利用热激和四环素调控的ntCre/LoxP删除系统、重组表达载体及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：利用热激和四环素调控的ntCre/LoxP删除系统、重组表达载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及利用热激和四环素调控的ntCre/LoxP删除系统和应用，还涉及含有ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体及其制备方法和应用。
背景技术：
在获得转基因中，往往需要转入目的基因，同时为了能将转基因细胞和非转基因细胞分开，还需要引入选择标记基因，选择标记基因一般为抗性基因。一方面，引入的抗性基因会因为基因漂移而带来基因污染，例如形成超级杂草；另一方面，人们担心转基因食品中的抗性基因会影响人类的健康，因此删除转基因植物中的靶基因，特别是抗性基因成为转基因植物研究的热点。目前主要采用基因删除系统删除转基因植物中的靶基因，主要有Cre/loxP、FLP/ FRT、R/RS等位点特异重组系统和转座子删除系统，使用这些删除系统删除抗性基因存在周期长，工作量大，可控性差等问题。大肠杆菌TnlO转座子中的四环素调控系统能够通过四环素调控基因的表达，目前已有将四环素调控系统用于调控真核基因的表达，因此可以应用于调控基因删除系统，但是该系统用于调控真核表达存在表达严密性和适应性问题。植物热激启动子HSP为诱导型启动子，在热激条件下能被激活。拟南芥的热激启动子HSP18. 2 能够通过控制温度控制下游基因的表达，但是多数热激启动子存在泄漏问题，同时对应用环境要求高，因此用于控制基因删除系统并不理想。理想的删除系统不仅需要具有删除周期短，工作量小，操作简单等特点，还需要具有可控性好，精确度高等优点。

发明内容
本发明目的之一在于提供热激和四环素双重调控系统，通过温度和四环素来调控 ntCre重组酶基因表达，表达的ntCre重组酶能够特异识别LoxP位点，从而删除LoxP位点之间核酸序列，具有删除周期短、能够大大减少了工作量、可控性好等优点。为了实现上述目的，技术方案为利用热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP删除系统，所述ntCre/LoxP删除系统包括ntCre重组酶特异识别的2个LoxP位点和位于2个LoxP位点之间的靶基因部分，所述2个LoxP位点分别为位于靶基因3’端的第一 LoxP位点和位于靶基因5’端的第二 LoxP 位点；还包括HSF70m启动子调控的Iihsf基因表达盒和0m35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分，所述0m35S启动子由Iihsf基因调控，所述HSF70m启动子核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述Misf基因核酸序列如SEQ ID N0. 24所示，所述0m35S启动子核酸序列如SEQ ID N0. 8所示，所述LoxP位点核酸序列如SEQ ID N0. 25所示，所述ntCre重组酶基因核酸序列如SEQID N0. 26所示。进一步，所述ntCre/LoxP删除系统是所述第一 LoxP位点，靶基因，0m35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒，HSF70m启动子调控的Iihsf基因表达盒和第二 LoxP位点顺序串联。进一步，所述靶基因为抗性标记基因。本发明目的之二在于提供含ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体，技术方案为含有所述ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体。本发明目的之三在于提供重组表达载体的制备方法，技术方案为重组表达载体的制备方法，具体步骤如下将含有HSF70m启动子调控的Iihsf基因表达盒和0m35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分连入pVCT2231载体的酶切位点处；所述pVCT2231载体由pCAMBIA1320载体、pVCT1191载体和pBIN19载体制备，具体步骤为从PVCT1191载体中克隆npt nm基因，并在npt nm基因3 ’端加上LoxP位点，获得 npt II m-LoxP组件，然后将npt II m_LoxP组件替换pCAMBIA1302载体上的潮霉素抗性基因hptll，并将含LoxP位点的序列反向插入pCAMBIA1302载体，替换pCAMBIA1302载体的 35S启动子和mGFP5基因编码区；同时从pBIN19载体中克隆Pnos启动子，替换pCAMBIA1302 载体上调控hptll基因的2X35S启动子，即得pVCT2231载体；所述pVCT1191载体由pCR2. 1-T0P0载体改造而来，具体为，删除pCR2. 1-T0P0载体上氨苄抗性基因并自环化连接构建的载体，即PVCT1191载体。进一步，所述pVCT2231载体制备具体步骤为(1)将所得npt II m-LoxP基因连入pMD18_T载体中，得pVCT1202载体，并用Mil 和B10I双酶切所得的pVCT1202载体，琼脂糖凝胶电泳并回收nptllm-LoxP组件，将回收的 npt II m-LoxP组件连入pCAMBIA1302载体的2个XhoI酶切位点之间，得pVCT2071载体；(2)克隆的所述Pnos启动子，用Ml I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收，将所得的Pnos启动子连入所得pVCT2071载体的Bio I和EcoR I酶切位点之间，得pVCT2072 载体；(3)用NotI酶切所得pVCT1202载体，用Klenow Fragment酶补为平末端，再用)CbaI酶切，回收含LoxP位点的pVCT1202载体片段，同时用PmaCI和)(baI酶切所得 PVCT2072载体，回收含npt II m基因的pVCT2072载体片段，将回收的pVCT1202载体片段与pVCT2072载体片段连接，得pVCT2231载体。进一步，所述npt II m-LoxP组件的制备，具体步骤为(1)以所得pVCT1191载体为模板，上游引物如SEQ ID N0. 19所示核酸序列，下游引物如SEQ ID N0. 