专利名称：家蚕丝素重链基因突变序列及突变的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家蚕育种和基因工程领域，涉及基于不同现有蚕品种的家蚕丝素重链基因突变体，及其制备方法、突变序列和用途。
背景技术：
家蚕因其强大的泌丝吐丝能力而蜚声古今中外，在长达数千年的饲养和驯化中为世界经济和文化交流做出了重要的贡献，至今也仍然是中国、印度等国家产业的重要组成部分。但是长期以来人们选育家蚕品种都是以茧层量、茧层率、解舒和抗病性的提高作为育种目标，而忽略了茧丝强度、延伸性、染色性能、肌肤亲和性等重要指标。这也是蚕丝难以像蜘蛛丝等高强度纤维那样广泛的应用于医学、军事等高端领域，而仅仅只是作为单一的纺织材料的主要原因。因此，如何快速的育成高茧丝强度、强延伸性、易染色、高肌肤亲和性等优质的蚕丝显得尤为重要。家蚕经过数千年的选育，虽然目前品种资源较为丰富，但就茧丝强度、延伸性、染色性能、肌肤亲和性等特性而言，品种间几乎没有什么差异，所以通过传统育种方法改变蚕丝的这些特性基本上不可行。随着家蚕基因组计划的全面完成，分子标记辅助育种、转基因育种等现代农业的新型工具逐渐的加入家蚕品种分子改良的主力阵容之中。家蚕丝蛋白只要由丝素重链、丝素轻链和P25蛋白及包裹的在最外层的丝胶蛋白组成，其中决定茧丝性能的丝素重链蛋白是一个由高度重复序列构成的大约390kDa的蛋白。丝素重链蛋白的高表达量、高度重复序列和高分子量使得用常规的转基因技术也难以对其进行研究和改造。此外，一头体重约为6g的家蚕食下25g左右的桑叶，便能吐出0. 5g由纯蛋白组成的蚕丝，这不仅是让人叹为观止的生物学奇观，其中更是蕴藏着令人无限憧憬的应用价值。 不仅如此，家蚕丝腺还具有高等生物蛋白质的翻译后修饰加工能力、大规模生产成本低以及对人畜安全性等优势，满足了新一代生物反应器的基本要求，有巨大的开发应用潜力。该领域研究已成为由传统蚕丝产业向非绢丝产业拓展的重要内容。无论是在基础研究，还是在药物、化妆品开发领域，提取或表达纯化的蛋白都扮演着极其重要的角色，但是商业化蛋白纯品高得离奇的价格(Ig最常用的绿色荧光蛋白价格约5百万元)一直在困扰着众多研究者们。大规模表达或提取蛋白的工艺的缺乏严重的制约着与蛋白相关的研究和产品的发展。饲养一头蚕的成本不足1角钱，却能吐0. 5g的丝蛋白，而如果能用基因工程手段让家蚕吐出0.5g纯蛋白，这对于蚕丝产业、甚至生物产业都将产生革命性的推动作用。也正是这一奇特的生物学现象和应用前景吸引着众多生物学家自分子生物学发端以来就长期致力于家蚕丝蛋白的表达调控和家蚕生物反应器的开发。然而，要实现这一看似简单而美好的梦想并非易事。尽管通过长达数十年的探索与研究，家蚕丝蛋白基因的表达调控机理还不尽清楚，丝腺生物反应器开发的道路更是尽显曲折而收效甚微。虽然研究者们利用家蚕丝蛋白基因的启动子先后在家蚕丝腺的不同部位成功的表达了绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、胶原蛋白、人碱性成纤维细胞生长因子、猫干扰素、植酸酶、人血清白蛋白、鼠单克隆抗体、蜘蛛牵引丝蛋白和人脑源神经营养因子等具有重大研究和应用价值的蛋白。但是目前家蚕丝腺中转基因表达的外源活性蛋白最高只能达到蚕茧总重量的8. 0%。表达量太低，从茧层中纯化少量蛋白的工艺成本太高，令试图进一步开发家蚕丝腺生物反应器学者和商家们都望而止步。不论是对于家蚕丝蛋白本身的改良，还是开发实用、高效的家蚕丝腺生物反应器， 找到一种能有效定点改造家蚕丝蛋白基因的方法或者快速育成丝蛋白突变体资源都显得尤为重要和紧迫。然而，尽管学者们在家蚕基因打靶方面也进行了一些探索，但是目前还没有一种可用的家蚕基因组定向改造技术。
