专利名称：一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种同时检测12个聋病易感基因荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
世界范围内对听カ语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80%患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80%。 因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听カ健康和发现听力异常中的重要性。在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2、GJB3是最常见的易感基因， 在先天性重度耳聋患者中约占30-50%。目前，在该基因已经发现了 100多种突变类型， 然而，不同种族GJB2基因常见的突变形式不同。在中国常见的突变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74. 14%，约22. 2%的中国耳聋患者与该突变有关。另外GJB2 299_300delAT,GJB2176_191dell6的突变等位基因频率约为3%和1%。耳聋基因GJB3中的538C > T突变位点被认为与高频听カ下降有关。药物的耳毒性是导致语前听カ损失的ー个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因1555A> G突变有关，该突变可以増加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏感性。在美国，耳毒性药物相关的听カ损失患者中，10%的具有12S rRNA基因1555A > G突变，美国语前听カ损失患者中，1555A > G突变患者的发病率约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因 1555A > G突变与15-20%的家族性非综合征型听カ损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙类药物也可发生因此突变导致的听カ下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊发现的耳聋患者中，约5%的患者是由于12S rRNA基因1555A > G突变导致的，而在聋哑学校这样ー个特殊群体，则高达 12%的患者是由于12SrRNA基因1555A > G突变接触氨基糖甙类药物而致聋。同时在中国群体中还发现了 12S rRNA基因1494C > T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C > T突变导致的。1555A > G突变和1494C > T突变者在出生时往往听カ正常，很难通过听カ筛查而被提前发现和预測，却存在因耳毒性药物的使用而发生听カ损失的隐患。SLC26A4基因与弧立的大前庭水管综合征及Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)的关系密切，临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。通过颞骨CT扫描可以得出结论，但目前由于设备和专业人员的限制，中国大部分地区的医院不能进行高分辨率的颞骨CT扫描，导致许多地区无法诊断大前庭水管综合征。通过对SLC26A4基因的检测，则可以在全国范围内实现对80%以上大前庭水管综合征的准确诊断，并先于CT检查发现和确诊大前庭水管综合征，这一方法可以避免放射线检查的辐射问题，更易为患者家属接受，并且由于基因诊断操作能够批量进行，可以在大标本范围内进行筛查。在95例単一患者前庭水管扩大家系的患者中，97. 9% (93/95)的具有该基因的突变，研究中共发现38种突变类型，包括E37X、P76L、T94I、P112S、 349delC、387delC、G197R、G204V、D271G、916_917insG、G316X、N392S、Q421P,K440X、Q446X, Q514X、I529S、S532R、N558I、D573Y、1746delG、V659L、R685I、K77I、M147V、IVS7-2A > G、 A387V、N392Y、1181_1183delTCT、R409H、T410M、S448X、S448L、IVS14+lG> A、IVS14-1G> C、 IVS15+5G > A、L676Q、H723R。其中，大量研究数据表明，IVS7-2A > G、2168A > G 致 H723R、 1174A > T 致 N392Y、1226G > A 致 R409H、1975G > C 致 V659L、2027T > A 致 L676Q 在中国前庭水管扩大患者SLC26A4基因突变中占有较高的比例。目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、变个生 1 M 才目色 i普分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。采用荧光标记技术、毛細管电泳技术、多重PCR复合扩増，通过带不同荧光标记物的多对引物同时对 GJB2 :176dell6bp,235delC,299delAT,SLC26A4 :2168A > G、IVS7_2A > G、1174A > T、1226G > A、1975G > C、2027T > A,线粒体 12SrDNA :1494C > T、1555A > G, GJB3 :538C > T特异性的扩增，并在这些引物中掺入核酸类似物以提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛細管电泳后分析PCR产物出峰情況，即可实现对这12个耳聋基因位点的同时检測。该方法灵敏度高、判读清晰准确、采样方便，井能实现一次性获得 12个关键位点诊断结果的高通量筛查流程，大大节约了人力物力和时间、防止多步操作而产生污染。
发明内容
