专利名称：一种基于enu诱变技术的人类charge综合症的小鼠模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及获得基因Chd7的特异位点突变小鼠模型的方法以及该方法在研究人类CHARGE综合症中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
小鼠是一种非常好的可用于研究人类疾病的致病病因，分子机制以及治疗方法的动物模型。运用表型驱动的方法高通量筛选化学诱变或者射线诱变的小鼠来建立人类疾病模型是一种越来越常见的手段。ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)是一种强烈的烷基化试剂，可以将自己的乙基转移给DNA中的氧或氮自由基，从而导致DNA碱基错配和替换。利用ENU 来诱导DNA碱基突变的方法已经在美、英、德、日、澳和加拿大等国建立数以千计的模拟人类出生缺陷、代谢性疾病、自身免疫疾病、神经系统疾病、心脑血管系统疾病的模型突变小鼠模型。相关的致病基因被不断定位，克隆。相关的致病机理，治疗方法在不断地研究中。 在国内，目前南京大学模式动物研究所已经成功进行了多次ENU诱变，已经筛选到了许多突变小鼠品系，包括白内障、听力下降、骨密度异常、肢 体缺陷、打转、瘫痪及毛发异常等，目前正在对这些小鼠品系进行突变定位以及病理，病因的研究。
CHARGE综合症是一种在新生儿中发病率为1/12000-1/8500的遗传导致的出生缺陷。其名称CHARGE概括了该综合症的主要表型，包括眼球发育不全(ocular Coloboma)，心脏缺陷(Heart defects of any type),后鼻孔闭锁(Atresia of the choanae),生长发育迟缓(Retarded growth and development),生殖器萎缩(Genital hypoplasia),耳朵异常 (Ear abnormalities)。除此以外,CHARGE综合症还具有外显率不一的一系列异常,包括腭裂，唇裂，面瘫，中枢神经系统异常，脊柱侧弯，骨骼异常，免疫系统异常等。
CHD7蛋白是一种隶属于CHD家族的蛋白。CHD家族的蛋白是可以利用ATP水解的能量改变核小体内组蛋白与DNA的结合面的解旋酶。60% -80%的CHARGE综合症患者都具有CHD7基因的突变。因此Chd7基因被普遍公认为CHARGE综合症的致病基因。带有Chd7 基因突变的小鼠，其表型与人类CHARGE综合症十分相似，因而是一种非常好的人类CHARGE 综合症的疾病模型。发明内容
本发明的目的是提供一种利用ENU诱变技术产生Chd7基因突变的小鼠，从而产生一种CHARGE综合症动物模型的方法，其中用到变性高效液相色谱分析(DHPLC)方法来鉴定小鼠的基因型。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
步骤一、注射ENU诱变雄性小鼠，注射计量为100mg/kg，注射频率为每周一次，注射的周期为2-4周，并从注射ENU开始向小鼠饮水中添加SDM ；
步骤二、可育性检验，在三个月内将注射过ENU的的雄性小鼠与正常雌性小鼠合笼，可育的雄性小鼠被抛弃；
步骤三、筛选基因突变的代谢异常小鼠，将步骤二中三个月内不育的雄性小鼠与正常的雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠，对新生小鼠进行表型筛选，得到基因突变的具打转表型的小鼠；
步骤四、通过遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置，将步骤三中所述基因突变小鼠与C3H/HeJ小鼠交配产生I代小鼠，选出有打转表型的I代雌性小鼠与C3H/HeJ 雄性小鼠产生2代小鼠；提取2代小鼠的DNA，并通过现有数据库提供的引物进行PCR反应， 对PCR产物进行电泳分离，得到与Chd7位点紧密连锁的突变位点；
本发明的有益效果:本发明利用ENU诱变技术，筛选到了一个新的Chd7基因突变的小鼠品系，命名为COAl小鼠，发现该小鼠的表型与人类CHARGE综合症完全一致，从而得到一个从基因到表型完全模仿人类CHARGE综合症的优秀动物模型，可用于CHARGE综合症病因病理研究，治疗方式研究及药物筛选。
图1为COAl小鼠的基因型鉴定结果以及基因编码区的突变说明。
图2为COAl小鼠的眼球发育不全表型。
图3为COAl小鼠的后鼻孔闭锁表型。
图4为COAl小鼠的心脏发育缺陷(心房中隔缺损，心室中隔缺损)表型。
图5为COAl小鼠的骨骼发育异常表型。
图6为COAl小鼠的中枢神经系统中的前脑发育异常表型。
具体实施方式
小鼠的饲养和繁育:C57BL/6J和C3H/Hej购自Jackson实验室(美国)，饲养在南京大学模式动物研究所的AALAC认证的SPF级的动物房里。所有的小鼠操作均严格按照 “Principles of laboratory animal care”(美国国立卫生院发行号 85-23,1985 修订版； http://grantsl.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm)和“the care and use of laboratory animals”(美国国家研究理事会，1996).并得到了模式动物研究所动物管理委员会的批准和监督。
实施例一
