的纤毛幼虫(theront)会从囊胞体中产生，此时于摄氏4度以1500g离心含有该纤毛幼虫的溶液10分钟后即可收集活体的纤毛幼虫， 将该活体纤毛幼虫感染未被海水白点虫感染过的成鱼(每尾平均重量300公克，从鱼市场中采买而得)，随后可得约六百万只活体纤毛幼虫提供后续以水为媒介的人工感染试验。DNA 萃取与基因型鉴定(genotype differentiation)利用Bio-Rad 36897CHELEX 100树脂抽取囊胞体的DNA，一次约使用20至30颗囊胞体，完成后，以聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)及核糖体DNA (rDNA)的18S、ITS-I与5. 8S区域的特定引物(Primers I and 2 ；Table I)放大特测序列片段，以初步变性温度摄氏95度进行3分钟后，再以温度循环变性温度摄氏94度60秒、结合温度摄氏55度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行30个循环，放大完成的序列交由明欣生物科技有限公司(Mission Biotech Co. ,Ltd.)测序，再将测序成果，即海水白点虫的部分18S、全部的ITS-I以及部分5. 8S序列以多重序列比对软件CLUSTAL W(版本I. 83)鉴别其基因型。从两种品系(isolates)的海水白点虫中得到部分18S、整段ITS-1的DNA序列，及部分5. 8S rDNA,其核苷酸序列已公开于GenBank,即Chiayi (AF490381)与AusC(AY029271)。制动抗原(immobilizationAntigen, iAg) cDNA 选殖(cloning)利用Trizol (Invitrogen)及所提供的程序抽取全RNA后,利用Primer 3软件在GeneBank数据库中记录的制动抗原序列AB262047设计目标制动抗原的特定引物；而部分抗原的基因序列是分离自ChiayU即嘉义，此品系海水白点虫采集自嘉义)海水白点虫，并以含有25微升(yl)的2X反应混合液(2X Reaction Mix)、10微微摩尔浓度(pM)的引物(primers 3 and 4, Table I)、2 微升反转录酶 SuperScript III RT/ Platinum Taq Mix、0.5微克(U g) RNA模板的试剂盒，50微升的总反应体积于SuperScript IIIOne-Step RT-PCR系统放大之，上述进行方式为以摄氏50度30分钟进行cDNA合成后，以温度循环为初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环变性温度摄氏94度15秒、结合温度摄氏55度30秒，及延长温度摄氏68度60秒进行40个循环，最后以温度摄氏68度5分钟进行最终延长,放大后的产物亚克隆(subclone)至pGEM-TEasy Vector (Promega)并对其测序。5' and 3'末端选殖技术利用末端选殖试剂盒(5'and 3' rapid amplification of cDNA ends, RACE)(Invitrogen & Clontech)产出Chiayi海水白点虫的制动抗原的完整cDNA序列。3'末端选殖是以包含2微升的10倍PCR缓冲液、2. 5毫摩尔浓度(mM)的氯化镁、0. 5毫摩尔浓度的 dNTP、5 毫摩尔浓度的 DTT、200U 的反转录酶(Superscrip II Reverse transcriptase)及 oligo (dT)-containing Adaptor Primer (AP ； Invitrogen)共 20 微升的反应溶液(Invitrogen)，于摄氏42度下反应50分钟后加温至摄氏70度反应10分钟，进行反转录以合成第一股 cDNA(First Strand cDNA)。再将此含有3'端结尾的cDNA作为模板加入2微升至包含5微升的10倍PCR缓冲液、5毫摩尔浓度的氯化镁、0. 5毫摩尔浓度的dNTP、5毫摩尔浓度的DTT、5U Taq (Genemark)及 10 微微摩尔浓度的 AUAP 引物(Abridged Universal Amplification Primer)(Invitrogen)，总量50微升的反应液，于初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏58度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环，最后以温度摄氏72度10分钟进行最终延长，放大后的产物亚克隆至pGEM-T EasyVector并对其测序。至于5'端末端选殖，其第一股 cDNA 是利用 SMARTTM RACE cDNAAmplif icationKit(Clotnech)5WS'端 RACE CDS 引物 A 与 SMART II A寡核苷酸(oligonucle-otide)于摄氏42度反应I. 5小时后稀释10倍，再将2毫升含有5'端结尾的cDNA作为模板，加入至包含通用引物A Mix (universal Primer A Mix, UPM) (Clontech)及反转高基因专一性引物(reverse gene specific primer) (primer 6, Table I)的 PCR 反应溶液，此反应以初期 变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏55度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环，最后以及温度摄氏72度10分钟进行最终延长。