专利名称：一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术中的人类干细胞分离领域，具体来说，涉及一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法。
背景技术：
现有技术中，用于人类血液细胞分离的方法包括免疫磁珠法、流式细胞仪法、血细胞分离机法和培养扩增法等方法。免疫磁珠法是将已知的抗体包被在磁珠微粒上，使磁珠微粒与人类血液混合。呈抗原抗体阳性的细胞粘附在磁珠上，通过一条磁性管道，磁珠被吸附在管壁上；其它没有结合磁珠的细胞都流走后，去除管道磁性，搜集所有含有磁珠的细胞。存在问题造价高，中低收入患者不适用。对细胞本身活性有损伤，影响细胞治疗疗效。流式细胞仪法的分选功能是由细胞分选器完成的。其过程是由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。存在问题，一台流式细胞仪造价300-500万元,标记用抗体1500-5000元一支,造价高,标记物有致癌性，应用于临床不安全，只能适用于科研。血细胞分离机法主要用于分离外周血，先给患者注射动员剂，然后使患者外周血经过血细胞分离机循环过滤，得到一定范围直径的细胞，用于细胞治疗。存在问题打动员剂增加治疗负担，分离后细胞液体积过大，患者承担一定的生命危险。培养扩增法是在采集人类血液后，加入试剂置于培养箱扩增，I周后清洗使用。存在问题污染率高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，时间长。现有技术中，已经公开的涉及骨髓和血液分离专利文献包括申请号200510130326. 7，名称一种分离细胞的方法及专用细胞分离液。该分离细胞的方法缺点上述方法针对鸡，牛，人血液需要做各种调整，准确度堪忧，由于添加了表面活性剂，分离出的细胞未知，只能用于简单的细胞试验使用。申请号200610035900. 5，名称一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法。 该干细胞分离液和干细胞分离的方法的缺点需要配制工作液，需要调节密度，只能搜集密度在1.083g/ml范围内的细胞，即搜集到的细胞较杂，而可用于治疗所需要的目标细胞数量少，并且对于脐带血来说，使用该方法去除红细胞不净，最终临床应用的时候会导致患者产生排异反应。申请号200610114475. 9名称用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。使用该试剂盒的缺点使用该试剂盒直接分离血液中的干细胞，数量不足以临床治疗使用，所以该方法进行了细胞培养，培养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能用于临床治疗。
申请号200610106875. 5名称一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法。缺点此试剂盒及其应用方法所用的HIST0PAGUE1077为密度I. 077g/ml的淋巴细胞分离液， 经此分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞,这样导致细胞中能够用于治疗的干细胞占少数, 影响临床疗效。申请号200710137781. 9名称骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法。 缺点该试剂盒的使用中添加了 Lin抗体，导致成本大大提高，投入到临床使用后，给中低收入患者造成经济负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了 Lin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后会发生何种变化还是未知数。以上专利文献公开的试剂盒或其使用方法存在原料来源复杂，配制繁琐，对于分离哪种血液针对性不强(因为人类血和动物血细胞存在一定差异)，获得的分离液用与治疗难以控制等缺点。