专利名称：一种结核分枝杆菌特异性标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，更具体地讲，涉及一种结核病诊断试剂及其制备方法和应用。
背景技术：
快速、准确的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，对于结核病的控制具有重要意义。MTB感染的诊断方法有很多，目前临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可做为结核病确诊的“金标准”,但其培养时间太长，一般4-6周,难以满足临床需要；Bactec技术虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；乂线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应(PCR)技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂的困难，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。而MTB感染的血清免疫学诊断以其固有的操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊精密仪器等优势，是新形势下最可能满足经济不发达地区和结核病高发区所亟需的结核病诊断技术。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种结核分枝杆菌特异性标志物。本发明的第二个目的在于提供Rv3119重组蛋白在制备结核诊断试剂中的应用。本发明的第三个目的在于提供Rv3119重组蛋白在制备结核诊断试剂盒中的应用。本发明的第四个目的在于提供一种检测结核病的试剂盒。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案本发明的一个方面，提供了一种新的结核分枝杆菌特异性标志物Rv3119重组蛋白。本发明提供了一种新的重组质粒，即将Rv3119基因序列插入商用表达质粒序列中。Rv3119基因NCBI登陆号为BX842582.1 ;基因名称为moaEl ;蛋白号为CAE55554.1。本发明的“Rv3119基因序列”也包括对BX842582.1中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与BX842582.1核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。该术语还包括在中度严密条件下，更佳地在高度严密条件下与BX842582.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与BX842582.1的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本发明的重组质粒，通常将Rv3119基因插入表达质粒的多克隆位点处得到。本发明的重组质粒在制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作性地连接于表达调控序列，从而形成蛋白表达载体。本发明中可采用的载体包括且不仅限pET28a、pET28b、pET30a和pET32a。本发明的一个实施例中，所用的质粒为pET28b。本发明的另一方面， 提供了一种结核分枝杆菌相关重组蛋白，该蛋白是将插入Rv3119基因的重组表达质粒转入宿主细胞而得到的。用作检测试剂的Rv3119重组蛋白与NCBI上的CAE55554.1蛋白序列相比，加入了载体相关序列和纯化标签。例如，使用pET28b质粒时，蛋白序列后面加了 pET28b上的相关序列和一段His Tag纯化标签。所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配。可使用原核细胞或者真核细胞等，例如常用的大肠杆菌(E. coli)。用于转化的宿主细胞可以是BL21 (DE3)或BL21 plysS (DE3)菌株等。本发明的一个实施例中所用的就是BL21 plysS (DE3)菌株。本发明的另一方面，提供了上述Rv3119重组蛋白的制备方法，包括以下步骤
(I)结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的制备；
(2)Rv3119基因的PCR扩增；
(3)Rv3119基因表达质粒构建和鉴定；
(4)将步骤(3)构建的表达质粒转化入宿主细胞；
(5)诱导表达蛋白Rv3119；