随后利用巢式聚合酶连锁反应(Nested PCR)以稀释50至100倍的第一次PCR产物为模板,与巢式通用引物(nested universal Primer A, NUP) Clontech)及巢式反转高基因专一性引物(nested reverse gene specific primer) (primer 7,Table I)于上述相同情况下进行，放大后的产物亚克隆至pGemTeasy plasmid(Promega)并对其测序。最后以SignalP 3. 0测试Chiayi海水白点虫的全长制动抗原的信号肽(signalpeptide)、SMART program 预测跨膜(transmembrane)片段，及 big-PI Predictorprogram预测肽裂解(propeptide cleavage)的可能omega (w) site及糖基化磷脂酰肌醇(glycosy lphosphat idyl inositol, GPI)的固定位置(anchor site)。密码子置换(Codonreplacement)该制动抗原的原始序列(GenBank :FJ167511)是以软件DNASTAR Lasergene 6进行分析，并依据氨基酸的结构特性、疏水性及电荷分布等特性以适当的氨基酸置换终止密码子，例如以甘胺酸(glycine)置换疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置换可最小化结构改变、精胺酸(arginine)可用以置换带电部分(regionalcharge)。本实施例选定的置换残基为核苷酸序列第309至311、393至395、468至470、519至521、540至542、657至659、及897至899个核苷酸。置换过终止密码子的该制动抗原核酸序列以软件GENEART Gene optimizer Sequence Analysis (Prisma Biotech Co.)分析，评断标准包含GC含量及密码子质量评估(codon quality assessment),为使该序列在大肠杆菌(E.coli)、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母菌系统中有稳定的高表达量，序列中的GC含量由原始序列的37%提升至47%。制动抗原质粒(iAg plasmid)构筑及包覆(encapsulation)本实施例构筑两个质粒能表达于大肠杆菌的pGex-2t_iAg及能表达于石斑鱼鱼鳍细胞(grouper fin-1 ;GF_1)与经接种过后的石斑鱼活体上的pcDNA3. 1-optiAg,pGEX_2T 是米用 GE Healthcare (前 Amersham Biosciences)生产的产品，目录编号27-4801-01 ；pcDNA3. 1(+)是采用 Invitrogen Life technologies 生产的产品,目录编号V790-20。pGex-2T-iAg的构筑方式为利用已置换的制动抗原DNA作为模板，设计一对引物(引物8 (SEQ ID NO 8)及引物9 (SEQ ID NO 9)，如表I及序列表所示)进行PCR以确认成熟蛋白质(mature protein)是否含有该制动蛋白DNA片段,其PCR的温度循环为初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏58度30秒,及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环,其后以胶体萃取试剂盒(gel extractionkit) (BIOMAN)将该放大后的DNA从琼脂糖(agarose)分离(elute)出，并以限制酶BamHI及EcoRI (Invitrogen)切割后选殖至pGex_2T的BamHI及EcoRI限制酶切割位置。pcDNA3. 1-iAg的构筑方式为利用已置换的制动抗原DNA作为模板，设计一对引物(引物8 (SEQ ID NO 8)及引物9 (SEQ ID NO 9)，如表I及序列表所示)进行PCR以确认成熟蛋白质(mature protein)是否含有该制动蛋白DNA片段,其PCR的温度循环为初期变性温度摄氏94度进行2分钟，再以温度循环变性温度摄氏94度30秒、结合温度摄氏58度30秒，及延长温度摄氏72度60秒进行35个循环，其后以胶体萃取试剂盒(gelextraction kit) (BIOMAN)将该放大后的DNA从琼脂糖(agarose)分离(elute)出，并以限制酶BamHI及EcoRI (Invitrogen)切割后选殖至pGex_2T的BamHI及EcoRI限制酶切割位置。为达到DNA疫苗的功效，在本实施例中，该优化的制动抗原质粒pcDNA3. 1-iAg是参考台湾地区专利
发明者卜莉亚, 宋延龄, 林彦宏 申请人:宋延龄