专利名称：基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测gii型诺如病毒的制作方法
技术领域：
本发明是用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测腹泻病毒-诺如病毒GII型RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因。用于各级疾病预防控制机构，腹泻病毒检测网络实验室，哨点医院对GII型诺如病毒的检测和监测。
背景技术：
诺如病毒是杯状病毒属病毒，能影响感染胃和肠道，引起胃肠炎，致人恶心、呕吐、腹部痉挛性腹泻。部分患者有头痛、发热、寒战、肌肉疼痛，严重者出现脱水症状。尽管致死率不高，但由于病毒能通过空气传播，也能通过食物，食用水源等途径传播，因而应加强对诺如病毒的疫情防控。2007年，我国卫生部曾发布《关于加强诺如病毒感染性腹泻防控工作的紧急通知》。尽管近年来有关诺如病毒感染的大规模爆发并不常见，但疫情传入和扩散风险依然较大。2010年底，我国广东等地依然出现了诺如病毒感染的小规模疫情。为有效阻止疫情的爆发和发生疫情后的应急处置，需要一种合适的检测诺如病毒技术，该技术要求快速，特异，灵敏，对设备依赖不高，从而能方便地方基层人员的操作，确保疫情的判定，继而做好相对应的防疫措施。我国流行的诺如病毒属于GII型，因此，本专利成功建立的基于颜色的RT-LAMP检测诺如病毒GII型基因方法，将为提高我国疾病监测网络实验室和哨点医院的腹泻病毒监测能力，实现对腹泻患者的快速筛查提供了有力的技术保障。
基于颜色的RT-LAMP技术在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到两小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在65°C等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了 RNA酶和扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁白色沉淀，HNB染料在扩增前加入，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物和反应管内颜色的变化，可以直接判定检测结果。
发明内容
1.本发明是对目前对GII型诺如病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。第三，所有的扩增过程都可在65°C同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求，由于HNB染料在扩增前加入，可以肉眼直接判定检测结果，无需电泳。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。2.选择诺如病毒GII型RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的相对保守区设计相应的RT-LAMP引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(Loopl、Loop2)。所有引物的具体序列见表I。表I =RT-LAMP检测诺如病毒GII型RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的引物序列
权利要求
1.一种用于基于HNB颜色的检测病毒性腹湾病原体GII型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因(RNA-dependant RNA polymerase and capsid protein gene)的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，其中包括用于检测GII型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的6条寡核苷酸引物和HNB(羟基萘酚蓝)染料。
2.权利要求1所述的检测GII型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)的引物包括表I所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权利要求1所述的检测GII型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)包括GII型诺如病毒及其变异株。
4.权利要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，腹泻病毒检测网络实验室，哨点医院用于GII型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的检测和监测。
5.权利要求1所述的基于HNB颜色的检测GII型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)的反应程序和检测程序。
全文摘要
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，腹泻病毒检测网络实验室，哨点医院等用于对以腹泻、呕吐为主要症状的疑似诺如病毒感染病人的粪便、呕吐物等标本的诺如病毒GII型RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的检测和监测。具体是应用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，通过生物信息学专业软件分析诺如病毒GII型RNA依赖RNA聚合酶和衣壳蛋白基因的保守序列，设计出六条引物识别靶序列，并完全与靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，反应前加入HNB(羟基萘酚蓝)染料，只需一步就可完成在65℃等温环境中扩增1小时，最后用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果，与传统的RT-PCR方法比较，它具有更特异、灵敏、便捷的优势。
文档编号C12Q1/70GK103060470SQ201110315740
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者马学军, 罗剑鸣, 吴希阳, 聂凯, 罗乐, 段招军 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所