我们通过多聚链式扩增反应(PCR)技术对Chd7突变小鼠进行基因型鉴定，基因组DNA中特异地扩增出包含有Chd7基因第四个外显子的部分，所使用的PCR引物序列为: Chd7-4f:5’ -CGAAGGTGTACGCTAAGTGATG-3’，Chd7-4r:5’ -GTTTCTGTGGGCTCTGGCTC-3’.将所得的PCR产物进行DHPLC分析，含有突变的PCR产物结果为双峰，不含突变的PCR产物结果为单峰。
实施例二
小鼠胚胎前脑组织的形态学研究。分别取胚胎期12.5，13.5，15.5，17.5的小鼠胚胎，用4%多聚甲醛固定胚胎，进行大体形态学分析。然后将胚胎用梯 度酒精脱水，并用用石蜡包埋，进行连续切片以及HE染色。在高倍显微镜下观察突变小鼠胚胎和野生型小鼠胚胎前脑组织形态的差异。
实施例三
小鼠胚胎前脑中线组织的细胞凋亡情况的研究。取胚胎期10.5的小鼠胚胎，用 4%多聚甲醛固定胚胎，然后将胚胎用梯度酒精脱水，并用用石蜡包埋，进行连续切片。然后用PR0MEGA的检测细胞凋亡的试剂盒检测小鼠前脑切片中线部位的细胞凋亡情况。也可以取胚胎期10.5的小鼠胚胎，直接将其置于预先配好的Nile blue的染液中，37度放置30-45 分钟，然后将胚胎取出放到PBS中，4度过夜，待非特异性背景蓝色褪去后，立即在体视镜下观察分析小鼠前脑切片中线部位的细胞凋亡情况
实施例四
用原位杂交技术分析小鼠胚胎前脑的分子表达水平，从而分析小鼠胚胎前脑发育异常的机制机理。
步骤一、取胚胎期9.5或者10.5的小鼠胚胎，用4%多聚甲醛固定胚胎，然后将胚胎用梯度甲醇脱水，然后复水。
步骤二、复水之后用5%的双氧水进行漂白。用蛋白酶K适量消化组织蛋白，之后用4%多聚甲醛0.25%戊二醛进行后固定。
步骤三、先用预杂交液在65摄氏度与杂交，然后用基因特异性的探针在65摄氏度孵育16-20小时。
步骤四、用罗氏(roche)公司购买的洗脱液清洗胚胎，然后与购于罗氏公司的抗地高辛的抗体在4摄氏度孵育16-20小时。
步骤五、用可以去内源性碱性磷酸酶的清洗液清洗胚胎，然后与购于罗氏公司的的显色底物在4摄氏度孵育。每隔I个小时观察一次。等到显色反应进行得充分时，终止反应。
步骤五、用梯度甲醇脱水复水胚胎，最后放在50%的甘油中，并于体式镜下观察拍照。一共可以运用Bmp4, Shh, Fgf8, Foxgl, Ttr, Lhx2, Dlx5等基因的探针分析这些基因在突变胚胎以及野生型胚胎中的表达水平以及表达区域。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围 。
权利要求
1.一种基于ENU诱变技术产生Chd7基因突变的小鼠模型的方法，其特征在于包括如下步骤步骤一、注射ENU诱变雄性小鼠，注射计量为100mg/kg，注射频率为每周一次，注射的周期为2-4周，并从注射ENU开始向小鼠饮水中添加SDM ；步骤二、可育性检验，在三个月内将注射过ENU的的雄性小鼠与正常雌性小鼠合笼，可育的雄性小鼠被抛弃；步骤三、筛选基因突变的代谢异常小鼠，将步骤二中三个月内不育的雄性小鼠与正常的雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠，对新生小鼠进行表型筛选，得到基因突变的具打转表型的小鼠；步骤四、通过遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置，将步骤三中所述基因突变小鼠与C3H/HeJ小鼠交配产生I代小鼠，选出有打转表型的I代雌性小鼠与C3H/HeJ雄性小鼠产生2代小鼠；提取2代小鼠的DNA，并通过现有数据库提供的引物进行PCR反应，对 PCR产物进行电泳分离，得到与Chd7位点紧密连锁的突变位点。
2.根据权利要求I所述的基于ENU诱变技术产生Chd7基因突变的小鼠模型的方法，其特征在于该小鼠表现出眼球发育不全，听力缺陷，生殖力缺陷，打转，嗅觉缺陷，前脑发育缺陷，心脏发育缺陷，后鼻孔闭锁等完全模拟人类CHARGE综合症的表型。
3.根据权利要求I所述的基于ENU诱变技术产生Chd7基因突变的小鼠模型的方法，其特征在于突变位点位于小鼠的四号染色体Chd7基因的第四个外显子上。
4.根据权利要求I所述的基于ENU诱变技术产生Chd7基因突变的小鼠模型的方法，其特征在于所述步骤四中小鼠的基因型包括纯合子、杂合子与野生型。
5.根据权利要求4所述的基于ENU诱变技术产生Chd7基因突变的小鼠模型的方法，在研究人类CHARGE综合症中的应用。
6.根据权利要求4所述的基于ENU诱变技术产生Chd7基因突变的小鼠模型的方法，在筛选Bmp4激动剂药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及获得基因Chd7的特异位点突变小鼠模型的方法以及该方法在研究人类CHARGE综合症和筛选Bmp4激动剂类药物中的应用，属于生物技术领域。该方法包括如下步骤通过ENU注射C57BL/6J雄鼠，在通过不育检测后，这些雄鼠与正常B6雌鼠交配产生G1代小鼠，在G1代小鼠中，筛选出有打转表型的小鼠品系，通过遗传连锁分析和基因克隆测序，将突变位点定位到小鼠染色体的特定位置，并确定突变基因和突变位置；并通过对Chd7基因突变小鼠进行表型分析，得出该Chd7突变小鼠完全模拟人类CHARGE综合症的表型，是一种非常好的人类CHARGE综合症的模型小鼠的结论。该小鼠模型可用于进一步人类CHARGE综合症的病因病理研究以及对CHARGE综合症治疗方法和药物的筛选。
文档编号C12Q1/68GK103250682SQ20121003791
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者蒋璇, 林兆宇, 冼黎, 陈维倩, 高翔 申请人:南京大学