专利名称：一株产氨甲酰妥布霉素工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌及其应用，具体地说，本发明涉及一株主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，应用于抗生素制造。
背景技术：
黑暗链霉菌(份r^tofflj^M imdrariM)是1967年美国礼莱公司研究人员从土壤中分离得到，该菌株能产生一组抗生素，称之为暗霉素复合物(Nebramycins)，组分2 (图 1;阿伯拉霉素)、4 (图2;氨甲酰卡那霉素B)、5’(图2;氨甲酰妥布霉素)为主组分，在对各个因子进行生物学研究时发现这三个组分均有良好的抗菌作用，且都是重要的原料药。多年来科研工作人员对黑暗链霉菌的研究，主要集中在传统常规诱变育种、基因工程育种和优化生产工艺等各方面，并取得了一些进展。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究，并融入到了抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面的研究，也取得不少进展。妥布霉素是一种广谱高效抗生素，在体外对多种病原菌有抗菌活性，特别是那些对庆大霉素耐药的铜绿假单孢菌有效，而且妥布霉素的耳、肾毒性相对较低，是临床上广泛应用的抗菌药。目前，妥布霉素的生产方法是从黑暗链霉菌发酵液中经层析分离，去除阿伯拉霉素和卡那霉素B后，得到氨甲酰妥布霉素，再在碱性条件下，高温水解制备妥布霉素。 由于阿伯拉霉素和卡那霉素B的结构和理化性质与氨甲酰妥布霉素相近，因此，在工业化生产中，要从发酵液中对该三种组分进行逐一分离，十分困难。不但层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，工艺复杂，而且产品质量不稳定，因此，长期困扰企业生产，阻碍了企业产品生产技术的升级换代，成了产业化生产的技术瓶颈，结果是生产成本高，环境污染严重，价格居高不下。若能获得主产氨甲酰妥布霉素的稳定菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的直接经济效益，间接社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一株不合成阿伯拉霉素，主产氨甲酰妥布霉素的工程菌， 用于制备硫酸妥布霉素。该工程菌为黑暗链霉菌(份了卬如耶⑶·^ tenebrarius) HM106 (Δ aprHM)菌株， 已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称 CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 52460
本发明还提供了菌株HM106 (Δ aprHM)的发酵方法，具体步骤如下发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37°C培养5天，挖块接种于种子培养基，37°C摇床培养18 h，转速为180-350rpm ；然后按10%接种量转接于发酵培养基，37°C摇床培养120 h，转速为250rpm ；所述种子培养基葡萄糖l_5g，玉米淀粉10_20g，黄豆饼粉5_30g，磷酸二氢钾0. 5-1. 0g，氯化钾l_5g，氯化钙0. 5-5. 0g，硫酸镁0. 5-5. 0g，加自来水至 1L，发酵培养基葡萄糖10_30g，玉米粉10_30g，黄豆饼粉10_30g，硫酸镁1. 0_llg，碳酸钙 l_7g，硫酸锌0. 1-0. 5g，硫酸铵l_7g，玉米淀粉10_50g，淀粉酶0. 01-0. 50g，加自来水至1L， 用氢氧化钠溶液调节PH至7. 0-7. 2。所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。菌株GKllOl的筛选，主要包括以下几个步骤
基因置换质粒的构建；
B.置换质粒转化黑暗链霉菌；
C.转化子的筛选；
D.工程菌组分的鉴定。基因置换的方法是，采用PCR法分别获得a/Tr/Z-l基因上下游长度约2000bp的片段，作为同源交换臂，将两者同时连接到穿梭载体上，如PKC1139等，在两个交换臂之间插入四环素抗性基因tef，作为密码标记，交换臂外插入红霉素抗性等基因，如ermE,作为筛选标记，便于黑暗链霉菌DNA重组后工程菌的筛选，最终得到pHM106。其中转化是以五coli ET12657(pUZ8002)介导的结合转移方法。过程是首先筛选红霉素抗性(er EK)菌株，无药(不含红霉素)传代后再从中筛选红霉素敏感(ermEs)菌株，如何进一步筛选重组的转化子HM106。经发酵，采用薄层层析法(TLC法)对发酵代谢产物进行初步分析，锁定目标菌株，最后经HPLC-MS法对目标工程菌代谢产物的组分进行精确确认。本发明获得了一株精确阻断了阿伯拉霉素生物合成，主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，大大简化了妥布霉素的生产工艺，并降低生产成本，减少环境污染，同时提高了产品质量。可用于大规模生产妥布霉素。
