专利名称：一种海洋石油降解菌剂及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋环境治理技术领域，具体涉及一种海洋石油降解菌剂及其制备方法。
背景技术：
随着世界对石油及其制品需求的日益增长，在海上开采、运输、装卸以及利用石油过程中的溢油事故也日渐增多。溢油不仅造成严重的环境污染，并且由于石油烃类污染物的潜在毒性和生物累积效应会导致近岸海域环境质量和生物种类多样性指数严重下降，破坏生态系统的功能，对水产业和旅游业也会造成巨大的经济损失。另外，石油烃中的多环芳烃类化合物具有强烈的致畸、致癌和致突变效应，可能通过食物链进入人体，对人体健康具有很大的潜在危害。因此，研究近岸海洋环境中石油烃污染物的控制与修复问题对于保持海洋生态系统的良性循环，保障人民的身体健康以及促进经济和社会的可持续发展无疑具有重要的现实意义。微生物降解是去除环境中石油污染物的主要途径。生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术。微生物修复石油污染主要包括在污染区域接种微生物、添加营养物及提供电子受体等几种方法。其中，在污染区域接种微生物进行石油污染的治理被称为生物强化技术。但石油烃降解菌往往无法在现场获得直接应用，原因可能是由于单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与土著菌竞争处于劣势、抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感等。固定化微生物技术是新兴起的一种新型生物技术，它利用化学或物理的手段将酶或微生物细胞限制于某一特定空间范围内，并保持其生物活性。微生物固定化修复技术的主要特点是对完整的微生物细胞进行固定，可避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性，可提高单位体积水体内微生物细胞密度，并可加快细胞的流动速率，在稀释率高于微生物生长率的情况下，能有效地解决污染环境修复问题。固定化后的微生物能长期保持活性，固定化微生物载体的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害，减轻海浪的剪切力对微生物的损害， 使其在复杂环境中稳定地发挥高效性能。对于污染物浓度较低，空间分布区域广的海洋水体而言，微生物固定化无疑具有特殊的技术优势。固定化微生物方法多种多样，主要有表面吸附固定化、交联固定化、包埋固定化和自身固定化等几种方法。由于海洋油污染是飘浮在海水表面上，为了使降解菌能充分与油污染物接触，最大限度地对其进行降解，应选择表面吸附固定化方法。载体是固定化的关键，国内外采用的载体种类很多，主要有机高分子载体、无极分子载体和复合载体三种。如硬性填料、软性填料、聚苯乙烯球、活性炭、焦炭末、细石英砂、烟道灰、炉渣等，但是都存在缺陷。海洋石油降解菌剂的固定载体需要满足以下条件(I)可降解，避免造成海洋环境的二次污染；(2)可漂浮，由于油污染是漂浮在海水表面的，微生物只有固定在可漂浮的载体上才能与污染物充分接触，进行降解；(3)生物相容性好，能够固定足够数量的降解菌；(4)对景观影响小，菌剂主要应用在港口海域，不能对景观造成破坏。壳聚糖是甲壳素的部分脱乙酰基产物，是自然界中唯一的碱性多糖。它是葡糖胺和N-乙酰葡萄糖胺的复合物，由D-氨基葡萄糖和适量的N-乙酰-D-氨基葡萄糖以(I, 4)糖苷键连接而组成的。其化学名是(I，4)-2-氨基-2-脱氧-P-D-葡萄糖，结构类似于纤维素，外观呈半晶体状态。作为氨基多糖，壳聚糖(PKa = 6. 5)溶解性与pH值紧密相关， 在酸性条件下，由于氨基质子化而溶于水。在PH < 5时，壳聚糖完全溶于水形成十分粘稠的液体。壳聚糖是一种带正电荷的阳离子聚合物，在酸性水溶液中可与聚阴离子化合物如 肝素、海藻酸钠、羧甲基甲壳素等相互作用，形成聚电解质配合物。海藻酸钠是存在于褐藻类中的亲水性胶态多聚糖，白色或淡黄色粉末状，无臭无味，易溶于水。从分子角度来说，它是直链高分子，分子量在32kDa到200kDa之间，包括两种单体B — 1，4结构的D型甘露糖醛酸钠盐(M)和a— 1，4结构的L型古罗糖醛酸钠盐 (G)。这两种单体的比例是随其来源而变化的，高聚物的羧基是交联发生的位点，pK值约为