因此，以上仅适用于实验，现今临床治疗应用较多的提取干细胞得方法大致有3 种I :过筛方法，例如血细胞分离机，是将血液直接过筛，筛选细胞体积较大的细胞用于治疗，其中包含部分红细胞，部分干细胞，部分白细胞，部分淋巴细胞等，体积较大约在 50ml-150ml左右，直接注入人体治疗心脏无法承受；2 :标记法用抗体对所需要细胞进行标记，然后再洗脱标记物，用于治疗，对于未知的标记物致癌性有待研究；3 :负筛选，标记血液中所不被治疗需要的细胞，不需要清洗，保持细胞原始活性， 这种方法较好，治疗效果也很明显，但是对于细胞是否处于治疗最佳状态有待研究，因为众所周知，每种细胞存在于血液中都是平衡的，使用负筛选方法筛选出不用于治疗的细胞就打破了血液中各种细胞中的平衡，导致电位紊乱，并且分离过程中需要稀释液和离心作用， 细胞受挤压后再被吸取稀释，清洗，这样导致细胞功能下降，干细胞不是治疗中最良好的状态，治疗效果大打折扣，细胞数量活率也在急剧减少，导致采血量增大，给患者带来痛苦。现有技术中需要解决的技术问题是I.治疗成本高。完成细胞分离工作的仪器设备(如血细胞分离机及流式细胞仪) 价格昂贵，导致治疗成本升高，增加了患者的治疗费用，不利于项目的推广和普及。2.细胞活性低。免疫磁珠法和流式细胞仪法筛选出来的均是被标记了的细胞，这些分选方法均存在筛选细胞范围小、细胞负重后活性降低以及标记物留在人体内会变成什么还是未知等问题。3.细胞液体积大。使用血细胞分离机分离的一般为外周血，且需要采集前打2-7 天动员剂，将骨髓中干细胞动员到外周血里，经血细胞分离机分离后筛选出的细胞液体积较大，一般都超过50ml，且红细胞去除不干净。最后得到的细胞悬液体积大、质量不佳，只能用于自体皮下注射。4.获取细胞时间过长。培养扩增一周后才能用于临床治疗，时间过长会延误治疗的最佳时机，影响治疗效果，培养期间造成污染率提高。5.传统的分离方法仅限于实验室及科研使用。许多分离方法操作过程繁琐，对人员的专业要求较高，既费时又费力。从实验方法到临床应用还需要技术改进。不能产业化。 实验成本高、操作环节中污染机率大、细胞液的保存运输条件不备，导致提取的细胞液数量有限，满足不了临床治疗的大量需求。申请号200910187212. 4、名称为“人类骨髓、脐带血、外周血细胞处理试剂盒及细胞处理方法”是本申请人之前提出的一篇专利申请。该申请中提到了利用O. 9%的Nacl注射液或PBS液作为稀释剂、6%羟乙基淀粉或O. 2-1 %甲基纤维素作为沉淀剂、由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为I. 075+0. 001作分层液。本申请的主要优点是能够安全有效快捷的分理出适合临床使用的干细胞。但是本发明尚存的缺陷是分离出的干细胞混有一定量纤维蛋白，干细胞的数量在临床治疗中有所不足，并且由于缺乏进入人体治疗中辅助的氨基酸和肽，因此后期营养供给不足，不能在进入人体后发挥最大的治疗作用。此外，脑蛋白水解物为猪脑组织经过酶解再提取分离出的无菌制剂，含有大量的人体所需的氨基酸和肽。目前脑蛋白水解物的应用主要是作为一种药物直接用于患者。其治疗的领域有1血管性痴呆(如多发梗塞性痴呆等)和中风后的认知功能障碍。2混合性痴呆。3颅脑手术后脑功能障碍。4脑挫伤或脑震荡后遗症等。迄今为止，还没有公开脑蛋白水解物用于干细胞提取的技术方案。
发明内容
为了克服现有技术中目标干细胞的回收数量不够高、并且存活率不够理想的缺陷，本发明提供了一种人类骨髓、脐带血或外周血中干细胞样本密度分离液及使用它分离人类骨髓干细胞、脐带血干细胞或外周血干细胞的方法。本发明提高了人类骨髓、脐带血或外周血中干细胞的分离数量和回收率。为实现本发明的目的，发明人设计了多种方案，在进行了大量的试验和对试验数据进行统计和分析后，惊奇的发现在分离干细胞的过程中，加入适量脑蛋白水解物有助于提高目标干细胞的回收数量，而对目标干细胞的存活率不产生不利影响。本发明之一的人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液是这样实现的所述的干细胞样本密度分离液分别由I号液、2号液和3号液组成，按照重量百分比计，其各自组份的含量为I号液为稀释剂，选自下列水溶液之一 0. 1-30%氯化钠注射液和O. 1-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液、或者O. 1-30%的pH为7-7. 5的磷酸盐缓冲液和O. 1% -20%的脑蛋白水解物组成的水溶液；2号液为沉淀剂，选自O. 1-30%羟乙基淀粉水溶液或O. 1_30%甲基纤维素水溶液；3号液为分层液，其为密度为I. 0-1. 2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。在实施中，所述的脑蛋白水解物为选自下列产品之一国药准字H20052182国药准字 H20003386、国药准字 H20003384 或国药准字 H20003385 ；所述的脑蛋白水解物的组分含量优选为O. 3-20% ；所述的水溶液的水为灭菌注射用水。更具体地说，所述I号液的氯化钠注射液组分含量可以为O. 3-12%、优选O. 5_2%、更优选为
