专利名称：一种ERα36敲低PC12细胞株及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种ERa 36敲低PC12细胞株及其构建方法。
背景技术：
雌激素(estrogen，Ε)在生物体内具有广泛的生物学活性，不但对众多靶组织如生殖道、乳腺、骨骼及心血管系统有调节作用，还可作用于与认知功能相关的神经回路，参与5-羟色胺、多巴胺、谷氨酸、GABA和乙酰胆碱等神经递质和多种神经肽活动的调节，影响突触可塑性和学习记忆。同时，雌激素在神经细胞的分化和发育、神经元存活和轴突生长的诱导以及新生神经元的形成等诸多过程中也发挥重要作用。阿尔兹海默病(Alzheimer’ s disease,AD)是一种严重威胁老年人身体健康的神经退行性疾病。已知雌激素替代疗法能够改善脑功能的退化，降低绝经期后女性AD发病率，而生理水平的雌激素可减少伴随AD产生的神经毒性蛋白。雌激素替代(HT)能改善绝经期后女性学习记忆等脑功能，但同时又具有诱发子宫内膜癌和乳腺癌的封信啊。雌激素拮抗剂可作为乳腺癌术后复发防止药物，但同时也可减弱患者的记忆功能。雌激素受体(estrogen receptor, ER)是类固醇激素受体超家族的成员之一，能够与雌激素特异性结合，通过基因组作用模式调控靶基因的转录或激活细胞内信号，改变胞内蛋白功能和调控基因表达。雌激素受体主要分为ERa和ERi3两种类型。近年来，随着研究的不断深入，又陆续发现新的ER α受体亚型。目前，ER α分为ER α 66、ER α 46、ER α 36 三种亚型。其中，ERa 36是由Wang等在2005年克隆并鉴定出的一种新型雌激素α受体。 研究发现，在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等组织中，均有ERa 36的表达，并参与肿瘤细胞的生长、增殖、分化等病理过程。但ER α 36在神经系统中的表达及其功能还未见报道。shRNA是short hairpin RNA的缩写。翻译为“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol III启动子控制。随后在连上5 6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在活体中输送“小干扰RNA”(siRNA) 的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理。PC12细胞株(pheochromocytoma cell line，PC12)源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，神经嵴源性，有较典型的神经内分泌细胞特性，胞膜上有胆碱能M和 N受体等，常作为多巴胺能神经元的细胞模型。通常，它们在含血清的培养基中可增殖，呈现未分化状态，而在加入NGF后细胞分化为交感神经元的形态。同时研究还发现，神经元样的 PC12细胞可以发生增殖，因此，常被用作研究神经细胞分化的体外细胞模型。目前对于ERa 36的研究主要集中在乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌等组织或细胞中，对于其在神经系统中的表达及功能的研究还未见报道。雌激素的这种诱发乳腺癌和神经保护的双刃剑作用是否可以通过ERa 36来调节，还值得我们进一步研究。因此，我们利用ER α 36-shRNA转染PC12细胞建立ER α 36敲低的PC12细胞模型，为探讨ER α 36在中枢神经系统中的作用提供可行的细胞材料。
发明内容
本发明为ERa 36敲低的PC12细胞系的建立，通过应用siRNA技术，利用 ER α 36-shRNA转染PC12细胞，建立ER α 36敲低的PC12细胞株，再利用免疫细胞荧光、免疫细胞化学和Western blot技术对细胞株进行检测，证明细胞株建立成功。本发明通过下述技术方案实现本发明的一方面在于提供一种ERa 36敲低PC12细胞株的构建方法，其包括如下步骤(a)构建含有碱基序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的 pRNAT_U6. 1/Neo 重组质粒；(b)利用如步骤(a)获得的重组质粒转染宿主细胞PC12得到重组细胞株；(c)将步骤(b)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3 5天更换一次筛选培养基，筛选10 14天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15%新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL ；(d)在15% NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250 μ g/mL，在37°C 的5% CO2培养箱中维持筛选，每3 5天更换上述培养基；(e)将步骤(d)筛选所得的阳性细胞株利用免疫细胞荧光、Western Blot方法、免疫细胞化学法检测ERa 36的表达；其检测结果为与PC12细胞株相比，阳性细胞株中有98%以上的细胞表达绿色荧光蛋白，阳性细胞株中ERa 36的表达量为PC12细胞的47%。