(6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3119重组蛋白。上述制备方法中，各种实验参数均按常规操作选择，可视具体实验条件而定。本发明使用本领域技术人员已知的常规方法制备H37Rv基因组DNA ；Rv3119基因序列可以基于H37Rv基因组为DNA模板，用PCR扩增法获得；根据本发明所公开的相关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物；重组蛋白所用的表达质粒可以是pET28a、pET28b、pET30a和pET32a ;表达Rv3119蛋白所用的宿主细胞为大肠杆菌的BL21 (DE3)菌株或BL21 plysS (DE3)菌株；诱导表达Rv3119蛋白可采用多种方法，如使用IPTG ;分离纯化重组Rv3119蛋白也可采用多种方法，如亲和层析和分子筛层析等。本发明的一个实施例中，重组蛋白Rv3119按如下方法得到设计引物(F :5’ -CATGCCATGGCCAATGTGGTAG -3’ ；R :5’ -CTTCTCGAGTGGTCTATCGCCGAC-3’)。以 H37Rv 株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv3119基因，该基因的PCR产物经纯化后双酶切，酶切位点分别为Nco1、Xho I，克隆构建质粒。测序表明所插入的序列与GeneBank中H37Rv结核全基因组对应基因序列(Rv3119基因NCBI登陆号为BX842582.1 ;蛋白号为CAE55554.1)完全一致。将验证好的重组质粒转化到宿主细胞进行蛋白表达。本发明的一个实施例中，重组Rv3119蛋白可以按如下方法获得将鉴定好的重组质粒加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置45min，42°C水浴锅中热击90秒，冰浴3min，加入500ul的不含抗生素的预热的LB培养基。37°C摇床，220rmp，培养45_60min。取一定量在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，室温干燥后倒置于37°C温箱中培养过夜。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液体培养基中，220rmp，37°C培养OD至O. 6左右，加入IPTG，37°C 3h，收集IPTG诱导后的菌体，重悬后超声破碎。目的蛋白含于上清中，IOOOOg离心30min，收集上清。用IMAC亲和色谱柱进行亲和纯化(2CV去离子水冲洗，5CV含5mM咪唑的washing Buffer I平衡，6CV含目的蛋白上清上样，6CV含5mM咪唑的washing Buffer I 冲洗，6CV 含 IOmM 咪唑的 washing Buffer 2 冲洗，IOCV 含 500mM 咪唑的Elution Buffer洗脱)，收集过柱纯化的目的蛋白，用20mM Tris-HCl, pH 8.0的溶液透析，10 kDa超滤管对透析后的目的蛋白液进行浓缩，用BCA法测定纯化后目的蛋白的浓度。本发明的另一方面，提供了 Rv3119重组蛋白在制备结核诊断试剂中的应用。
本发明的又一方面，提供了 Rv3119重组蛋白在制备结核诊断试剂盒中的应用。Rv3119 是molybdenum cofactor biosynthesis protein E 的一个成员，位于 RD5区。本发明的重组蛋白用于结核病检测试剂盒的制备，可以用重组Rv3119进行免疫反应，也可以用Rv3119基因引物对患者血液抽提物进行PCR，从而达到检测目的。本发明提供了一种检测结核病的试剂盒，它含有重组蛋白Rv3119。本发明的试剂盒主要基于抗原抗体反应原理，包括且不仅限于采用凝集反应，沉淀反应，免疫荧光技术，E花环反应，ELISA，胶体金层析和化学发光等免疫反应等。如反应结果呈阳性，则认为该检测者患有结核病。本发明还提供了一种结核病检测试剂盒，它含有上述重组蛋白Rv3119的特异性抗体。将待检测者标本，包括且不仅限于组织、体液中的蛋白进行分离，如有与重组蛋白Rv3119的特异性抗体完全相同的蛋白，即判定该检测者患有结核。本发明的试剂盒中，除了有重组蛋白Rv3119或其特异性抗体外，还有用于检测的各种常用的试剂和器皿，包括各种缓冲液、稀释液、终止液等。在本发明的一个实施例中，结核检测试剂盒包括如下试剂和物品
(1)包被稀释液0.05M的碳酸盐包被缓冲液(pH9. 6)；(2)洗涤缓冲液PBST；
(3)样本稀释液含1%BSA的PBST；
(4)经标记的二抗标记的羊抗人IgG或IgM;
(5)阳性对照品和阴性对照品；
(6)底物溶液底物缓冲液A:乙酸钠2. 4g，柠檬酸0. 28g溶于88ml超纯水，磁力搅拌器充分搅拌溶解，最后加入53μ1 30%Η202，磁力搅拌器充分搅拌溶解而得；底物缓冲液B :80ml超纯水中加入0.03g TMB和0. 32g EDTA_Na2，然后再加入8ml甘油，磁力搅拌使其充分搅拌溶解而得；
