专利名称：啤酒花潜隐类病毒的实时荧光rt-pcr检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明涉及类病毒的检测技术，具体涉及涉及啤酒花潜隐类病毒的实时荧光 RT-PCR检测试剂及检测方法。
背景技术：
啤酒花潜隐类病毒0 / latent riroii/，HpLVd)隶属于Cocadviroid属，分布于英国、德国、韩国、波兰、日本、捷克、巴西、美国、中国新疆等国家和地区的啤酒花上。该类病毒侵染啤酒花后一般不表现明显的症状，但会改变其一些次生代谢产物成分，从而影响啤酒花品质，降低啤酒花产量。Adams等报道，不同啤酒花品种受HpLVd侵染后，a_酸的含量降低20% 50% ；受HpLVd侵染的啤酒花球果产量降低11%。目前国内外检测啤酒花潜隐类病毒的方法主要是分子杂交法；分子杂交法的前提是要制备探针，较为复杂，且检测步骤繁琐。近年来，利用TaqMan-MGB探针进行实时荧光 RT-PCR反应是在常规RT-PCR反应体系中添加了 1条TaqMan-MGB探针；探针的5’端含有报告荧光基团，3’端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，Ti^DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。目前实时荧光PCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检测、线虫检测等诸多领域，但对啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测尚未见公开报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测啤酒花潜隐类病毒的检测试剂及方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是提供一种检测啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为61bp，引物和探针序列为
引物 HLV-F 5，-CGTGGAACGG CTCCTTCTT-3，； 引物 HLV-R :5，-AGAGTTGTAT CCACCGGGTA GTTT-3，；
探针HLV-P 5' -CACCAGCCGG AGTT-3'，该探针的5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子；扩增目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是提供一种能简单、快速、灵敏、 准确地检测啤酒花潜隐类病毒的方法，是以啤酒花样品总RNA为模板，用上述检测啤酒花潜隐类病毒的引物和探针进行实时荧光RT-PCR，检测扩增产物荧光信号；
所述啤酒花样品可为啤酒花幼苗、叶片和球果；
上述方法中，如从扩增产物中可检测到荧光信号，说明所述检测样品含有啤酒花潜隐类病毒，而且可以根据Ct (循环阈值)的大小确定样品中的起始模板的量；
所述啤酒花样品经RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取植物总RNA，得到总RNA模板，具体操作见试剂盒说明书；
所述实时荧光RT-PCR反应是以提取样品总RNA为模板，25 μ L反应体系中Mg2+终浓度为5. 5mM、引物HLV-F和HLV-R的终浓度都为0. 7 μ Μ、探针HLV-P终浓度为0. 5 μ Μ、 2xQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix (含终浓度 4. 0 mM 的 Mg2+、购自 Qiagen 公司)为 12. 5 μ L、QuantiTect RT Mix (购自 Qiagen 公司)为 0. 25 μ L, RNA (20 ng/μ L 200 ng/ μ L)为1 μ L，RNase Free dH20补至25 μ L ；所述实时荧光RT-PCR的反应条件为50°C 30 min ；95°C 15 min ；然后94°C 15 s，60°C 60 s，共40个循环。反应体系也可以为50 μ L寸。本发明针对现有啤酒花潜隐类病毒检测方法费时、繁琐等缺点，提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。本发明方法中实时荧光RT-PCR检测试剂的专用引物和探针对啤酒花潜隐类病毒具有很强的专化性， 并通过对反应体系的优化，不仅能提高啤酒花潜隐类病毒检测的效果，还能对受检样品进行定量分析。本发明与现有技术相比，具有以下优点1、快速简单只需少量样品总RNA，用荧光PCR仪仅需2小时就可完成RT反应和PCR步骤，即可得到检测结果，避免了普通分子检测技术中的探针制备等处理过程；2、特异性强采用一对啤酒花潜隐类病毒的特有引物进行目标基因片段的扩增及一条可与模板互补配对的荧光探针进行检测，提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性；3、灵敏度高由荧光PCR仪自动收集荧光信号，避免结果分析中人为因素干扰，进一步提高灵敏度，在25 μ L反应体系中，总RNA检测低限是20pg。4、交叉污染低整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了 PCR产物的污染。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1、检测啤酒花潜隐类病毒的专用引物和探针的设计