20所示核酸序列，进行PCR扩增，PCR反应条件为95°C预变性2分钟， 95 0C变性10秒，52 0C退火20秒，72 °C延伸1分钟20秒，3个循环，再经95 °C变性10秒，60 V 退火20秒，72°C延伸1分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟，得nptnm基因；(2)以所得nptnm基因为模板，上游引物如SEQ ID N0. 19所示核酸序列，下游引物如SEQ ID N0. 21所示核酸序列，进行PCR扩增，PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C 变性10秒，46°C退火20秒，72°C延伸1分钟20秒，3个循环，再经95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸1分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟，得npt I Im-LoxP组件。进一步，所述Pnos启动子制备方法，具体步骤为以PBIN19载体为模板，上游引物为如SEQ ID N0. 22核酸序列，下游引物如SEQ ID N0. 23核酸序列，进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3分钟，94°C变性20秒，57°C退火20秒，72°C延伸1分钟30秒，35个循环，最后72°C延伸10分钟，得Pnos启动子。本发明目的之四在于提供ntCre/LoxP删除系统在植物转基因中的应用，技术方案为所述ntCre/LoxP删除系统在植物转基因中的应用。本发明目的之五在于提供重组表达载体在植物转基因中的应用，技术方案为所述重组表达载体在植物转基因中的应用。本发明有益效果在于本发明公开了利用热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP 删除系统，能够在温度和四环素调控下精确删除LoxP位点之间的核酸序列，删除周期短， 能够在10周内彻底删除LoxP位点之间的核酸序列；便于控制，可以直接在不含四环素的培养基上调节温度就能成功的删除；并且同时利用热激启动子和四环素操纵子双重调控， 克服了热激启动子表达泄露的缺点和温度意外升高导致的实验失败，使用改造后的四环素操纵子克服了四环素操纵子在真核生物中表达严密性和适应性的缺陷；本发明还公开了 ntCre/LoxP删除系统的重组载体及其制备方法，制备方法简单，制得的重组载体使用方便， 可以使用农杆菌介导，转化不同的植物，为植物转基因提供了删除靶基因的有利工具，特别是删除抗性基因。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1 pVCT2027载体构过程图；图2热激启动子HSF70m在功能验证图(分别为在4°C、20°C、25°C、30°C、35°C、 40°C、40°C处理12小时，再用⑶S染液染色)；图3 HSF70m调控的Iihsf基因表达盒构建过程图；图4热激和四环素双重调控系统的构建过程图；图5热激和四环素双重控制系统功能验证图(A-G，在MS培养基上，分别在5°C、 20°C、25°C、28°C、30°C、35°C、4(rC条件下处理12小时，H为在含有1. Omg/L四环素的MS培养基上，35°C条件下处理12小时)；图6热激和四环素双重控制系统调控效率验证图(A-E依次为在35°C条件下处理 1小时、2小时、3小时、4小时、5小时，再用GUS染液染色)图7 pVCT2117载体构建过程图；图8 pVCT2219载体构建过程图；图9 pVCT2072载体构建过程图；图10 pVCT2262载体构建过程图；图11烟草中ntCre/LoxP删除系统验证图(图A为只含150mg/L卡那霉素的培养基上培养，图B为在含有lmg/L四环素和150mg/L卡那霉素的培养基培养，在35°C条件下处理10周，图C和D为转基因烟草删除后35°C条件下恢复10周)。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、热激启动子HSP70m的构建根据报道的拟南芥(Arabidopsis thaliana)热激蛋白基因AtHSP70b (GenBank登录号AC010924)，对AtHsp70b基因的启动子序列进行分析，分析发现AtHsp70b存在2个结构上的问题(l)AtHsp70b中有一个生长素反应元件(AuxRE)，序列为TGTCTC，还有一个脱落酸(ABA)反应元件(ABRE)的核心序列ACGT，因此在AtHsp70b:⑶S导入烟草后，在常温下有表达泄漏；O)AtHsp70b中有一个热激元件(HSF)，但热激元件的结构不完善。因此对 AtHSP70b基因进行改进，构建含有两个标准热激元件(HSE)，两个HSE之间含有59bp的序列，同时去除了 AtHSP70b上的AuxRE元件和ABRE元件，并将AtHSP70b中结构不完善的热激元件改造成nnGAAnnTTCnnGAAnn结构的HSE，并与35S启动子的核心序列，构建为AtHSP70b 改造的热激启动子，命名为HSP70m启动子，序列为5，-ggactgcaggtcgacgatttatatcccggt cggt gaatcttccagaactttc ttgtactttcgcgattactccacctttgcacaatcccctgggttgtgccacgaccttt t ttctcgaaatttctcgaaitRcatRacccttcctctatataaRRaaRttcatttcatttRRaRaRaacacRRRRRactcta 臓-3，(SEQ ID NO. 1)，划单线处分别为I^st I和Xba I位点，划双线处为标准热激元件， 加粗tatata为35S启动子的TATA盒。用EcoRI和HindIII双酶切pUC18载体和pBI121载体，回收pUC18载体2635bp 片段，得pUC18载体酶切片段，回收PBI121载体的含β -葡萄糖苷酸酶基因GUS的表达盒， 得ρΒΙ121载体酶切片段，将pUC18载体酶切片段与Gus的表达盒用Τ4 DNA连接酶连接，反应条件为16°C过夜，得pVCT2006载体。用)(ba I和I^st I酶切pVCT2006载体，琼脂糖凝胶电泳，回收4810bp的pVCT2006载体骨架，同时人工合成如SEQ ID NO. 1所示序列的HSP70m 启动子双链DNA，并用)(ba I和I3St I酶切HSP70m启动子，回收180bp的HSP70m启动子，将 PVCT2006载体骨架与HSP70m启动子用"Γ4 DNA连接酶于16°C连接过夜，得pVCT2027载体， 如图1所示。