(7)终止液2M硫酸；
(8)96孔酶标反应板。本发明的优点在于目前，结核病诊断广泛应用皮试检测试剂一结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(pro)。然而pro存在与环境分枝杆菌以及BCG疫苗株的交叉反应，所以诊断价值偏低。本发明提供了一种新的结核分枝杆菌特异性标志物RV3119重组蛋白，RV3119特异性抗原在检测肺结核方面敏感性比较高，是一个活性较强的B细胞目标抗原，用于结核病检测试剂盒的制备，具有较高的特异性和敏感性，而且安全可靠。
图1为重组蛋白Rv3119的表达纯化图，
其中，I是蛋白分子量标准，2是未诱导的BL21-pET28b:Rv3119菌株，3是诱导后的BL21-pET28b Rv3119菌株，4是破碎上清，5是破碎沉淀，6是亲和纯化前上样样品，7是Washing Buffer I 洗漆样品，8 是 Washing Buffer II 洗漆样品，9 是 Elution Buffer 洗脱样品。图2为重组蛋白Rv3119经进一步纯化及浓缩后的SDS-PAGE图，
其中，I是蛋白分子量标准，2是纯化浓缩后的目的蛋白(5Pg)，3是纯化浓缩后的目的蛋白(2. 5Pg)。图3为重组蛋白Rv3119和38kDa抗原分别对PPD-健康对照、PPD+健康对照血清和结核病人血清IgG反应结果，病例数为200。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。实施例1、重组质粒pET28b_Rv3119的构建 (I)靶基因引物设计
Rv3119-F:5’ - CATGCCATGGCCAATGTGGTAG -3’ ;
Rv3119-R:5’ -CTTCTCGAGTGGTCTATCGCCGAC-3’ ；
酶切位点分别为Nco1、Xho I。
(2)靶基因的PCR扩增、克隆及序列测定
以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为摸板，Rv3119_F和Rv3119_R为引物，应用Taq酶，通过PCR直接扩增Rv3119蛋白基因。PCR反应条件94°C预变性5min ;( 94°C，30s ;58°C，30s ；72°C,40s) 35个循环；72°C延伸5min ;4°C保存。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，后用DNA回收试剂盒(InvitiOgen)回收。用Nco I和Xho I酶切，克隆构建入pET28b质粒Nco I和Xho I酶切位点中。测序表明所插入的序列和GeneBank中H37Rv结核全基因组相应基因序列(Rv3119基因NCBI登陆号为BX842582.1 ;蛋白号为CAE55554.1)完全一致。实施例2、重组蛋白Rv3119的诱导表达及纯化
将装有IOOul BL21 (DE3)physS感受态细胞的Eppdorf管从_80°C冰箱立即放入冰上。3-5分钟后等管内液体融化后，将O. 5ul测序正确的重组pET28b-Rv3119质粒放入感受态细胞中，冰上放置45min，42°C水浴锅中，热击90s，冰上静置3min，加入500ul的不含抗生素的预热的LB培养基，37°C摇床，220rmp，培养45-60min。取一定量在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，室温干燥后倒置于37°C温箱中培养过夜。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液体培养基中，220rmp，37°C培养OD至O. 6左右，加入终浓度为IOmMIPTG，37°C 3h，收集IPTG诱导后的菌体，按IOml Washing Buffer I每克湿菌的比例重悬后超声破碎。结果目的蛋白含于上清中。IOOOOg离心30min，收集上清。用IMAC亲和色谱柱(Bio-Rad)进行亲和纯化[2倍的柱体积(CV)去离子水冲洗，5CV含5mM咪唑的washingBuffer I平衡，6CV含目的蛋白上清上样,6CV含5mM咪唑的washing Buffer I冲洗,6CV含 IOmM 咪唑的 washing Buffer 2 冲洗，IOCV 含 500mM 咪唑的 Elution Buffer 洗脱],收集过柱纯化的目的蛋白(图1)，用20mM Tris-HCl, pH 8. O的溶液透析，10 kDa超滤管对透析后的目的蛋白液进行浓缩，用BCA法测定纯化后目的蛋白的浓度，SDS-PAGE电泳分析目的蛋白纯度(图2)。实施例3、以商品化的38kDa抗原(ImmunoDiagnostics, Inc. , USA)作为对照,评估重组Rv3119抗原作为检测试剂对PPD-健康对照、PPD+健康对照血清和结核病人血清中IgG的反应效果