具体的，在上述的构建方法中，步骤(a)所述的构建方法包括如下步骤(f)取SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2两条单链DNA模板等浓度混勻后，经95°C加热lOmin，室温静置lh，稀释至终浓度lOng/ul ；(g)用T4DNA连接酶将步骤(f)所得产物与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体 pRNAT-U6. Ι/Neo 在 22°C连接 2h ；(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E. coli DH5a后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO :3。本发明的另外一方面在于通过上述的构建方法所获得的ERa 36敲低PC12细胞株。ER a 36敲低的PC12细胞系的建立，为研究ERa 36在中枢神经系统中作用提供了有力的实验材料。
图1 :ER a 36-shRNA表达载体的构建示意图；图 2 :pRNAT-U6. 1/Neo 质粒DNA 的酶切鉴定；其中，HindIII 代表HindIII marker, DL2000代表DL2000marker, ShRNA代表经过双酶切的ERa 36-shRNA质粒；图3 为建立ERa 36敲低的PC12细胞株；其中，PC12代表PC12细胞株，PC12-36L 代表转染了 ERa 36-shRNA质粒的PC12细胞株，PC12-36C代表转染了 pRNAT_U6. 1/Neo质粒的PC12细胞株；图4:Western blot法对细胞株中ERa 36进行检测；其中，PC12代表PC12细胞株，PC12-36L代表转染了 ERa 36-shRNA质粒的PC12细胞株；图5:不同ERa 36表达的PC12细胞株的生长曲线图(*p < 0. 05，、< 0. 01)； 其中，PC12代表PC12细胞株，PC12-36L代表转染了 ERa 36-shRNA质粒的PC12细胞株， PC12-36C代表转染了 pRNAT-U6. Ι/Neo质粒的PC12细胞株。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。pRNAT-U6. Ι/Neo 购自 GeMcript，SD1211 ；感受态 E. coli DH5a TaKaRa Code :D9057 ；SOC培养基S0C培养基组份浓度20g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母膏 (Yeast Extract) ,0. 5g/L NaCl,2. 5mM KCl, IOmM Mg2+，20mM 葡萄糖(glucose)，定容至 IOOml0配制方法①配制IM的葡萄糖溶液将18g的葡萄糖溶解在90ml的去离子水中，定容至100ml，用0.22 μ m滤膜过滤除菌；②向100ml SOB培养基中加入除菌的IM葡萄糖溶液anl，均勻混合；③4°C保存。LB液体培养基配制每升培养基，在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨IOg ；酵母提取物5g ；NaCl IOg ；摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNa0H调pH至7. 0，用去离子水定容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20min ；LB固体培养基配制方法同LB液体培养基，100ml LB液体培养基再加入1. 5g琼脂粉；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒天跟生化科技有限公司，DP209-02 ；PC12细胞株大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购自上海细胞所；6孔培养板购自美国Corning公司，3516 ；无血清无抗生素的RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，31800022 ；Opti-MEM 购自美国 hvitrogen 公司，31985-062 ；Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自 