PVCT2027载体测序结果表明在pVCT2027载体中⑶S基因的表达由HSP70m启动表达，Tnos终止子终止表达，并将⑶S表达盒命名为HSP70m:⑶S。根据报道的pBmi9载体序列(GenBank accession U09365)，设计含Pnos启动子和nptll编码区(简称Pnos: :nptll基因)的特异引物，上游引物序列为5，-G^aattcaggg agtcacgttatgac-3，(SEQ ID NO. 2)，下划线为EcoR I酶切位点，下游弓I物序列为5’ -cgctcg agtcccgctcagaagaac-3' (SEQ ID NO. 3)，划线处为 Xho I 酶切位点，使用 Prin^tar HS DNA 聚合酶，进行PCR扩增，PCR反应条件95°C变性2分钟，1个循环；95°C变性10秒，退火 20秒，72°C延伸1分10秒，30个循环；72°C延伸10分钟。经琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，回收片段经EcoR I和Xho I酶切后，回收1107bp的Pnos::nptII基因；同时用EcoR I和Xho I酶消化pCAMBIA1302载体，回收842^3ρ的pCAMBIA1302载体骨架；连接Pnos: :nptll基因和PCAMBIA1302载体骨架，得pVCT2020载体。用EcoR I和Hind III酶切所得pVCT2020 载体多克隆酶切位点处，回收9481bp的pVCT2020载体骨架，同时用EcoR I和Hind III酶切载体PVCT2027，回收2363bp的⑶S表达盒，将回收的⑶S表达盒与pVCT2020载体骨架用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，即将⑶S表达盒插入pVCT2020载体的多克隆位点处，得 PVCT2028 载体。将pVCT2(^8载体采用冻融法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，得含pVCT2(^8
7载体的EHA105，将含pVCT2(^8载体的EHA105叶盘法转化烟草，在含2. 5mg/L 6-BA和 150mg/L卡那霉素在MS培养基上进行抗性筛选，得抗卡那霉素的转基因烟草。用打孔机将转基因烟草叶片打取直径约Icm大小的圆片，分别置于MS固体培养基上，将放有烟草叶片的培养基平均分成6个小组，分别在4°C、20°C、25°C、30°C、35°C、4(TC的条件下处理12小时。处理后的叶片用GUS染液进行染色检测GUS酶活性，结果如图2所示。结果表明在30°C 组和35°C组在处理后能被GUS染液染成蓝色，而其他组不能被GUS染液染成蓝色，表明热激启动子HSF70m在30 35 °C启动能力强烈，热激启动子HSF70m在低于25 °C时不能诱导 ⑶S基因表达，在温度高于40°C时也不能诱导⑶S基因表达。实施例2、构建HSF70m启动子调控Iihsf基因的表达盒根据报道的四环素阻遏蛋白基因(TetR)序列(GenBank accessionNo. J01830)， 设计引物，上游引物为 5，-cctaggaattaatgatgtctagattag-3，(SEQ ID NO. 4)，划线处为内切酶 Avr II 识别位点，下游引物为:5，-ggatccactttcacatttaagttg-3，(SEQ ID NO. 5), 划线处为内切酶BamH I识别位点，以大肠杆菌XLl-blue为模板，用高保真进行PCR扩增， PCR反应条件为98°C预变性1分钟；98°C变性10秒，50°C退火15秒，72°C延伸1分钟，3个循环；98°C变性10秒，55°C退火15秒，72°C延伸1分钟，27个循环，72°C延伸10分钟。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收的TetR基因片段，回收片段加A后与pMD18_T载体 (Sangon，上海)连接，连接反应用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，得pVCT1147载体，如图3 所示。由于在设计引物时不含TetR基因3’端的taa终止密码子，因此PCR扩增所得TetR 基因3’端不含taa终止密码子，即不含终止密码子的TetR基因。根据报道的拟南芥Columbia生态型的热激转录因子基因，即HSFl基因(GenBank accession No. NC_003075),设计弓 |物，上游弓 |物为 5‘ -agatctcagcaattatctcagggtcaagg-3 ，(SEQ IDN0. 6)，划线处为内切酶Bgl II识别位点，下游引物为S'-gagctctagtgttctgtttc tgatgtgag-3' (SEQID NO. 7)，划线处为内切酶Sac I识别位点，以拟南芥Columbia基因组 DNA为模板，用高保真进行PCR扩增，PCR反应条件为98°C预变性Imin ；98°C变性10s，50°C 退火15s，72°C延伸1. 5min, 3个循环；98°C变性10s, 55°C退火15s，72°C延伸lmin, 27个循环，72°C延伸IOmin PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收l(^8bp的HSFl基因片段，回收片段加A后与pMDIS-T载体连接，连接反应用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，得pVCT1148载体，如图3所示。由于在设计HSFl基因扩增引物时不包含5，端DNA结合域(DNA Binding domain)，因此扩增所得HSFl基因不含有5，端DNA结合域。用BamH I和Mc I酶切所得pVCT1147载体，琼脂糖凝胶电泳，回收3302bp的 PVCT1147载体骨架；同时用Bgl II和Mc I酶切pVCT1148载体，琼脂糖凝胶电泳，回收 1026bp的HSFl基因片段；将回收的PVCT1147载体骨架和HSFl基因片段连接，连接反应用 T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，得pVCT1150载体，如图3所示。