锌指核酸酶是一种人工设计的限制酶，由负责特异性识别DNA序列的锌指蛋白结构域和负责切割DNA的核酸酶结构域组成。锌指核酸酶能在复杂基因组里的特定位点造成双链断裂。从而刺激机体的DNA修复系统非同源末端连接(NHEJ，Non-homologous End Joining)和同源重组(HR，Homologous recombination)。NHEJ 是一种特殊的 DNA 双链断裂修复机制，其在不存在DNA同源序列的情况下快速、高效的强行将断裂的DNA末端连接在一起，这是一种不忠实的修复机制，容易在修复处引入少数碱基的缺失、插入或突变；如果在同一 DNA大片段中设计两对锌指核酸酶，也可能会造成两个识别位点之间的大片段缺失；此外，在存在与断裂末端具有相同粘性末端的外源DNA的情况下，NHEJ还可以实现特定小片段的插入。HR是机体内常见的一种DNA断裂修复机制，其原理自上世纪80年代以来已经广泛的被应用于基因敲除中。通过人为设计各种不同类型的供体质粒，借助锌指核酸酶介导的双链断裂，可以高效的对靶标基因进行定点置换、修复、删除、插入等任意的操作。目前，这一技术已被广泛的应用于动植物的基因敲除和定点改造之中。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种家蚕丝素重链基因的突变方法和该突变方法得到的基因序列，该方法为获得突变的家蚕丝素重链基因提供了新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为
家蚕丝素重链突变基因，所述家蚕丝素重链突变基因为家蚕丝素重链基因1325 1362位为锌指核酸酶识别的靶位点的突变基因。所述家蚕丝素重链突变基因如SEQ. ID N0:2-118中任一种所示。所述家蚕丝素重链突变基因如SEQ. ID N0:2-14中任一种所示。所述家蚕丝素重链突变基因如SEQ. ID NO: 11所示。家蚕丝素重链基因的突变方法，将含有如SEQ. ID N0:119和SEQ. ID N0:120 所示锌指核酸酶序列的插入到含有T7 :5’ -taatacgactcactataggg-3’或SP6 5’ -atttaggtgacactatag-3'启动子的原核表达载体中，获得重组载体；将重组载体进行体外转录，获得编码锌指核酸酶序列的mRNA，将编码锌指核酸酶序列的mRNA作用于如SEQ. ID NO: 1所示的家蚕丝素重链基因1325 1362位为锌指核酸酶识别的靶位点，得家蚕丝素重链突变基因。本发明的目的之二在于提供两种家蚕丝素重链突变基因的新应用，该应用为制备丝胶蛋白和外源蛋白提供了有效途径。所述的家蚕丝素重链突变基因在制备内源蛋白中的应用。
所述的家蚕丝素重链突变基因在制备丝胶蛋白中的应用。所述的家蚕丝素重链突变基因在制备外源蛋白中的应用。 本发明的有益效果在于
本发明利用新近发展起来的锌指核酸酶技术，高效的对家蚕丝素重链基因进行了敲除，首次获得了包括在丝素重链基因N端非重复区域部分缺失、部分碱基突变或小片段插入的一系列突变家蚕品系。本发明提供的这些突变体具有如下的特点及优势1)本发明提供的丝素重链基因突变体的后部丝腺严重退化，其茧层中只含有中部丝腺中合成与分泌的丝胶蛋白，如果利用这些突变品系在家蚕后部丝腺中转基因表达外源蛋白(如蜘蛛丝、生物活性蛋白等)，外源蛋白在家蚕丝腺中的表达量和纯度将会大大的提高，这为家蚕丝腺生物反应器的开发提供了一种全新的有用的遗传素材；2)由于本发明提供的突变品系的茧层中只有丝胶蛋白，而纯丝胶蛋白目前已经广泛的被用于化妆品，本发明为丝胶蛋白的大规模生产提供了一种新的来源。
图1显示了家蚕丝素重链基因的结构示意图，其中方框表示外显子，灰色实线表示调控区域或内含子序列，数字表示相对于转录起始位点的位置，下划线部分为信号肽序列的核苷酸或氨基酸序列，箭头所示为信号肽序列切割位点。图2显示家蚕丝素重链基因部分序列在四十个蚕品系中的SNP分布，其中上端的方框和实线表示所分析区域在丝素重链基因中的位置和结构，其下面的四十一条实线表示 30个家蚕品系和11个野桑蚕品系的核苷酸序列，实线中菱形块表示相应品系在此处相对于参照序列有变异，数字表示SNP位点相对于转录起始位点的位置，实线右侧的编号为不同蚕品系的编号。图3显示了突变体家蚕丝素重链基因突变位点的核苷酸序列，其中左侧的编号为相应个体的编号，>Ref表示野生型品系大造的序列，方框所示的序列为锌指核酸酶识别位点，加粗的碱基为发生突变的碱基，-表示缺失，下划线表示的碱基为插入的碱基。图4显示了野生型家蚕和突变体家蚕的丝腺解剖图，其中左边为野生型品系大造五龄六天的丝腺，右边为突变体家蚕五龄六天的丝腺。