hvitrogen，11668-019 ；新生牛血清(NCS)购自美国Gibco公司，16010059 ；G418 购自美国 Amresco 公司，E859 ；胰酶购自美国Amresco公司，0458_25g ；兔Mi^ptavidin-HRP试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，CffOl 18 ；浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9031 ；GFP抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TA-06 ；羊抗兔IgG-HRP 购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZDR-5209 ；羊抗鼠IgG-HRP 购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ZDR-5210 ；ERa 36抗体由美国Creighton大学医学研究中心王兆一博士馈赠；β -actin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，BM0627。实施例1.质粒ER α 36-shRNA的获得CN 102533765 A
质粒ER α 36-shRNA由美国Creighton大学医学研究中心王兆一博士馈赠，它是通过克隆DNA寡核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的基因，并将其重组于pRNAT_U6. 1/ Neo载体，从而构建成的特异性的ERa 36-shRNA。 (1) shRNA序列、DNA模板的合成对应ER a 36基因的shRNA DNA模板为SEQ ID NO :1, SEQ ID NO 2并人工合成序列。(2)构建 ER a 36-shRNA 表达载体ERa 36-shRNA 表达载体的构建示意图，如图 1。取 SEQ ID N0:liPSEQ ID NO 2 两条单链DNA模板各lug/ul，混勻，95°C加热lOmin，室温静置lh，稀释至终浓度lOng/ul待用，用T4DNA连接酶与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体pRNAT_U6. 1/Neo在22°C连接池；获得连接产物。连接反应体系含有
线性化载体 pRNAT-U6.1/Neo0. Iug
DNA模板Iul
T4 DNA 连接酶0.5ul
1 χ T4 DNA连接酶缓冲液补充终体积为10uL。(3)转化取步骤⑵的5ul连接产物，转化IOOuL感受态E. coli DH5 α，缓慢混勻，冰浴 30min，42°C水浴90秒，冰浴2min，加入900ul的SOC培养基，37°C下150转/min摇床培养 Ih ；收集菌液，分IOOul和900ul涂布加入100ug/ml Amp的LB固体培养基，37°C过夜培养。(4)鉴定挑斑点最大的两个单菌落，接种到50ml LB液体培养基(含100 μ g/ml Amp)中， 37°C振荡培养约12h，至对数生长后期。收集过夜培养的菌种，按照质粒提取试剂盒说明书(上海莱枫生物科技有限公司，商品货号DK302-01)提取质粒DNA ；将提取的质粒溶于20 μ 1 TE缓冲液(ρΗ8. 0) 中，-20°C储存。用紫外分光光度计检测其浓度，浓度为2 μ g/μ 1。将提取的质粒DNA，取1 μ g进行酶切鉴定酶切鉴定反应体系如下，反应温度37°C，反应时间2h ；获得酶切产物。
限制性内切酶HindIIIΙμ
限制性内切酶BamH IΙμ
酶解缓冲液(IOxHbuffer)2μ1
提取的质粒DNAIpg
ddH2015μ1取酶切产物10 μ 1，用凝胶电泳鉴定酶切后产物，结果如图2，得到分子量 6500bp左右和IOObp左右，将IOObp片段切下，利用天跟生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒将DNA回收，送去大连宝生物公司测序，测序结果如SEQ ID NO 3与质粒设计图谱相吻合，证明最终获得阳性质粒，将其命名为质粒ERa 36-shRNA。实施例2.质粒ER α 36-shRNA转染PC12细胞(1)转染前于6孔板中接种细胞浓度为6 X IO5个/mL的PC12细胞，每孔2mL，放于37°C的5% CO2培养箱培养，24h后细胞贴壁浓度达到90%进行转染；(2)转染过程转染方法见Lipofectamine 2000(美国hvitrogen公司)说明书。