连接过程中TetR基因片段连入HSFl基因5，端构成嵌合基因，即形成由TetR负调控HSFl基因的转录激活因子，并命名为Rhsf，核酸序列如SEQ ID N0. 24所示。用)(ba I和Me I酶切所得pVCT2027载体，琼脂糖凝胶电泳，切去⑶S基因编码区，回收含HSF70m启动子的pVCT2027载体骨架；同时用Avr II和&ic I酶切所得pVCT1150 载体，琼脂糖凝胶电泳，回收1647bp的Iihsf片段；将回收的pVCT2027载体与Iihsf基因用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，即用Iihsf基因替换pVCT2027载体上的Gus基因，得pVCT2033载体，如图3所示。所得pVCT2033载体中Iihsf基因由HSF70m启动子调控表达，终止子为 iTnos,将此结构为HSF70m: :Rhsf: :Tnos，命名为HSF70m调控的Rhsf基因表达盒。实施例3、热激和四环素双重调控系统的建立用Ml I和)(ba I酶切所得pVCT2027载体，琼脂糖凝胶电泳，弃HSF70m启动子，回收4820bp的pVCT2027载体骨架；同时根据四环素操纵子(TetO)中四环素阻遏蛋白(TetR)结合区(简称为Tet02-Tet01)，将Tet02_Tet01替换HSF70m启动子的2个HSE标准热激元件，然后与35S微启动子连接构成0m35S启动子，序列为 5，-agKtcgacgattcccggtCggt actctatcattgatagagttaactccctatcagtgatagagai ttgtacctttgcgcgat
tactccacctttgcacaatcccctgggttgtgccacgacctttt:i￡l￡lal￡aflgaia￡a^iM￡l￡￡￡lal￡ail￡aia￡Ma
tgcatgacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggactctagagg-3， (SEQ ID NO. 8)划单线处分别为Ml I和)(ba I位点，划双线处为四环素操纵子序列，tatata为TATA 盒。人工合成(SEQ ID NO. 8)所示0m35S启动子双链核苷酸，并用Ml I和)(ba I进行双酶切，回收0m35S启动子，将回收的0m35S启动子与所得的pVCT2027载体骨架用T4 DNA连接酶在16 °C连接过夜，即用0m35S启动子替换pVCT2027载体上的HSF70m启动子，得pVCT2034 载体,如图4所示。pVCT2034载体中0m35S启动子由于含有jTetC^-iTetOl,因此Rhsf表达的蛋白质能够与0m35S启动子结合，在不含有四环素条件下，能够启动0m35S启动子调控的基因表达。用EcoR I和Hind III酶切所得pVCT2034载体，琼脂糖凝胶电泳，回收M08bp的 0m35S启动子调控的⑶S基因表达盒；将回收的⑶S基因表达盒与实施例1中回收的带EcoR I和Hind III酶切位点的PVCT2020载体骨架连接，连接条件为用T4 DNA连接酶在16°C连接过夜，即用⑶S基因表达盒插入pVCT2034载体的多克隆酶切位点处，得PVCT2035载体， 如图4所示。用Ml I和PmaC I酶切所得pVCT2035载体，琼脂糖凝胶电泳，弃35S启动子和 mGFP5基因编码区，回收10358bp的含0m35S启动子调控的⑶S基因表达盒的pVCT2035载体骨架；同时用Ml I和Me I的同裂酶Ecll36 II酶切PVCT2033载体，琼脂糖凝胶电泳， 回收M08bp的HSP70m启动子和Iihsf基因片段，命名为HSP70m: :Rhsf ；将回收的pVCT2035 载体骨架与HSP70m: Ahsf片段连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，即将 HSP70m启动子和Rhsf基因替换pVCT2035载体上的35S启动子和mGFP5基因，得pVCT2041 载体，如图4所示。所得pVCT2041载体中⑶S基因由0m35S启动子调控表达，还含有HSP70m 启动子调控的Misf基因表达盒。至此，热激和四环素双重控制系统构建成功。将pVCT2041载体采用冻融法转化转化根癌杆菌EHA105感受态细胞，得含 PVCT2041载体的EHA105。将烟草将含pVCT2041载体的EHA105菌液侵染叶盘法转化烟草， 在含1. Omg/L四环素、150mg/L卡那霉素、2mg/L 6-BA的MS培养基固体培养基上进行抗性筛选，得抗卡那霉素的转基因烟草。用打孔机将转基因烟草叶片打取直径约Icm的圆片， 分别置于MS培养基上，将放有烟草叶片的培养基平均分成7个组，分别在5°C、20°C、25°C、 观°C、30°C、35°C、40V条件下处理12小时。并以放置在含1. Omg/L四环素的MS培养基35°C 处理12小时为对照，将处理后的叶片用GUS染液进行染色检测GUS酶活性，结果显示5°C、 20°C和25°C处理后不能检测到⑶S活性，而在^°C、30°C、35°C和40°C处理能检测到了⑶S 酶活性，对照组也不能检测到GUS酶活性，结果如图5所示。结果表明在温度为条件下，在不含四环素的培养中GUS基因被成功诱导表达，在含有四环素的培养基中不能被诱导表达。取转基因烟草叶片，用在35°C条件下处理12小时，再用打孔机将转基因烟草叶片打取直径约Icm的圆片，置于不含1. Omg/L四环素MS培养基上，在35°C条件下分别处理1 小时、2小时、3小时、4小时、5小时，处理后的叶片用GUS染液进行染色检测GUS酶活性，处理1小时、2小时、3小时均能检测到GUS酶活性，处理4小时、5小时不能检测到GUS酶活性，结果如图6所示。结果表明，在HSF70m热激启动在温度下在4小时内能够诱导 ⑶S基因的表达，其原因是四环素阻遏蛋白转录因子融合基因Misf表达，融合基因Misf中的TetR基因与0m35S启动子结合，诱导⑶S基因的表达，因此能够检测到⑶S酶活性。在含有1. Omg/L四环素条件下，35°C诱导四环素阻遏蛋白转录因子融合基因Misf表达后与四环素结合并发生结构改变，而不能与0m35S启动子结合，因此不能诱导⑶S基因的表达，而不能检测到GUS酶活性。表明了热激启动子和四环素双重调控系统的灵敏性较高，能够将已激活的系统在4小时内完全关闭。