图5显示了突变体家蚕蚕茧的观察图，其中上排为野生型品系N4的蚕茧，下排为突变体家蚕的蚕茧。图6显示了野生型家蚕和突变体家蚕蚕蛹和蚕茧重量的生物学统计分析。图7显示了分别以野生型家蚕、杂合型突变体家蚕和纯和型突变体家蚕为受体的转基因家蚕的丝腺的荧光信号，其中+/+、+/_和-/_分别表示野生型家蚕，杂合型突变体家蚕和纯和型突变体家蚕。图8显示了分别以野生型家蚕、杂合型突变体家蚕和纯和型突变体家蚕为受体的转基因家蚕的茧层蛋白分析，其中Transgenic-I、Transgenic-l和Non-transgenic分别表示两个转基因系和一个转基因系，+/+、+/-和-/-分别表示野生型家蚕，杂合型突变体家蚕和纯和型突变体家蚕，最下排数字表示泳道编号，箭头所示为外源绿色荧光蛋白融合蛋白的特异条带。
在生物学中，染色体是成对存在的，即同一个基因有两份，对于任何一个突变体， 两份基因都是正常的即为野生型，一份正常一份突变即为杂合型突变体，两份都为突变即为纯和型突变体。
具体实施方式
这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法均为本领域研究人员所熟知的方法或制造厂商所建议的条件，另外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可以应用于本发明中。本文中所述的实施方法与材料仅作示范之用。本发明的目的在于提供一种有效实现家蚕丝蛋白基因定向改造的方法，提供丝素重链基因突变的遗传资源。即对家蚕丝素重链基因进行定向敲除，获得一系列家蚕丝素重链基因缺失、突变或插入的突变体。为了解决上述技术问题，本发明综合考虑外源蛋白在家蚕丝腺中的表达量和内源性丝蛋白对后续蛋白纯化工艺的影响等目前家蚕丝腺生物反应器开发中所面临的主要问题，利用新近发展起来的基因敲除技术——锌指核酸酶技术对家蚕丝素蛋白基因进行敲除，并对获得的突变体进行基因组测序验证和功能验证。本发明家蚕丝素重链基因突变体及其制备方法和应用，依次通过以下步骤实现
(1)下载家蚕丝素重链基因序列，分析其中锌指核酸酶靶向位点；
(2)针对步骤(1)中分析的位点，设计特定的锌指核酸酶序列；
(3)人工合成或者从已有的锌指蛋白库中扩增得到编码步骤(2)中设计的锌指核酸酶的核酸序列；
(4)将步骤(3)中的核酸序列插入到含有T7或SP6启动子的原核表达载体中，获得重组载体；
(5)利用步骤(4)中获得的重组载体进行体外转录，获得编码编码步骤(2)中设计的锌指核酸酶的mRNA ；
(6)将家蚕滞育品种的蚕卵通过人工孵化处理后，置于15°C恒温、相对湿度75%、绝对黑暗的环境中催青至孵化，非滞育性家蚕品种的蚕卵置于25°C恒温、相对湿度75%、自然光照的环境中催青至孵化；
(7)逐天收集孵化的蚁蚕，置于25°C恒温、相对湿度75%、自然光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟；
(8)将上蔟后的家蚕转移至25°C恒温、相对湿度75%、自然光照的环境中进行种茧保
护；
(9)待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25°C、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0. 5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25°C的环境中保护；
(10)将蚕卵连同蚕连纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡至浆糊膨润(约经 2min)，而后用镊子将蚕卵转移至用75%酒精消毒的载玻片上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37%的甲醛蒸气中消毒5min ；
(11)以收集时间开始记时，于收集后2h-4h用显微注射仪将步骤(5)中获得的mRNA按摩尔比1:1的比例混合后从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔；