O.9% ；
所述I号液的的磷酸盐缓冲液的pH可以为7. 1-7. 4优选7. 2-7. 4、更优选为7. 4 ；所述的的脑蛋白水解物组分含量可以为O. 8-15 %、优选I. 5-4. 5 %、更优选为 3 % ；所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为O. 5-18%、优选I. 5_12%、更优选为6% ；所述2号液的甲基纤维素组分含量为O. 2-8%、优选O. 3_5%、更优选为O. 5% ；所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为I. 01-1. 088g/ml、优选I. 035-1. 08g/ml、 更优选为1.075g/ml。在具体实施中，所述的I号液在超滤条件下除菌，2 3号液可以在100_130°C、优选105_120°C的温度下，灭菌10-50、优选15-20分钟。本发明之二是使用上述的干细胞样本密度分离液提取人类骨髓、脐带血或外周血分离干细胞的分离方法，所述的方法包括如下包括(I)将采集、抗凝后的骨髓、脐带血或外周血样品加入到含有I号液稀释剂的大容量培养液瓶中，得到稀释样品；(2)在步骤(I)的稀释样品中加入2号液沉淀剂混匀，静置，待分层后吸取上层细胞液离心浓缩后得到浓缩样品；(3)将步骤⑵的浓缩样品铺到3号液上层，然后离心分离，得到干细胞层。在具体实施中所述步骤(I)的骨髓、脐带血或外周血样品的采集、抗凝、稀释均需在无菌条件下完成，其采集、抗凝方法分别为骨髓血采集采用髂后上棘，局麻骨穿方法，使用采髓针采集骨髓，采集骨髓用的针管中先抽取1-1. 5ml枸橼酸钠抗凝液,再抽取骨髓与枸橼酸钠抗凝液合计为5ml,依次方法采集，收集采集的骨髓注入无菌瓶中，得到骨髓血预处理样品；脐带血的采集在产妇胎盘脱落后，使用单包含枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将其采血袋上的针头插入脐静脉中，一边采集一边轻轻晃动采血袋，使抗凝液与脐带血充分结合， 得到脐带血预处理样品；外周血采集对被采血者手臂进行消毒，使用含有枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将采血袋上的针头插入手臂静脉采集过程中慢慢摇动采血袋，使抗凝液与外周血充分结合，得到外周血预处理样品；在所述步骤(I)中，经采集、抗凝后的骨髓血、脐带血或外周血预处理样品与I号液的体积比为I : 1，得到稀释样品；在所述的步骤(2)中，稀释样品与2号液的体积比为2 1，再经过摇匀1-8分钟， 放置3分钟-3小时，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以500-4000转/分钟离心1-20分钟，搜集下层细胞液，得到浓缩样品；将步骤(3)得到浓缩样品用生理盐水稀释后铺在号液3液上，以500-4000转/分钟离心1-60分钟，收集存在于整个离心管中间位置的约2-4_厚的油状干细胞层；将收集的干细胞层用生理盐水清洗1-5次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即可。本发明与现有技术相比最突出的特点是在分离过程中加入含有大量氨基酸和肽的脑蛋白水解物。由于脑蛋白水解物填补了血液中被去除细胞后的平衡缺陷，及时给予干细胞所需营养，因此促进了干细胞的增殖和干细胞蛋白质的合成，改善了干细胞能量代谢。另外，脑蛋白水解物还能分解干细胞在分离过程中产生的纤维蛋白颗粒，避免了在干细胞治疗过程中形成血栓的问题，杜绝了干细胞在分离过程中由于受到挤压，外界刺激等因素造成的干细胞质量下降现象。在本发明的多次试验、研制过程中，发明人观察到 在干细胞分离试验中，由于分离细胞过程中的离心作用和低温条件，会出现纤维蛋白，并且这些纤维蛋白会形成肉眼可见颗粒。如果这些颗粒混在治疗用的干细胞中，会导致稍细血管堵塞，使血液流通不顺畅，使干细胞不能快速作用到病灶部位进行恢复治疗。而采用本发明的方法加入脑蛋白水解物后，就不再会出现肉眼可见纤维蛋白颗粒，提高临床治疗安全性和有效性。综上所述，本发明的突出优点是I、本发明通过脑蛋白水解物提高了干细胞分离回收数量。2、本发明保留了原有干细胞活性，干细胞液体积小，干细胞种类齐全，分离操作时间短，仅I小时左右即可完成。3、本发明特别适用于分离人类骨髓、脐带血或外周血，针对性强。4、本发明安全性高，产品内毒素均符合临床使用要求，制备过程对环境及干细胞本身不会造成任何污染。5、本发明原料简单易得，造价低，可操作性强、试剂盒易于存储运输、可产业化生产。因此本发明是临床上迫切需要的一种分离人类骨髓、脐带血或外周血干细胞的分离液及分离方法。