实施例4、热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP删除系统的构建根据Pl噬菌体的Cre重组酶基因(GenBank accession X03453)序列，设计引物， 上游引物为5，-accatggccaatttactgaccgtacacc-3，(SEQ ID NO. 9)，划线处为 Nco I 位点；下游引物为 5，-gagctctaatcgccatcttccagca-3，(SEQ ID NO. 10)，划线处为 Sac I 位点。以大肠杆菌菌株BM25. 8(Clontech，美国)基因组DNA为模板，用I^rin^tar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)进行PCR扩增，反应条件为95°C预变性2分钟，95°C变性10秒，50°C 退火20秒，72 0C延伸1分钟10秒，3个循环，95 0C变性10秒，60 V退火20秒，72 °C延伸1分钟10秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收1040bp的 Cre重组酶基因，回收Cre基因加“A”尾后，连接pMD18_T载体，得pVCT1251载体，如图7所不。用Xba I和Nco I酶切所得pVCT1251载体，回收3727bp的pVCT1251载体骨架; 同时人工合成含有拟南芥At4g01735基因内含子和猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信
Wi^^ll IEIii5' -ctagaaccatggtccatacttggattgattttgaagcccaagaagaagagaaagct ggc-3’ (SEQ IDN0. 11)，划线部分为内含子编码序列，反义链为5’-catggccagctttctcttct tcttRRRcttcaaaatcaatccaaRtatRRaccatRRtt-3，(SEQ ID Ν0· 12)，划线部分为内含子编码序列，将人工合成的正义链和反义链在94°C变性3分钟，退火至60°C保温2分钟，构成上游含有)(ba I粘性末端，下游含有内切酶Nco I粘性末端，中间为拟南芥At4g01735基因内含子和猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信号的双链DNA，将获得的双链DNA与回收的 PVCT1251载体骨架用T4 DNA连接酶在16°C条件下过夜连接，得pVCT1252载体，如图7所示。pVCT1252载体中Cre基因上游插入了拟南芥At4g01735基因内含子和猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信号，Cre基因表达的Cre重组酶能够成功定位于细胞核中。用Xba I和Me I酶切所得pVCT2027载体，弃⑶S基因编码区，回收3106bp的 PVCT2027载体骨架；同时用)(ba I和Mc I酶切所得pVCT1252载体，回收含内含子和核定位信号的Cre基因片段；将回收的PVCT2027载体骨架与Cre基因用T4 DNA连接酶在16°C 条件下过夜连接，即用含内含子和核定位信号的Cre基因替换pVCT2027载体上的⑶S编码区，得PVCT2136载体，如图7所示。
用EcoRV单酶切pVCT2136载体，从pVCT2136载体的Cre基因中间切开，琼脂糖凝胶电泳，回收PVCT2136载体骨架；同是根据PCAMBIA1301载体序列，设计⑶S基因内含子引物，上游引物为 5，-gtaaatttctagtttttctccttc-3’ (SEQ ID NO. 13),下游引物为 5，_ct gtaactatcatcatcatcatag-3’ (SEQ ID NO. 14),以 pCAMBIA1301 载体为模板进行 PCR 扩增, PCR反应条件为反应条件为95°C预变性2分钟，95°C变性10秒，53°C退火20秒，72°C延伸I分钟10秒，3个循环，95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸I分钟10秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟，回收190bp的内含子片段；将回收的内含子与PVCT2136载体骨架连接，连接反应在为用T4 DNA连接酶在16°C条件下过夜连接，得pVCT2117载体，如图7 所示。pVCT2117载体中⑶S基因内含子插入pVCT2136载体的Cre基因内部，形成拟南芥 At4g01735基因内含子、猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信号和内部含Gus内含子的Cre 基因的结构，命名为ntCre基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示。pVCT2117载体中ntCre 基因由HSP70m启动子调控表达，将ntCre基因和HSP70m启动子命名为HSP70m: :ntCre。在 Cre基因前加核定位信号是为了将Cre基因表达的蛋白质定位于细胞核中，添加At4g01735 基因内含子和Gus基因内含子避免原核细胞中表达的Cre酶具有活性，在构建载体时发生删除。用Sal I和Xba I酶切所得pVCT2117载体，琼脂糖凝胶电泳，回收ntCre基因片段；同时用Sal I和Xba I酶切pVCT2034载体，琼脂糖凝胶电泳，回收含有0m35S启动子的 PVCT2034载体骨架。将回收的ntCre与pVCT2034载体骨架用T4 DNA连接酶在16°C条件下过夜连接，即将ntCre基因替换pVCT2034载体上的⑶S基因，得pVCT2139载体，如图8所示。pVCT2139载体中，ntCre基因由0m35S启动子调控表达，终止子为Tnos，命名为0m35S 启动子调控的ntCre基因表达盒。用SalI和SacI酶切所得pVCT2139载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收1501bp 的0m35S启动子和ntCre基因片段；同时用Sal I和Sac I酶切所得pVCT2041载体，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含HSP70m启动子调控的Rhsf基因表达盒的pVCT2041载体骨架； 将回收的PVCT2041载体骨架与0m35S启动子调控的ntCre基因表达盒连接，连接反应用 T4 DNA连接酶16°C过夜连接，得pVCT2219载体，如图8所示。