图1为阿伯拉霉素的结构式。图2为氨甲酰卡那霉素B、氨甲酰妥布霉素的结构式。图3为<3/7 7-#基因功能同源交换灭活示意其中I 染色体上基因位置；II:与染色体上的JHBl侧单交换；III:与染色体上的 JHB2侧单交换；IV:染色体上发生了回复突变；V:染色体上发生了双交换。图4为pHM106构建流程图。图5为亲株黑暗链霉菌Tt-49与工程菌黑暗链霉菌HM106发酵代谢产物的TLC比较分析结果；
其中1为妥布霉素标准品与安普霉素标准品混合物；2为黑暗链霉菌HM106发酵代谢产物；3为野生型菌株黑暗链霉菌Tt-49的发酵代谢产物。A为妥布霉素，B为安普霉
ο图6为亲株黑暗链霉菌Tt-49代谢产物的HPLC-MS分析图谱；峰5对应分子量 540. 3，是阿伯拉霉素；峰6对应分子量为511. 1，是氨甲酰妥布霉素。图7为工程菌黑暗链霉菌HM106代谢产物的HPLC-MS分析图谱；峰8对应的分子量511. 1的是氨甲酰妥布霉素，未见分子量M0. 3的阿伯拉霉素。图8为提取精制得到的硫酸妥布霉素产品；峰2对应的分子量为468. 1，为妥布霉素，峰1对应的分子量为511. 1，为少量氨甲酰妥布霉素。
具体实施方式
实施例1
试剂来源pMD19-T和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒pAGe(含抗性基因ermE)由上海医药工业研究所邵雷博士惠赠，质粒PBR322 (含有四环素抗性基因)为本实验室保存。本发明主要包括以下主要步骤 1.构建基因置换质粒
以Pi印ersberg等公布的安普霉素(又称阿伯拉霉素)生物合成基因簇序列(GenBank Accession Number AJ629123)作为参考，确认出发菌株黑暗链霉菌Tt_49(林玉双，洪文荣， 林烨等.氨甲酰妥布霉素高产菌株选育及其发酵特性研究[J].中国抗生素杂志，2008，33 (7) =442-445)染色体DNA上阿伯拉霉素生物合成基因簇的存在。然后分别在即基因上下游设计两对引物SDl/ SD2和SD3/ SD4，以黑暗链霉菌Tt_49的总DNA (DNA提取方法见白林泉.链霉菌基因组中DNA大片段的基因置换与克隆[D].武汉华中农业大学， 1998.)为模板进行PCR扩增，获得两个片段JHBl和JHB2，其长度分别为1982bp和2029bp， 扩增产物依次克隆至PMD19-T上，得重组质粒pHM102。以质粒pBR322为模板，以Tl和T2为引物扩增得到四环素抗性基因(tef)，克隆到pMD19-T上，得重组质粒，命名为pMTll ；以质粒pAGe为模板，El和E2为引物，扩增得到红霉素抗性基因、ermE\克隆到pMD19_T上，得到重组质粒，命名为pME12。pMTll经损al单酶切后，回收四环素抗性基因(teO (1308bp)，插入pHM102的 Xbal位点，得到重组质粒，命名为pHM103。pHM103 经^boRI/^7 II 双酶切，回收 5295bp 片段，与 pKC1139 经双酶切，回收的大片段进行连接，筛选得到阳性克隆子，命名为PHM105;
PME12经单酶切后回收红霉素抗性基因(erffl￡0(1746bp)，插入pHM105的位点，筛选得到目标重组阳性克隆子，命名为PHM106。构建策略见图4。表1实施例所涉及的引物
权利要求
1.一株主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为灭活阿伯拉霉素生物合成基因簇中功能的黑暗链霉菌(份OfflJ^e1S tenebrarius) M106 (AaprHM)，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 52460
2.一种如权利要求1所述的工程菌的发酵方法，其特征在于，菌株ΗΜ106 (AaprHM) 发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37°C培养5天，挖块接种于种子培养基，37°C摇床培养18 h，转速为180-350rpm;然后按10%接种量转接于发酵培养基，37°C摇床培养120 h，转速为250rpm ；所述种子培养基葡萄糖l_5g，玉米淀粉10-20g,黄豆饼粉5-30g,磷酸二氢钾0. 5-1. Og,氯化钾l_5g，氯化钙0. 5-5. Og,硫酸镁 0. 5-5. Og，加自来水至1L，发酵培养基葡萄糖10_30g，玉米粉10_30g，黄豆饼粉10_30g， 硫酸镁1. Ο-llg，碳酸钙l-7g，硫酸锌0. 1-0. 5g，硫酸铵l-7g，玉米淀粉10_50g，淀粉酶 0. 01-0. 50g,加自来水至1L，用氢氧化钠溶液调节PH至7. 0-7. 2。
3.如权利要求1所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种灭活aprH-aprM功能的主产氨甲酰妥布霉素的工程菌及其应用，所述工程菌为黑暗链霉菌HM106(△aprHM)，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.5246，所述的工程菌用于制备抗菌药物。本发明获得了主产氨甲酰妥布霉素的工程菌，简化了生产工艺、降低了生产成本，同时还方便了产品的质量控制。
文档编号C12P19/26GK102373174SQ20111033383
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者严绍德, 洪文荣 申请人:福州大学