图I是使用本发明的试剂盒分离人类骨髓得到的干细胞的显微照片；图2是使用本发明的试剂盒分离人类脐带血得到的干细胞的显微照片；图3是使用本发明的试剂盒分离人类外周血得到的干细胞的显微照片。
具体实施例方式干细胞样本密度分离液制备实施例1-14本发明的干细胞样本密度分离液的具体制备方法是I号液500ml :0. 1-30%氯化钠注射液或pH7_7. 5的磷酸盐缓冲液(PBS)液，分别加入O. 1-20%的脑蛋白水解物(本实施例中所用的脑蛋白水解物均为海南通用同盟药业有限公司生产的注射用脑蛋白水解物)。其中，磷酸盐缓冲液的配方为(以总体积500ml为例)氯化钠4g，氯化钾O. Ig, 12水磷酸氢二钠I. 445g，磷酸二氢钾O. Ig ;先用少量水溶解上述试剂，然后加水至500ml，即得，用前用5. 6%碳酸钠调节pH至7-7. 5。2号液150ml :选用浓度为O. 1_30%的羟乙基淀粉水溶液或浓度为O. 1_30%的甲基纤维素水溶液。3号液80ml :由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为I. 0-1. 2g/ml的分层液组成，配有500ml大容量培养液瓶，免除临床现有少量多次分离干细胞的繁琐过程，大大降低了污染机率。其中，上述I号液在超滤条件下除菌，2号液经过100°C -130°C, 10分钟-50分钟灭菌，检测1-2号液内毒素含量彡O. 5EU/ml，装瓶。上述3号液经过100°C -130°C, 10分钟-50分钟灭菌，检测其内毒素含量彡IEU/ ml,装瓶。实施例1-14的具体数据请见表I。表I制备实施例1-14的一览表
权利要求
1.一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞样本密度分离液，其特征在于所述的干细胞样本密度分离液分别由I号液、2号液和3号液组成，按照重量百分比计， 其各自组份的含量为I号液为稀释剂，选自下列水溶液之一 0. 1-30%氯化钠注射液和O. 1-20%的脑蛋白水解物组成的水溶液、或者O. 1-30%的pH为7-7. 5的磷酸盐缓冲液和O. 1_20%的脑蛋白水解物组成的水溶液；2号液为沉淀剂，选自O. 1-30%羟乙基淀粉水溶液或O. 1-30%甲基纤维素水溶液；3号液为分层液，其为密度为I. 0-1. 2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。
2.根据权利要求I所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于所述的脑蛋白水解物为选自下列产品之一国药准字H20052182、国药准字 H20003386、国药准字 H20003384 或国药准字 H20003385 ；所述的脑蛋白水解物的组分含量为O. 3-15% ；所述的水溶液的水为灭菌注射用水。
3.根据权利要求2所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于所述I号液的氯化钠注射液组分含量为O. 3-12%或磷酸盐缓冲液的pH为7. 1-7. 4，其中的脑蛋白水解物组分含量为O. 8-6% ；所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为O. 5-18%或甲基纤维素组分含量为O. 2-8% ； 所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为I. 01-1. 088g/ml。