(12)将注射完成的蚕卵在35-37%的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25°C、相对湿度85% 以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(GO)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的Gl代蚕卵；
(13)将步骤(12)中获得的Gl代蚕卵经即时浸酸处理后置于25°C恒温、相对湿度75%、 自然光照的环境中催青至孵化；
(14)将步骤(13)中获得的Gl代蚁蚕在25°C恒温、相对湿度75%、自然光照的环境中用桑叶饲养至上蔟，观察其吐丝和营茧的情况，筛选获得吐丝或营茧异常的突变个体；
(15)将步骤(14)中获得的突变个体自交或回交制种，并提取制种后蚕蛾的基因组，用丝素重链基因特异的引物进行PCR扩增、测序，进一步鉴定和确认突变体；
(16)将步骤(15)中鉴定的突变体进行继代保存；
(17)根据在家蚕丝腺中拟表达蛋白的氨基酸序列，体外合成或者扩增得到其编码序列，并将其构建成转基因载体或者靶向家蚕丝素重链基因的同源重组载体；
(18)以步骤(16)中保存的蚕卵作为受体，通过步骤(6)至步骤(13)所述的方法将步骤(17)中转基因载体或同源重组载体注射到步骤(16)保存的家蚕胚胎中，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(GO)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的Gl代蚕卵，Gl代蚕卵经即时浸酸处理后于胚胎发育第六天在荧光显微镜下扫描获得转基因个体；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代，获得相应的转基因家蚕；
(19)对步骤(18)中获得的转基因家蚕的丝腺和茧层进行观察和分析，提取和纯化其中的目的蛋白。实施例1 家蚕丝素重链基因的序列分析
从NCBI数据库下载家蚕丝素重链基因的序列(编号为AF226688)，其序列结构如图1所示。家蚕丝素重链基因(+1 +16 788，其中+1表示转录起始位点)包括两个长分别为67bp 和15750bp的外显子以及一个长971bp的内含子，第一外显子包括25bp的非翻译区(+1 +25)和42bp的编码区(+26 +67)，第二外显子包含N端非重复区域(+1039 +1449)、C 端非重复区域(+16396 +16788)和高度重复区域(+1450 +16395，图1灰色方框所示)。 家蚕丝素重链基因编码的氨基酸序列的N端含有一个长21氨基酸残基的信号肽(图1下划线所示)。为了选择在各个蚕品系中均能发挥作用的锌指核酸酶靶位点，我们对家蚕丝素重链基因的N端部分序列(+1 +1448)做了 SNP分析，结果如图2所示。家蚕丝素重链基因的N端部分序列(+289 +1448)在29个家蚕品系和11个野桑蚕品系中存在10个SNP位点，分别为 +393、+465、+555、+556、+861、+862、+999、+1270 和 +1390。实施例2 家蚕丝素重链基因特异锌指核酸酶序列的设计与合成
根据家蚕丝素重链基因的序列特征及其在不同蚕品系中SNP分布，结合锌指蛋白识别 DNA序列的特性，我们选择CTGTTGCTCAAAGTTATGTTGCTGCTGATGCGGGAGCA作为锌指核酸酶识别的靶位点，该靶位点位于如SEQ ID NO: 1所示的序列的+1325 +1362位，并据此设计和合成锌指核酸酶。所以，家蚕丝素重链基因1325 1362位为锌指核酸酶识别的靶位点。
实施例3 锌指核酸酶mRNA的制备
人工合成或者从已有的锌指蛋白库中扩增得到锌指核酸酶的核酸序列(如SEQ ID N0:119及SEQ ID NO: 120)用限制性内切酶EcoRI和XhoI (购自TAKARA)双酶切后与经过同样酶切的原核表达载体pET28a进行连接反应，转化大肠杆菌并筛选阳性克隆，获得重组载体，酶切的具体反应体系如下
试剂体积
质粒— 5 μ
IOX H buffer一 1 μ
_I—
I EcoRII0.5 μ
厂 XholI^0.5 μ
「无菌水丨―3 μι.