本发明目的是提供ー种同时检测12个聋病易感基因GJB2 :176dell6bp、235delC、 299delAT ；SLC26A4 :2168A > G、IVS7-2A > G、1174A > T、1226G > A、1975G > C、2027T > A ； 12SrDNA :1494C > T、1555A> G ；GJB3 :538C > T 及 Amelogenin 基因座荧光检测试剂盒。为了实现上述目的，采取的技术方案ー种同时检测12个聋病易感基因荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，5对引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括内标R0X-300和用于基因分型的各基因突变位点对应的基因分型标准物；使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为 8. 0-9. 0，镁离子浓度为1.5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μΜ，Taq酶的用量为 0. 1-0. 4U/ μ L, 13对引物混合物中的单对引物终浓度为0. 2-0. 4 μ M0使用所述试剂盒进行PCR扩增吋，扩增阶段反应在ー个复合扩增反应体系中同时扩增 GJB2 :176dell6bp、235delC、299delAT ；SLC26A4 :2168A > G、IVS7-2A > GU174A > TU226G > AU975G > C、2027T > A ； 12SrDNA :1494C > T、1555A > G ；GJB3 :538C > T 及Amelogenin 条因メ坐。
用于 GJB2 2!35delC、176dell6bpJ99delAT 检测的引物为 SEQ NO. 1 :5’ -CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’ SEQ NO. 2 :5，-GCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC-3，； 用于12S rRNA 1555A > G突变检测的引物为 SEQ NO. 3 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3’ SEQ NO. 4 :5’ -GTACGCATTTATATAGAGTAGC-3，； 用于12S rRNA 1494C > T突变检测的引物为 SEQ NO. 5 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3， SEQ NO. 6 :5’ -GACACACCGCCCGTCTCT-3’ ； 用于IVS7-2A > G检测的引物为 SEQ NO. 7 :5’ -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3’ SEQ N0.8 :5， -GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3，； 用于SLC26A4 :2168A > G突变检测的引物为 SEQ NO. 9 :5’ -TGTGATAGAAAAGCTGGAGCAAT-3’ SEQ NO. 10 :5’ -TTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC-3，； 用于SLC26A4 :1174A > T突变检测的引物为 SEQ NO. 11 :5’ -AATGTACTTCCTGAAATACTCAGCGAA-3’ SEQ NO. 12 :5’ -ATGTACTTCCTGAAATACTCAGCGAA-3’ ； 用于SLC26A4 :1226G > A突变检测的引物为 SEQ NO. 13 :5’ -AATGTACTTCCTGAAATACTCAGCGA-3’ SEQ NO. 14 :5’ -GTATCTCCTGGACGGCCGTGT-3，； 用于SLC26A4 :1975G > C突变检测的引物为 SEQ NO. 15 :5’ -AGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAA-3’ SEQ NO. 16 :5’ -GAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG-3’ ； 用于SLC26A4 :2027T > A突变检测的引物为 SEQ NO. 17 :5’ -AGATCTGGAGGAACTTGATATCCC-3’ SEQ NO. 18 :5’ -GCAGAACCTTACCACCCGCT-3’ ； 用于GJB3 :538C > T突变检测的引物为 SEQ NO. 19 :5’ -CGAGGCTTGTCCTTGTGCA-3’ SEQ NO. 20 :5’ -GTGGACTGCTACATTGCCT-3’ ； 其中LNA核苷以黑体字表示。 用于Amelogenin基因座检测的引物为 SEQ NO. 21 :5，-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3， SEQ NO. 22 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。
所述的13对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料为不同的荧光素。 所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛細管电泳进行检測。
其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ；所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。使用所述的试剂盒进行PCR扩增吋，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序94-98°C l-5min ;26-32 个循环的 94-98°C 15_60s，55_65°C 15_60s，72°C 15-60; 60 °C 30-60min。使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了引物的Tm值，缩短了引物长度，从而增加了引物的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。对于Amelogenin的检出，一方面是内參的作用指示模板DNA是否有效或浓度范围；另一方面能有效指示是否存在PCR产物污染，防止因污染产生的假阳性。