从GenBank调出椰子死亡类病毒属Wocadviroid)四种类病毒的基因序列，利用 DNAMAN 6. 0.40软件进行比对分析，找出如SEQ ID NO :4所示的HpLVd的保守基因序列，根据引物和探针设计的一般原则，用软件I^imer Express 3. 0设计引物和I^qMan-MGB探针， 再将设计的引物和探针在NCBI上比对，通过常规筛选最终确定一对引物和一条探针，其序列为引物HLV-F :5，-CGTGGAACGG CTCCTTCTT-3，；引物HLV-R :5，-AGAGTTGTAT CCACCGGGTA GTTT-3’，探针HLV-P 5' -CACCAGCCGG AGTT-3'，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。实施例2、实时荧光RT-PCR检测啤酒花潜隐类病毒的特异性试验具体过程包括以下步骤
一、样品来源
感染啤酒花潜隐类病毒的啤酒花阳性样品(样品M17) 1份；感染锦紫苏类病毒1号 (JJoleus blumei viroid 7, CbVd-I )、 帛紫苏类病毒 5 号(Cb/ews blumei viroid 5, CbVd-5)的锦紫苏叶片(样品J) 1份；感染啤酒花矮化类病毒0 / stunt viroid, W^d),
4葡萄黄点类病毒1 s^iMrapevine yellow speckle viroid 7，GYSVd_l)及葡萄黄点类病毒 2 (.Grapevine yellow speckle viroid ^ GYSVd-2)的葡萄总 RNA (样品 Dl) 1 份；感染桃潜隐花叶类病毒(/^acA latent mosaic FiroiV,PLMVd)的桃总RNA (样品D2) 1份。样品M17和J由中国农业科学研究院植物保护研究所李世坊提供，样品Dl和D2由北京出入境检验检疫局植物检疫实验室邓丛良提供；
二、植物总RNA的提取
对步骤一中的样品经RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取植物总RNA，具体操作见试剂盒说明书；
三、特异性检测试验
以步骤一和步骤二获得的植物总RNA为模板，即M17、J、Dl和D2总RNA，水为空白对照，进行实时荧光RT-PCR反应，即在25μ L反应体系中加入12. 5μ L 2xQuantiTect Probe RT-PCR Master Mix，0. 5 μ L 引物 HLV—F (20 μ mol/L)，0. 5 μ L 引物 HLV-R (20 ymol/L), 0· 25μ L探针HLV-P(20 μ mol/L), 0. 25 μ L QuantiTect RT Mix, 1 μ L RNAC20 ng/μ L 200 ng/μ L),RNase Free dH20补至 25 μ L。反应条件为50°C 30 min ；95°C 15 min;然后 94°C 15 s,60°C 60 s，共40个循环。结果表明所设计的引物和探针有较强的特异性，七种类病毒中仅能检出啤酒花潜隐类病毒(扩增和检测的目标片段长度为61bp，核苷酸序列如SEQ ID NO 4 所示)，不能检出 CbVd-1、CbVd-5、HpSVcU GYSVd-1、GYSVd-2、PLMVd 和水。
实施例3、实时荧光RT-PCR反应体系的优化
以实施例2中步骤二获得的M17总RNA为模板，分别对实时荧光RT-PCR检测体系中的 Mg2+浓度、引物浓度和探针浓度进行优化，具体步骤如下
一、Mg2+浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，加入镁离子，使其终浓度从4.0 mM 至7.0 mM以0.5 mM递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当Mg2+ 终浓度为5. 5mM时，Δ to值达最大、Ct值最小，经过三次重复实验，确定最佳镁离子终浓度为 5. 5mM ；
二、引物浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，固定优化后的镁离子浓度，将引物终浓度从0. 4 μ M至1. 0 μ M以0. 1 μ M递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当引物终浓度为0. 7 μ M时，Δ to值达最大、Ct值最小。经过三次重复实验，最后确定0.7μΜ为引物最佳浓度；