所得pVCT2219载体中含有 0m35S启动子调控的ntCre基因表达盒和HSP70m启动子调控的Rhsf基因表达盒，命名为 0m35S::ntCre::Tnos/HSP70m::Rhsf::Tnos。根据报道的拟南芥生态型Columbia(Arabidopsis thaliana L. Ecotype Columbia) AtCBF3 基因(GenBank accession No. AB013815)序列，设计引物，上游引物为 5，-ccataccaacaaaaaagacagag-3，(SEQ ID NO. 15),下游弓 I物为5，-gtactaaaaatggaaata ataatctgag-3’ (SEQ ID NO. 16)，以从拟南芥生态型Columbia基因组DNA为模板，进行PCR 扩增。反应条件为95°C预变性2分钟，95°C变性10秒，51°C退火20秒，72°C延伸I分钟， 30个循环；72°C延伸10分钟；回收755bp大小的目的片段，回收片段连接pCR2. 1-T0P0载体(Invitrogen，US)，得 pCR2. l_AtCBF3 载体。用 EcoR I 酶切所得 pCR2. l_AtCBF3 载体， 琼脂糖凝胶电泳，弃AtCBF3基因片段，回收载体骨架；将回收片段用T4 DNA连接酶自环化连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，得pCR2. Im载体。根据所得pCR2. Im载体,设计引物,上游引物为5’ _tcatgaccaaaatccct_3’ (SEQ ID NO. 17)(位于pCR2. Im载体的原核基因终止子上游)，下游引物为5’-ttcagaagaactcgtcaagaagg-3’ (SEQ ID NO. 18)(位于 pCR2. Im 载体的 Kan 抗性基因 CDS 的下游);以 pCR2. Im 载体为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件95°C预变性2分钟，95°C变性10秒，50°C退火20 秒，72°C延伸3分钟，30个循环；72°C延伸10分钟；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定， 回收1240bp条带，用T4 DNA连接酶16°C自环化过夜连接，得pVCT1191载体，如图9所示。 所得PVCT1191载体中去除了 pCR2. Im载体中的Amp编码区，含有卡那霉素原核抗性基因 (nptll，新霉素磷酸转移酶基因)、fl复制子、LacZ基因、大肠杆菌复制子ColEl和原核抗性基因终止子，nptll上游含有原核启动子，下游与终止子连接，命名为nptllm基因，在原核细胞中具有卡那霉素抗性。根据所得pVCT1191载体设计nptllm基因引物，上游引物为5’ —atactcgagctact gggctatctgg-3’ (SEQ ID NO. 19)(位于nptllm基因的启动子上游,划线处为XhoI位点), 下游弓I物为5 _c&tt&t&cg&&gtt&tcctgc&ggcggccgccc&gggccctggt&gctcttg&tccggc_3^ ( SEQID NO. 20)(划线部分与nptllm基因的原核终止子末端正链序列互补)，以pVCT1191载体为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C变性10秒，52°C退火 20秒，72°C延伸I分钟20秒，3个循环，再经95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸I 分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，回收1265bp的 nptllm基因。将回收的nptllm基因用下游带LoxP位点的引物进行再扩增，上游引物为如 SEQ ID NO. 19 所TK序列，下游引物为 5,-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcc-3> (SEQ IDNO. 21)，P划线部分为Lox位点，核酸序列如SEQ ID NO. 25所示;PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95 °C变性10秒，46°C退火20秒，72°C延伸I分钟20秒，3个循环，再经95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸I分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟，PCR产物命名为nptIIm-LoxP组件，将回收的nptIIm-LoxP组件与pMD18_T载体连接，得pVCT1202 载体，如图9所示。用Xho I酶切pCAMBIA1302载体(此载体由本实验室保存，GenBank accession No.AF234298)，弃潮霉素抗性基因(hptll)，回收pCAMBIA1302载体骨架；同时用Xho I和 SalI酶切所得pVCT1202载体，回收含有nptllm-LoxP组件片段，将回收的pCAMBIA1302 载体骨架与nptllm-LoxP组件连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，SP npt I Im-LoxP组件替换pCAMBIA1302载体上的hptll基因，得pVCT2071载体。所得pVCT2071 载体中含有nptllm-LoxP组件序列，LoxP位点位于nptllm基因3’端,命名为第一 LoxP位点，同时nptllm基因由2个35S启动子控制表达。用Xho I和EcoR I酶切所得pVCT2071载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃pCAMBIA1302 载体中的hptll基因的2个35S启动子，回收pVCT2071载体骨架片段；同时根据pBIN19载体序列设计Pnos启动子引物，上游引物为5’ -cggaattcagggagtcacgttatgac-3J (SEQ ID NO. 22),划线处为 EcoR I 位点，下游引物为 -gttgtcgacgatccagatccggtgca-3> (SEQ ID NO. 23)，划线处为Sal I位点，以pBIN19载体为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3分钟，94 °C变性20秒，57 °C退火20秒，72 °C延伸I分钟30秒，35个循环，最后72 °C 延伸10分钟，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收303bp的Pnos启动子，回收片段经Sal I和 EcoRI双酶切，回收299bp的Pnos启动子酶切片段，将回收的pVCT2071载体骨架与Pnos启动子酶切片段连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，即Pnos启动子替换 PCAMBIA1302载体中的2个35S启动子，得pVCT2072载体，如图9所示。