利用间接酶联免疫吸附试验检测不同血清标本中抗Rv3119的IgG反应。具体步骤是96孔板用抗原Rv3119 (5Pg/ml)或38kDa抗原(5ug/ml)包被过夜，弃去包被液，PBST洗涤5次，甩干。每孔加入300μ1含1%BSA的PBST，37°C温育2h。甩干，每孔加入ΙΟΟμΙ用含1%BSA的PBST稀释的待检血清(1:50)，37°C温育O. 5h。)弃去血清，PBST洗涤5次，甩干。每孔加入ΙΟΟμΙ用含1%BSA的PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，37°C温育O. 5h。弃去液体，PBST洗涤5次，甩干。每孔加入ΙΟΟμΙ新鲜配置的底物液(A:B=1:1)，37°C避光温育IOmin。每孔加入50μ1 2Μ硫酸终止反应，450nm检测OD值。以健康对照者血清标本的平均OD值加3倍标准方差作为Cutoff值的判断标准。若血清标本的OD值大于或等于此标准，即判断为阳性，反之为阴性。结果表明与38kDa抗原相比，重组Rv3119蛋白抗原在诊断结核病方面具有更高的敏感性和特异性。其在结核病人血清中IgG的阳性率为33. 1%，与PPD-和PPD+健康对照相比，其检测特异性分别为100%和95. 8%，总特异性为98. 4%(图3)。在检测结核病人的特异性方面，重组蛋白Rv3119相当高。本发明的重组Rv3119蛋白可以单独作为诊断试剂，也可以与现有已知的诊断抗原联合，从而提高检测结核病人的敏感性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护 范围。SEQUENCE LISTING
<110>上海交通大学医学院
〈120〉一种结核分枝杆菌特异性标志物及其应用
〈130〉/
〈140〉201110320129. 7
〈141〉2011-10-20
〈160〉2
<170>PatentIn version 3.5
〈210〉I
〈211〉22
〈212〉DNA
〈213〉M. tuberculosis
〈400〉I
catgccatgg ccaatgtggt ag22
〈210〉2
〈211〉24
〈212〉DNA
〈213〉M. tuberculosis
〈400〉2
cttctcgagt ggtctatcgc cgac2权利要求
1.Rv3119重组蛋白在作为结核分枝杆菌特异性标志物中的应用。
2.Rv3119重组蛋白在制备结核诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Rv3119重组蛋白通过以下方法制备 (1)结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的制备； (2)Rv3119基因的PCR扩增； (3)Rv3119基因表达质粒构建和鉴定； (4)将步骤(3)构建的表达质粒转化入宿主细胞； (5)诱导表达蛋白Rv3119； (6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3119重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增，引物为Rv3119-F:5，- CATGCCATGGCCAATGTGGTAG -3，；Rv3119_R :5，-CTTCTCGAGTGGTCTATCGCCGAC-3，；酶切位点分别为Nco1、Xho I。
5.Rv3119重组蛋白在制备结核诊断试剂中的应用。
6.一种检测结核病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有重组蛋白Rv3119。
7.—种检测结核病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有重组蛋白Rv3119的特异性抗体。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌特异性标志物Rv3119重组蛋白，并公开了Rv3119重组蛋白在制备结核诊断试剂和结核诊断试剂盒中的应用，本发明的Rv3119特异性抗原在检测肺结核方面敏感性高，是一个活性较强的B细胞目标抗原，可以应用于结核病快速检测试剂盒的制备，而且安全可靠。
文档编号C12N15/70GK103063843SQ201110320129
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者张舒林, 赵俊伟, 张苗苗, 付少刚, 郭晓奎, 孙战强 申请人:上海交通大学医学院