三、探针浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，固定优化后的镁离子和引物浓度， 将探针终浓度从0. 1 μ M至0. 8 μ M以0. 1 μ M递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当探针终浓度为0.7μ M时，Afoi值最大。探针终浓度为0.5μ M时，Afoi 值次之，但此时Ct值最小。经三次重复实验，在扩增效率差异不明显的情况下，从经济实惠的角度考虑，选定0.5μ M为最佳探针浓度；
四、优化后的实时荧光RT-PCR体系
经步骤一、二和三优化，确定最优的实时荧光RT-PCR体系为Mg2+终浓度为5. 5 mM、引物HLV-F和HLV-R的终浓度都为0. 7 μ Μ、探针HLV-P终浓度为0. 5 μ Μ。
实施例4、实时荧光RT-PCR检测啤酒花潜隐类病毒的灵敏度试验
以实施例2中步骤二获得的M17总RNA为模板，用核酸蛋白分析仪测OD26tl及OD28tl,计算RNA的浓度，并将其稀释为25 μ L反应体系中，总RNA分别为200ng、20 ng、2ng、200pg、 20pg、2pg、0. 2pg、0. 02pg,以实施例3中步骤四获得的最优体系进行实时荧光RT-PCR反应。 反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，实时荧光RT-PCR检测，其检测低限是 20pg。实施例5、田间样品检测
从新疆22个不同地点采集到6种不同品种的啤酒花叶片和球果，共计四份样品。按实施例2步骤二提取总RNA，以实施例3中步骤四获得的最优体系进行实时荧光RT-PCR反应。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，采集的四份样品均检出啤酒花潜隐类病毒。
权利要求
1.啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为61bp，其特征在于引物和探针序列为引物 HLV-F 5，-CGTGGAACGG CTCCTTCTT-3，； 引物 HLV-R :5，-AGAGTTGTAT CCACCGGGTA GTTT-3，；探针HLV-P 5' -CACCAGCCGG AGTT-3'，该探针的5'端含有FAM报告荧光染料，3'端为含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子；扩增目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所
2.利用权利要求1所述的啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂检测啤酒花潜隐类病毒的方法，其特征在于使用RNA提取试剂盒对啤酒花进行植物总RNA提取，具体操作见试剂盒说明书；以提取样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，25 μ L反应体系中Mg2+终浓度为5. 5mM、引物HLV-F和HLV-R的终浓度都为0. 7 μ Μ、探针HLV-P终浓度为 0. 5μΜ, 12. 5yL 2xQuantiTect Probe RT-PCR Master Μ χ,Ο. 25 μ L QuantiTect RT Mix ； 反应条件为50°C 30 min ；95°C 15 min ；然后94°C 15 s,60°C 60 s，共40个循环；若检测到荧光信号则为啤酒花潜隐类病毒。
全文摘要
本发明公开了啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂及检测方法，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为61bp，引物HLV-F序列CGTGGAACGGCTCCTTCTT；引物HLV-R序列AGAGTTGTATCCACCGGGTAGTTT；探针HLV-P序列CACCAGCCGGAGTT，该探针的5'含有FAM报告荧光染料，扩增目标片段的核苷酸序列如SEQIDNO4所示；检测方法包括总RNA的提取和实时荧光PCR反应，该RT-PCR反应是引物扩增与探针检测同时进行，整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染，减少了检测步骤，节省了时间，并且对啤酒花潜隐类病毒特异和敏感；因此本发明提供一种操作灵敏、快速、准确的检测啤酒花潜隐类病毒的检测试剂及方法。
文档编号C12Q1/70GK102382903SQ20111031908
公开日2012年3月21日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者段维军, 郭立新, 闻伟刚 申请人:中华人民共和国北仑出入境检验检疫局, 宁波检验检疫科学技术研究院