所得pVCT2072载体中nptllm基因由Pnos启动子启动表达。用PmaC I和XbaI酶切所得pVCT2072载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定，弃35S启动子和mGFP5基因，回收pVCT2072载体骨架片段；同时Not I酶切所得的pVCT1202载体，经 Klenow Fragment酶补为平末端，再用EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含ColEl复制子和LoxP位点的pVCT1202载体骨架，将回收的pVCT2072载体骨架与pVCT1202载体骨架连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，得pVCT2102载体，如图10所示。 所得pVCT2102载体中在真核表达框的左边界和右边界之间含有2个LoxP位点，分别为第一 LoxP位点和第二 LoxP位点，位于nptllm基因3’端的为第一 LoxP位点和位于nptllm 基因5’端的为第二 LoxP位点。用EcoR I和Sal I酶切所得的pVCT2102载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含有2 个LoxP位点的pVCT2102载体骨架；同时用EcoR I和Sal I酶切所得的pVCT2117载体，琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收HSP70m启动子调控的ntCre基因表达盒；将回收的pVCT2102载体骨架与ntCre基因表达盒连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下16°C连接过夜，得pVCT2231 载体，如图10所示。用Sal I酶切pVCT2231载体，然后用Klenow酶补为平末端，再用Sac I酶切， 琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含有LoxP位点的pVCT2231载体骨架；同时用BstE II酶切载体pVCT2219后用Klenow酶补为平末端，再用Sac I酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含有 0m35S: :ntCre: :Tnos/HSP70m: :Rhsf: :Tnos 结构的序列；将回收的 pVCT2231 载体骨架与 0m35S: :ntCre: :Tnos/HSP70m: :Rhsf: :Tnos结构连接，连接反应在T4 DNA连接酶作用下 16°C连接过夜，得含有热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP删除系统的载体，即pVCT2262 载体，如图10所示。pVCT2262工作原理如下在不含四环素条件下在温度高于28°CHSP70m 启动子能够诱导Rhsf基因表达，Rhsf蛋白能够调控0m35S启动子，诱导ntCre基因表达， ntCre基因表达的Cre重组酶能够特异识别Lox位点，删除Lox位点之间的序列；在含有四环素条件下，四环素能够与Rhsf蛋白结合,改变Rhsf蛋白的结构，导致Rhsf蛋白不能调控 0m35S启动子诱导ntCre基因表达。将PVCT2262载体采用冻融法转化转化根癌杆菌菌株EHA105感受态细胞，得含 PVCT2028载体的EHA105。将含pVCT2028载体的EHA105菌液叶盘法转化烟草，在含I. Omg/ L四环素和150mg/L卡那霉素在MS附加2. 5mg/L BA的培养基上进行抗性筛选，得抗卡那霉素的转基因烟草。将转基因烟草一组转移至只含150mg/L卡那霉素的培养基上培养，经 35°C热激处理10周，结果如图Il(A)所示；另一组转移至lmg/L四环素和150mg/L卡那霉素的培养基培养，经35°C热激处理10周，结果如图11 (B)所示，结果显示在含150mg/L卡那霉素的培养基上培养的烟草中出现白化现象，而在含lmg/L四环素和150mg/L卡那霉素的培养基上试管苗生长正常。结果表明，在含有I. Omg/L四环素和150mg/L卡那霉素的培养基中培养，四环素能阻止高温删除LoxP位点之间的序列。将处理后的两组转基因烟草转移至不含卡那霉素和四环素的MS培养基上培养经35°C热激处理10周，转基因烟草恢复正常生长，结果如图11(C和D)所示。结果表明获得的转基因烟草，在无四环素条件下，卡那霉素抗性基因能够在准确的删除，在培养基中添加四环素能防止在转基因植株获得过程中出现的非预期高温启动ntCre/LoxP删除系统，能够用于植物转基因中删除抗性基因。本实施例以卡那霉素抗性基因为例，还可以为其他抗性基因，例如链霉素抗性基因、氨苄霉素抗性标记基因、潮霉素抗性基因等抗性基因；也可以为非抗性基因的其他标记基因，如Gus基因、GFP基因等标记基因，同样可以ntCre/LoxP删除系统有效的删除。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.利用热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP删除系统，其特征在于所述ntCre/LoxP 删除系统包括ntCre重组酶特异识别的2个LoxP位点和位于2个LoxP位点之间的靶基因部分，所述2个LoxP位点分别为位于靶基因3’端的第一 LoxP位点和位于靶基因5’端的第二 LoxP位点；还包括HSF70m启动子调控的Iihsf基因表达盒和0m35S启动子调控的ntCre 重组酶基因表达盒部分，所述0m35S启动子由Iihsf基因调控，所述HSF70m启动子核酸序列如SEQID NO. 1所示，所述Iihsf基因核酸序列如SEQ ID NO. 24所示，所述0m35S启动子核酸序列如SEQ ID NO. 8所示，所述LoxP位点核酸序列如SEQ ID NO. 25所示，所述ntCre重组酶基因核酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