4.根据权利要求2所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于所述I号液的氯化钠注射液组分含量为O. 5-2%或磷酸盐缓冲液的pH为7. 2-7. 4，其中的脑蛋白水解物组分含量为I. 5-4. 5% ；所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为I. 5-12%或甲基纤维素组分含量为O. 3-5% ； 所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为I. 035-1. 08g/ml。
5.根据权利要求2所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于所述I号液的氯化钠注射液组分含量为O. 9%或磷酸盐缓冲液的pH为7. 4，其中的脑蛋白水解物组分含量为3% ；，所述2号液的羟乙基淀粉组分含量为6%或甲基纤维素组分含量为O. 5% ；所述3号液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为I. 075g/ml。
6.根据权利要求I至5之一的干细胞样本密度分离液，其特征在于所述的I号液在超滤条件下除菌，2 3号液在100°C _130°C的温度下，灭菌10-50分钟。
7.根据权利要求6所述的干细胞样本密度分离液，其特征在于所述的2 3号液在105°C _120°C的温度下，灭菌15-20分钟。
8.根据权利要求I 7之一的干细胞样本密度分离液分离干细胞的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤(1)将采集、抗凝后的骨髓、脐带血或外周血样品加入到含有I号液稀释剂的大容量培养液瓶中，得到稀释样品；(2)在步骤(I)的稀释样品中加入2号液沉淀剂混匀，静置，待分层后吸取上层细胞液离心浓缩后得到浓缩样品；(3)将步骤(2)的浓缩样品铺到3号液上层，然后离心分离，得到干细胞层。
9.根据权利要求8所述的分离干细胞的方法，其特征在于所述步骤(I)的骨髓、脐带血或外周血样品的采集、抗凝、稀释均需在无菌条件下完成，其采集、抗凝方法分别为骨髓血采集采用髂后上棘，局麻骨穿方法，使用采髓针采集骨髓，采集骨髓用的针管中先抽取1-1. 5ml枸橼酸钠抗凝液，再抽取骨髓与枸橼酸钠抗凝液合计为5ml，依次方法采集，收集采集的骨髓注入无菌瓶中，得到骨髓血预处理样品；脐带血的采集在产妇胎盘脱落后，使用单包含枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将其采血袋上的针头插入脐静脉中，一边采集一边轻轻晃动采血袋，使抗凝液与脐带血充分结合，得到脐带血预处理样品；外周血采集对被采血者手臂进行消毒，使用含有枸橼酸钠抗凝液的采血袋，将采血袋上的针头插入手臂静脉采集过程中慢慢摇动采血袋，使抗凝液与外周血充分结合，得到外周血预处理样品。
10.根据权利要求9所述的分离干细胞的方法，其特征在于(1)在所述步骤(I)中，经采集、抗凝后的骨髓血、脐带血或外周血预处理样品与I号液的体积比为I : 1，得到稀释样品；(2)在所述的步骤(2)中，稀释样品与2号液的体积比为2 1，再经过摇匀1-8分钟， 放置3分钟-3小时，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以500-4000转/分钟离心1-20分钟，搜集下层细胞液，得到浓缩样品；(3)将步骤(2)得到浓缩样品用生理盐水稀释后铺在3号液上，以500-4000转/分钟离心1-60分钟，收集存在于整个离心管中间位置的约2-4_厚的油状干细胞层；(4)将收集的干细胞层用生理盐水清洗1-5次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即可。
全文摘要
本发明为一种人类骨髓、脐带血或外周血中干细胞样本密度分离液及干细胞分离方法。所述试剂由1号液、2号液和3号液组成。本发明在1号液中加入了脑蛋白水解物，有效提高了处理样品的干细胞回收数量。使用本发明的干细胞样本密度分离液，目标干细胞分离回收率提高了约20～30％，可以有效节约人类骨髓、脐带血或外周血样品，在保持高存活率的基础上，大大地提高了干细胞的分离数量和回收率使用效率，在应用干细胞临床治疗中是一个前所未有的突破。
文档编号C12N5/0789GK102604892SQ20121001798
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月19日 优先权日2011年1月21日
发明者唐明淇 申请人:唐明淇