总体积’10 μι
将重组载体用Xho I酶切消化后用MessageMax T7 mRNA体外转录试剂盒(购自 Epicentre)进行体外转录，其反应体系如下
Γ 试剂体积
「无RNA酶水10 μι 一’
I—质粒模板 Cl μg/μι) ....................................................................................... 2 μι —
I— IOX转录缓冲液 ........................................................................................4 μ .....................................
L. . ._______________
I ARCA Cap/ ΓΡ 混合物16 μ
Γ 100 π! DTT4 μ
I MessageIAX Τ7 _液4 μ 1
Γ 总体积—40 μ 1
I________________
将上述反应体系在37°C孵育30分钟后加1 μ IDNA酶，再继续孵育15分钟。将上述反应体系用Epicentre A-plus加尾试剂盒(购自Epicentre)进行加尾反应，其反应体系如下
权利要求
1.家蚕丝素重链突变基因，其特征在于所述家蚕丝素重链突变基因为家蚕丝素重链基因1325 1362位为锌指核酸酶识别的靶位点的突变基因。
2.根据权利要求2所述的家蚕丝素重链突变基因，其特征在于，所述家蚕丝素重链突变基因如SEQ. ID NO:2-118中任一种所示。
3.根据权利要求2所述的家蚕丝素重链突变基因，其特征在于，所述家蚕丝素重链突变基因如SEQ. ID NO:2-14中任一种所示。
4.根据权利要求2所述的家蚕丝素重链突变基因，其特征在于，所述家蚕丝素重链突变基因如SEQ. ID NO: 11所示。
5.家蚕丝素重链基因的突变方法，其特征在于，将含有如SEQ.ID NO: 119和SEQ. ID NO: 120所示锌指核酸酶序列的插入到含有T7 5，-taatacgactcactataggg-3，或SP6 5’ -atttaggtgacactatag-3'启动子的原核表达载体中，获得重组载体；将重组载体进行体外转录，获得编码锌指核酸酶序列的mRNA，将编码锌指核酸酶序列的mRNA作用于如SEQ. ID NO: 1所示的家蚕丝素重链基因1325 1362位为锌指核酸酶识别的靶位点，得家蚕丝素重链突变基因。
6.权利要求1所述的家蚕丝素重链突变基因在制备内源蛋白中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述内源蛋白为丝胶蛋白。
8.权利要求1所述的家蚕丝素重链突变基因在制备外源蛋白中的应用。
全文摘要
本发明涉及家蚕丝素重链基因突变的方法，具体为将编码锌指核酸酶序列的mRNA作用于如SEQ ID NO:1所示的家蚕丝素重链基因1325～1362位为锌指核酸酶识别的靶位点，得一系列家蚕丝素重链突变基因；该突变序列和用于制备丝胶蛋白和外源蛋白；1)本发明提供的丝素重链基因突变体的后部丝腺严重退化，其茧层中只含有中部丝腺中合成与分泌的丝胶蛋白，如果利用这些突变品系在家蚕后部丝腺中转基因表达外源蛋白，其表达量和纯度将会大大的提高，这为家蚕丝腺生物反应器的开发提供了一种全新的有用的遗传素材；2)本发明提供的突变品系的茧层中只有丝胶蛋白为丝胶蛋白的大规模生产提供了一种新的来源。
文档编号C12N15/10GK102358902SQ20111031963
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年4月2日
发明者向仲怀, 夏庆友, 徐汉福, 林英, 程道军, 赵萍, 马三垣 申请人:西南大学