3.4 4. 4。海藻酸钠与二价及二价以上的金属离子如Ca2+、Ba2+、Cu2+、CO2+、Mn2+、Al3+等能发生置换反应，生成可在高温下使用的不可逆凝胶。对于二价阳离子与海藻酸盐的凝胶反应， Grantl等曾用一种叫“鸡蛋盒模型”的合作式模型进行了解释。一般ca2+的反应发生在古罗糖醛酸残基的功能团上，而Cu2+、CO2+和Mn2+会与两种残基的羧基反应。复凝聚法是指利用两种聚合物在不同的pH值下电荷的变化，即一种带负电荷的胶体溶液与一种带正电荷的胶体溶液相混，由于异种电荷之间的相互作用形成聚电解质复合物。海藻酸钠、聚丙基酸钠等高分子材料均能与壳聚糖起复凝聚作用。海藻酸钠与壳聚糖进行复凝聚反应，形成的复合膜具有原料来源广泛，价格低廉， 固定化条件温和，操作简单，生物相容性好，基质和产物扩散阻力小等优点，是制备微生物固定载体的理想材料。因此，将石油降解菌群附着在一种用海藻酸钠与壳聚糖的复合膜制成的可漂浮可降解的生物固定载体上，从而制备出的石油降解菌剂有望用于海洋石油污染的治理。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够降解海洋石油污染的菌剂，该菌剂能够漂浮在水面上进行石油污染的降解，且自身也能较快被降解，不造成二次污染。本发明主要通过以下技术手段来实现一方面通过富集培养的方法从被石油污染的海水中获得石油降解菌群；另一方面是用膨化后的可降解材料作为核心，外层包被可降解的带正电复合膜来制备生物固定载体。膨化可降解材料使生物固定载体具有漂浮性，可降解复合膜带正电，能够与带负电的菌体互相吸引，使细菌牢固附着在载体上，而且复合膜呈多孔状的疏松结构，使降解菌群能够附着在复合膜孔状结构的壁上。为此本发明公开了一种能够降解海洋石油污染的菌剂，包括菌群和生物固定载体，其特征在于由海洋石油降解菌群附着可漂浮可降解的生物固定载体上制成。其中石油降解菌群从石油污染的海水中富集培养得到。选自食烷菌属、无色杆菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、微球菌属、假单孢菌属、弧菌属、气单孢菌属、节细菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、放线菌属、诺卡氏菌属中的一种或它们的任何组合。生物固定载体的核心可降解材料选自淀粉、木质纤维、木屑、玉米粒、玉米芯、麦麸、甲壳素、大黄米、小黄米、大米、秸杆粉中之一或它们的任何组合。可降解复合膜的材料选自微晶纤维、羧甲淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧丙基纤维素、壳聚糖、明矾、海藻酸钠、聚乙二醇、丙烯酰胺、琼脂中之一或它们的任何组合制成。另一方面，本发明还公开了所述石油降解菌剂的制备方法，包括下列步骤(I)将高温高压膨化后的可降解材料作为核心，加入到带电复合膜的可降解材料的溶液中，搅拌5-10min，捞起备用；(2)将浸泡过复合膜降解材料溶液的核心材料加入到成膜无机盐溶液中，搅拌 5-10min,进行成膜反应,反应后捞起,作为湿生物载体；(3)将湿生物载体加入石油降解菌群的培养液中，100rpm，30°C摇床震荡3小时， 进行菌体附着，捞出，作为湿菌剂；(4)将湿菌剂在_70°C预冻4小时，冻干机-56°C真空冻干后，4°C保存。本发明与已有技术相比，具有如下显著特征(I)降解菌剂为完全可降解的材料组成。一般在制备菌剂时，所用的生物固定载体为三氧化二铝、硅藻土、粘土、活性碳、多孔玻璃等，这些材料不能降解，在大量使用时会对海洋环境造成二次污染。本发明所用的生物固定载体完全是可降解材料，应用到海洋环境治理中可以降解，不用回收，没有二次污染。(2)降解菌剂具有漂浮性。海洋石油污染一般是漂浮在海面上，如果用三氧化二铝、硅藻土、粘土、活性碳、多孔玻璃等作载体，菌剂会沉到海底，无法与石油污染接触，不能起到降解作用。本发明所制备的菌剂可以漂浮在海水表面，使降解菌能与石油污染物充分接触，进行降解。