(a)将 20 μ L 的 Lipofectmine 2000 加入到 250 μ L 的 Opti-MEM 中，轻轻混勻，室温静置5min ；(b)将 2 μ L 浓度为 2 μ / μ L 的 ER α 36-shRNA 质粒与 250 μ L 的 Opti-MEM 轻轻混勻；(c)再将步骤(a)和(b)所得的混合液混勻，室温静置20min ；(d)将步骤(1)的6孔板中的培养基换成无血清无抗生素的RPMI1640培养基，每孑L 2mL ；(e)向步骤(d)的6孔板每孔中加入500 μ L步骤(c)所得的混合转染液，前后振荡混勻；(f)将6孔板放于37°C的5 % CO2培养箱，培养4小时后，将培养基更换为加有15 % NCS的RPMI1640培养基^iil，继续在37°C的5% CO2培养箱培养48h。荧光显微镜下观察 GFP表达。向PC12细胞中转染空质粒的步骤同转染过程(a)到(f)，区别在于步骤(b)所述质粒以pRNAT-U6. Ι/Neo代替ERα 36-shRNA，将获得的阳性细胞株命名为PC12-36C。实施例3.阳性细胞株的筛选(1)向步骤(f)的6孔板每孔中加入终浓度500 μ g/mL的G418，进行阳性细胞株的筛选，每3 5天更换含终浓度500 μ g/mLG418和15%新生牛血清(NCS)的RPMI1640的筛选培养基，在37°C的5% CO2培养箱中培养10 14天；(2)挑取单克隆继续在37°C的5%C02培养箱中培养3 4周；将获得的阳性细胞株命名为PC12-36L ；(3)在15% NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250 μ g/mL，在37°C 的5% CO2培养箱中维持筛选，每3 5天更换上述培养基；实施例4.阳性细胞株的检测1.免疫细胞荧光对细胞株中ERa 36进行检测细胞荧光检测由于转染的质粒中带有绿色荧光蛋白(GFP)基因，转染成功后即可以在荧光显微镜下观察到GFP。荧光显微镜下观察PC12细胞、以及分别经pRNAT-U6. Ι/Neo质粒、ER a 36-shRNA质粒转染的PC12细胞的情况，从图3中可见，图3㈧为PC12细胞，即对照组细胞没有转染质粒，因此没有GFP表达；图3(B)为成功转染了空质粒载体PRNAT-U6. Ι/Neo的PC12细胞，发现转染的细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光；图3 (C)为转染ER a 36-shRNA 质粒的PC12细胞，发现细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光，证明转染成功。2.免疫细胞化学对细胞株中ER a 36进行检测
接种对数生长期细胞(5xl04个/mL)于六孔板中，每孔^iil，细胞贴壁48h。4% 多聚甲醛固定爬片细胞，2 Mh内即可实验。用IxPBST (T :曲拉通-100)漂洗爬片细胞3次，每次5min。PBS浸泡5min。按兔Sti^ptavidin-HRP试剂盒说明书操作，滴加兔 Mi^ptavidin-HRP试剂盒中的试剂1，内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10min。PBS充分淋洗。滴加兔Mi^ptavidin-HRP试剂盒中的试剂2，正常羊血清封闭液，室温孵育lOmin。 倾去封闭液，直接滴加一抗ER α 36(1 100)，湿盒37°C孵育池。PBS充分淋洗。滴加兔 Mi^ptavidin-HRP试剂盒中的试剂3，生物素标记羊抗兔二抗工作液，室温孵育lOmin。PBS 充分淋洗。滴加兔Mi^ptavidin-HRP试剂盒中的试剂4，HRP标记的链霉亲和素，室温孵育lOmin。PBS充分淋洗。滴加DAB显色工作液，显色lOmin，自来水冲洗浮色。在避光处照相。利用免疫细胞化学检测发现细胞呈免疫阳性反应并且有免疫阳性颗粒说明转染成功，免疫组化检测转染后PC12细胞中ERa 36的表达，图3 (D)为PC12细胞对照组，细胞中观察到免疫阳性颗粒，证明存在ER α 36表达；图3 (E)为PC12细胞空质粒载体，与对照组相比免疫阳性颗粒没有明显变化，证明转染空质粒载体对ERa 36表达没有影响；图3(F)为 PC12细胞转染质粒ERa 36-shRNA，发现ERa 36敲低后表达量明显减少。3. Western blot技术对细胞株中ER a 36进行检测利用Wfestern blot检测发现有蛋白印迹的条带，即为细胞株中存在ER a 36表达， 蛋白印迹的条带变淡即为ERa 36敲低成功。不同组细胞分别用PBS冲洗两次，加入细胞裂解液(1 X IO7个细胞/500 μ L)，得到细胞全蛋白，采用Bradford法测定全细胞蛋白质的浓度。10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭lh，加入相应一抗ER α 36 (ER α 36抗体0. 