图1是本发明的试剂盒对SLC26A4 1226G > A突变个体血斑来源DNA (0. 2ng/25uL 体系)扩增后的分型結果；图2是本发明的试剂盒对SLC26A4 :1174A > T突变个体血斑来源DNA(0. 5ng/25uL 体系)扩增后的分型結果；图3是本发明的试剂盒对12S rRNA 1494C >T突变个体血斑来源 DNA (2. 0ng/25uL体系)扩增后的分型结果；图4是本发明的试剂盒对SLC26A4 2027T > A突变个体血斑来源DNA (5. 0ng/25uL 体系)扩增后的分型結果；图5是本发明的试剂盒对GJB2 176dell6bp突变个体血斑来源DNA(1. 0ng/25uL 体系)扩增后的分型結果；图6是本发明的试剂盒对GJB2 299delAT突变个体血斑来源DNA (0. 5ng/25uL体系)扩增后的分型結果；图7是本发明的试剂盒对SLC26A4 :2168A > G突变个体血斑来源DNA (5. 0ng/25uL 体系)扩增后的分型結果；图8是本发明的试剂盒对GJB2 235delC突变个体血斑来源DNA (0. 2ng/25uL体系)扩增后的分型結果；图9是本发明的试剂盒对GJB3 :538C > T突变个体血斑来源DNA (2. 0ng/25uL体系)扩增后的分型結果；图10是本发明的试剂盒对SLC26A4 :1975G > C、12S rRNA 1555A > G同时突变的个体血斑来源DNA (1. 0ng/25uL体系)扩增后的分型结果；图11是本发明的试剂盒对IVS7-2A > G突变个体血斑来源DNA (0. 5ng/25uL体系)扩增后的分型結果；图12是本发明的试剂盒对正常个体血斑来源DNA (5. 0ng/25uL体系)扩增后的分
型結果；图13是未经修饰的引物对同一浓度(5. 0ng/25uL体系)的正常个体血斑来源DNA 样本的分型結果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。实施例1本发明的试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本。用于聋病易感基因SLC26A4突变热点 2168A > G、IVS7-2A > GU174A > TU226G > AU975G > C、2027T > A 检测的引物采用蓝色荧光染料标记，GJB2 176dell6bp、235delCJ99delAT检测的引物采用绿色荧光染料标记，用于Amelogenin基因座、12S rRNA 1494C > Τ、1555A > G突变检测的引物采用黄色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。1、待测样本1000份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对各位点进行过测序检测。其中，IVS7-2A > G突变样本10份，GJB2 235delC突变样本10份， 12SrRNA 1555A > G突变样本10份，1494C > T突变样本1份，2168A > G突变样本1份， 1174A > T突变样本1份，> A突变样本1份，1975G > C突变样本1份，2027T > A 突变样本1份，GJB2 176dell6bp突变样本1份，299delAT突变样本1份。2、检材的基因组DNA提取Chelex提取法剪下1 3mm血斑置于1. 5mL离心管中，加入SdH2O lmL，振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5% Chelex-IOO震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 μ L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴 IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。3、扩增和扩增产物的检测分析3. IPCR 扩增体系
权利要求
1.一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增各易感基因及Amelogenin基因座的引物、内标及各基因突变位点对应的基因分型标准物，所述鸯病易感基因为 GJB2 :176dell6bp,235delC,299delAT ；SLC26A4 :2168A > G、 IVS7-2A > GU174A > TU226G > AU975G > C、2027T > A ； 12SrDNA :1494C > T、1555A > G ；GJB3 :538C > Τ。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于用于 GJB2 2!35delC、176dell6bpJ99delAT 检测的引物为SEQ NO. 1 :5’ -CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’SEQ NO. 2 :5，-GCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC-3，；用于12S rRNA 1555A > G突变检测的引物为SEQ NO. 3 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3’SEQ NO. 4 :5’ -GTACGCATTTATATAGAGTAGC-3，；用于12S rRNA 1494C > T突变检测的引物为SEQ NO. 5 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3，SEQ NO. 6 :5’ -GACACACCGCCCGTCTCT-3’ ；用于IVS7-2A > G检测的引物为SEQ NO. 7 :5’ -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3’SEQ N0.8 :5， -GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3，；用于SLC26A4 :2168A > G突变检测的引物为SEQ NO. 9 :5’ -TGTGATAGAAAAGCTGGAGCAAT-3’SEQ NO. 10 :5’ -TTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC-3，；用于SLC26A4 :1174A > T突变检测的引物为SEQ NO. 11 :5’ -AATGTACTTCCTGAAATACTCAGCGAA-3’SEQ NO. 12 :5’ -ATGTACTTCCTGAAATACTCAGCGAA-3’ ；用于SLC26A4 :1226G > A突变检测的引物为SEQ NO. 13 :5’ -AATGTACTTCCTGAAATACTCAGCGA-3’SEQ NO. 14 :5’ -GTATCTCCTGGACGGCCGTGT-3，；用于SLC26A4 :1975G > C突变检测的引物为SEQ NO. 15 :5’ -AGATCTGGAGGAACTTGATATCCCAA-3’SEQ NO. 16 :5’ -GAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG-3’ ；用于SLC26A4 :2027T > A突变检测的引物为SEQ NO. 17 :5’ -AGATCTGGAGGAACTTGATATCCC-3’SEQ NO. 18 :5’ -GCAGAACCTTACCACCCGCT-3’ ；用于GJB3 :538C > T突变检测的引物为SEQ NO. 19 :5’ -CGAGGCTTGTCCTTGTGCA-3’SEQ NO. 20 :5’ -GTGGACTGCTACATTGCCT-3’ ；其中LNA核苷以黑体字表示。用于Amelogenin基因座检测的引物为SEQ NO. 21 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，SEQ NO. 22 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的用于GJB2:176dell6bp、 235delC、299delAT ；SLC26A4 :2168A > G、IVS7_2A > G、1174A > T、1226G > A、1975G > C、 2027T > A ； 12SrDNA :1494C > T、1555A > G ；GJB3 :538C > T 及 Amelogenin 基因座扩增的引物，每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干所述GJB2:176dell6bp、235delC、 299delAT, SLC26A4 :2168A > G、IVS7-2A > G、1174A > T、1226G > A、1975G > C、2027T > A ； 12SrDNA :1494C > T、1555A > G ；GJB3 :538C > T 及 Amelogenin 基因座检测的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记；内标选用不同于上述的荧光染料标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干所述GJB2 176de 116bp、235de 1C、 299delAT ；SLC26A4 :2168A > G、IVS7-2A > G、1174A > T、1226G > A、1975G > C、2027T > A ； 12SrDNA :1494C > T、1555A > G ；GJB3 :538C > T 及 Amelogenin 基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛細管电泳进行检测。
6.权利要求1所述试剂盒应用于聋病易感基因的检测，其特征在于通过荧光引物PCR 及毛細管电泳特异性检测聋病易感基因GJB2 :176dell6bp,235delC,299delAT ；SLC26A4 2168A > G、IVS7-2A > GU174A > TU226G > AU975G > C、2027T > A ； 12SrDNA :1494C > T、1555A > G ；GJB3 :538C > T 及 Amelogenin 基因座；用于 GJB2235delC、176dell6bp、 299delAT检测的引物为=SEQ NO. 1、SEQ NO. 2 ；用于12S rRNA 1555A > G突变检测的引物为:SEQ NO. 3、SEQ NO. 4 ；用于 12S rRNA 1494C > T 突变检测的引物为=SEQ NO. 5、SEQ NO. 6 ；用于 IVS7-2A > G 检测的引物为:SEQ NO. 7、SEQ NO. 8 ；用于 SLC26A4 :2168A > G 突变检测的引物为=SEQ NO. 9、SEQ NO. 10 ；用于SLC26A4 :1174A > T突变检测的引物为=SEQ NO. IUSEQ NO. 12 ；用于 SLC26A4 > A 突变检测的引物为SEQ NO. 13,SEQ NO. 14 ；用于 SLC26A4 :1975G > C 突变检测的引物为SEQ NO. 15,SEQ NO. 16 ；用于 SLC26A4 :2027T > A突变检测的引物为=SEQ NO. 17,SEQ NO. 18 ；用于GJB3 :538C > T突变检测的引物为=SEQ NO. 19,SEQ NO. 20 ；用于 Amelogenin 基因座检测的引物为=SEQ NO. 21、SEQ NO. 22。所述各基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛細管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测12个聋病易感基因荧光检测试剂盒，该试剂盒可在3个小时内同时检测中国人最常见的四个耳聋相关基因中的12个热点突变，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增各检测位点基因座的引物混合物；所述扩增后试剂包括基因分型标准物和内标。本发明首次复合采用了荧光标记技术、LNA核苷单体掺入-引物修饰技术、毛细管电泳技术实现对耳聋基因位点高灵敏度特异性同时检测，大大节约了人力物力和时间、防止多步操作而产生污染。
文档编号C12Q1/68GK102534031SQ201210033289
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者万戈江, 夏子芳, 步讯, 魏宏泉 申请人:北京科聆金仪生物技术有限公司