2.根据权利要求1所述的ntCre/LoxP删除系统，其特征在于所述ntCre/LoxP删除系统是所述第一 LoxP位点，靶基因，0m35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒，HSF70m 启动子调控的Misf基因表达盒和第二 LoxP位点顺序串联。
3.根据权利要求1或2所述的ntCre/LoxP删除系统，其特征在于所述靶基因为抗性标记基因。
4.含有权利要求1-3任一项所述ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体。
5.权利要求4所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下将含有 HSF70m启动子调控的Iihsf基因表达盒和0m35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分连入pVCT2231载体的酶切位点处；所述PVCT2231载体由pCAMBIA1320载体、pVCT1191载体和pBmi9载体制备，具体步骤为从PVCT1191载体中克隆nptnm基因，并在nptnm基因3’端加上LoxP位点，获得 nptIIm-LoxP组件，然后将nptllm-LoxP组件替换pCAMBIA1302载体上的潮霉素抗性基因 hptll，并将含LoxP位点的序列反向插入pCAMBIA1302载体，替换pCAMBIA1302载体的35S 启动子和mGFP5基因编码区；同时从pBIN19载体中克隆Pnos启动子，替换pCAMBIA1302载体上调控hptll基因的2X35S启动子，即得pVCT2231载体；所述PVCT1191载体由pCR2. 1-T0P0载体改造而来，具体为，删除pCR2. 1-T0P0载体上氨苄抗性基因并自环化连接构建的载体，即PVCT1191载体。
6.根据权利要求5所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，所述pVCT2231载体制备具体步骤为(1)将所得nptllm-LoxP基因连入pMD18_T载体中，得pVCT1202载体，并用SalI和 XhoI双酶切所得的pVCT1202载体，琼脂糖凝胶电泳并回收nptllm-LoxP组件，将回收的 npt I Im-LoxP组件连入pCAMBIA1302载体的2个XhoI酶切位点之间，得pVCT2071载体；(2)克隆的所述Pnos启动子，用MlI和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收，将所得的Pnos启动子连入所得pVCT2071载体的Β ο I和EcoR I酶切位点之间，得pVCT2072载体；(3)用NotI酶切所得PVCT1202载体，用KlenowFragment酶补为平末端，再用XbaI 酶切，回收含LoxP位点的pVCT1202载体片段，同时用PmaCI和)(baI酶切所得pVCT2072载体，回收含nptnm基因的pVCT2072载体片段，将回收的pVCT1202载体片段与pVCT2072载体片段连接，得PVCT2231载体。
7.根据权利要求6所述重组表达载体的制备方法，其特征在于所述nptllm-LoxP组件的制备，具体步骤为(1)以所得PVCT1191载体为模板，上游引物如SEQID NO. 19所示核酸序列，下游引物如SEQ ID NO. 20所示核酸序列，进行PCR扩增，PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C 变性10秒，52°C退火20秒，72°C延伸1分钟20秒，3个循环，再经95°C变性10秒，60°C退火20秒，72°C延伸1分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟，得nptnm基因；(2)以所得nptnm基因为模板，上游引物如SEQID NO. 19所示核酸序列，下游引物如 SEQ ID NO. 21所示核酸序列，进行PCR扩增，PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C变性 10秒，46 V退火20秒，720C延伸1分钟20秒，3个循环，再经95 V变性10秒，60 V退火20 秒，72°C延伸1分钟20秒，27个循环，最后72°C延伸10分钟，得nptIIm-LoxP组件。
8.根据权利要求5-7任一项所述重组表达载体的制备方法，其特征在于所述Pnos启动子制备方法，具体步骤为以PBIN19载体为模板，上游引物为如SEQ ID NO. 22核酸序列， 下游引物如SEQ ID N0. 23核酸序列，进行PCR扩增，PCR反应条件为94°C预变性3分钟， 94°C变性20秒，57°C退火20秒，72°C延伸1分钟30秒，35个循环，最后72°C延伸10分钟， 得Pnos启动子。
9.权利要求1-3任一项所述ntCre/LoxP删除系统在植物转基因中的应用。
10.权利要求4所述重组表达载体在植物转基因中的应用。
全文摘要
本发明公开了利用热激和四环素双重调控的ntCre/LoxP删除系统，所述ntCre/LoxP删除系统包括ntCre重组酶特异识别的2个LoxP位点和位于2个LoxP位点之间的靶基因部分，所述2个LoxP位点分别为位于靶基因3’端的第一LoxP位点和位于靶基因5’端的第二LoxP位点；还包括HSF70m启动子调控的Rhsf基因表达盒和Om35S启动子调控的ntCre重组酶基因表达盒部分，所述Om35S启动子由Rhsf基因调控；该删除系统受热激和四环素双重调控，能够在无四环素环境下通过热激删除2个LoxP位点之间的靶基因；本发明还公开了含ntCre/LoxP删除系统的重组表达载体，可以应用于植物转基因中删除靶基因，具有删除周期短，操作简单等优点。
文档编号C12N15/66GK102533749SQ201210032918
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者张兴国, 张香琴, 朱利泉, 杜小兵, 眭顺照, 苏承刚 申请人:西南大学