33 μ L加入到 PBS-Tween-20 溶液 2mL 中)、β -actin ( β -actin 抗体 2 μ L 加入到 PBST 溶液 ^nL 中)4°C 孵育过夜，室温PBST洗膜，与对应的辣根过氧化物酶标记的二抗检测ER α 36需加羊抗兔 IgG-HRP (羊抗兔IgG-HRP 0. 6 μ L加入到PBST溶液6mL中)、检测β -actin需加羊抗鼠 IgG-HRP (羊抗鼠IgG-HRPO. 6 μ L加入到PBST溶液6mL中)室温孵育2h，PBST洗膜，ECL显色，进行X光胶片感光，冲洗胶片。扫描仪和凝胶成像系统记录相应条带的透色光积分吸光度值。图4为Wfestern blot检测转染后PC12细胞中ER α 36的表达，图4 (A)为PC12细胞对照组，图4(B)为PC12细胞转染质粒ERa 36-shRNA，转染组细胞中ERa 36的表达都明显低于对照组，ER a 36的表达量为母细胞的47%。图4 (C、D)为两种细胞的β -actin，证明两种细胞全蛋白加样量一致。提示，ERα36敲低的PC12细胞株PC12-36L建立成功，可以用于其他实验研究。4.不同ERa 36表达的PC12细胞株的生长曲线图接种对数生长期细胞IX 1 个/11^于M孔细胞培养板中，利用RPMI1640+15% NCS培养基在37°C的5 % CO2培养箱中培养，每天对细胞进行计数，每次三个平行孔。每次先弃去培养基，用PBS缓冲液，以500 μ L/孔的量清洗细胞，再用500 μ L/孔的胰酶消化细胞，利用血球计数板对细胞进行计数，绘制生长曲线，如图5。PC12-36C细胞与PC12细胞的生长曲线十分接近，并无特别明显的增殖加快的迹象，而PC12-36L细胞的生长曲线明显区别于PC12细胞，增殖速度加快。
5.不同ERa 36表达的PC12细胞倍增时间的比较对通过上述方法测得的细胞数量和绘制的细胞生长曲线进行计算，利用倍增时间公式=Td = TxigZzlg(NzX)计算，其中Td为倍增时间，T为所取的对数生长期的天数，Ntl为对数生长期首天的细胞数，N为对数生长期末天的细胞数。表1不同ERa 36表达的PC12细胞倍增时间的比较
权利要求
1.一种ERa 36敲低PC12细胞株的构建方法，其特征在于包括如下步骤(a)构建含有碱基序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的pRNAT_U6. 1/Neo重组质粒；(b)利用如步骤(a)获得的重组质粒转染宿主细胞PC12得到重组细胞株；(c)将步骤(b)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3 5天更换一次筛选培养基，筛选10 14天，获得阳性细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15%新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL ；(d)在15%NCS的RPMI1640培养基中加入G418的终浓度为250 μ g/mL，在37°C的5% CO2培养箱中维持筛选，每3 5天更换上述培养基；(e)将步骤(d)筛选所得的阳性细胞株利用免疫细胞荧光、WesternBlot方法、免疫细胞化学法检测ER α 36的表达；其检测结果为与PC12细胞株相比，阳性细胞株中有98%以上的细胞表达绿色荧光蛋白，阳性细胞株中ERa 36的表达量为PC12细胞的47%。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(a)所述的构建方法包括如下步骤(f)取SEQID NO :1和SEQ ID NO :2两条单链DNA模板等浓度混勻后，经95°C加热 lOmin，室温静置lh，稀释至终浓度lOng/ul ；(g)用T4DNA连接酶将步骤(f)所得产物与BamHI和HindIII酶切后的线性化载体 PRNAT-U6. Ι/Neo 在 22°C连接 2h ；(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E.coli DH5a后，经细胞培养、提取质粒、 测序鉴定结果如SEQ ID NO :3ο
3.如权利要求1或2所述的构建方法所获得的ERa36敲低PC12细胞株。
全文摘要
本发明公开了一种ERα36敲低PC12细胞株的建立方法。具体是通过应用shRNA技术，利用ERα36-shRNA转染PC12细胞，建立ERα36敲低PC12细胞株。应用免疫细胞荧光、免疫细胞化学和Western blot技术检测细胞株中ERα36，证明细胞株建立成功。并测定细胞生长曲线和倍增时间。ERα36敲低PC12细胞株的建立为研究ERα36在中枢神经系统中作用提供了有力的实验材料。
文档编号C12N15/63GK102533765SQ20111045685
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者徐祎慧, 邹伟, 马依妮 申请人:辽宁师范大学