图I :固定载体的形态A湿的固定生物载体；B冷冻干燥后的固定生物载体。图2 :电子显微镜下带电复合膜的多孔状结构。图3 :干燥后的菌剂形状。图4 :菌剂在电子显微镜下的形态A空载体的形状；B菌体在载体复合膜上的附着情况，红圈内表不一个附着菌。图5 :菌剂降解石油效果图菌剂加入含石油培养基中培养降解7天后，用石油醚将残存的石油萃取出来。A未加入菌剂的含石油培养基经石油醚萃取后；B加入菌剂的含石油培养基经石油醚萃取后。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
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实施例I.原油降解菌群的富集、培养从受原油污染的海水区域采集表层水样，用灭菌后的4L棕色玻璃瓶取2L表层海水后密封保存，24h内进行微生物的富集培养工作。将采集的水样取ImL接种于含0. 5% (v/v)原油的IOOmL灭菌的人工海水培养基 (MMC)中。MMC 的配方为(每升含量)=NaCl 24g ；MgS04 7H20 0. 7g ；NH4NO3 Ig ；KC1 0. 7g ； KH2PO4 2g ；Na2HPO4 12H20 3g ；pH7. 5，灭菌后补加适量微量元素混合。微量元素经0. 22 u m 滤膜过滤除菌，其组成(每升含量)如下CaCl2 2mg ；FeCl3 6H20 50mg ；CuSO4 0. 5mg ； MnCl2 4H20 0. 5mg ；ZnSO4 7H20 10mg/L。在30°C，180rpm的摇床培养7天后，从培养液中取出ImL转接入IOOmL新鲜培养基中，培养基中的原油浓度提高至I % (v/v)，在相同的条件下培养7天，重新转接。按上述方法重复5次，原油浓度按梯度(0.5^^1^^1.5^^2^^2.5% )提高，富集培养五个周期。 取富集后的石油降解菌群，20%甘油保存于-70°C，备用。实施例2.可漂浮、可降解生物固定载体的制备分别配制I %的CaCl2溶液，I %的海藻酸钠溶液和I %的壳聚糖及I %的CaCl2混合溶液。称取适量膨化小黄米，加入I %的CaCl2溶液中，搅拌浸润5-10分钟；从CaCl2溶液中取出浸润后膨化小黄米，加入I %的海藻酸钠溶液中，搅拌5-10分钟，进行成膜反应； 从海藻酸钠溶液中取出载体半成品，此时载体半成品由膨化小黄米外包一层海藻酸钙膜构成，将载体半成品加入I %的壳聚糖及I %的CaCl2混合溶液中，搅拌5-10分钟，进行复凝聚作用，使外层的海藻酸钙膜与壳聚糖复凝集成复合膜；将载体从混合溶液中取出，备用， 如图I所示。实施例3.石油降解菌群的活化、培养取_70°C保存的石油降解菌群，以1%的比例接种到5ml LB培养基中，180rpm， 30°C摇床培养8小时进行活化。LB培养基组成如下(每升含量)NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g。活化后的培养物再按照I %的比例接种到500ml LB培养基中。180rpm，30°C 摇床培养3-6小时，OD600值为0. 6 I. 0之间，作为制备菌剂的降解菌培养液。实施例4.石油降解菌剂的制备将实施例2所制备的载体与实施例3所制备的降解菌培养液按照I : 10 (w/v)混合，I IOrpm,30 V摇床培养3小时，使降解菌粘附、固定在生物固定载体上。3小时以后，取出制备好的菌剂，用LB培养基冲洗后，置于-70°C，预冻4小时。4小时后，取出预冻好的菌剂，在-56°C条件下，真空冷冻干燥后得菌剂终产物(图3)，4°C保存。实施例5.固定载体及石油降解菌剂的扫描电镜观察将干燥的固定载体及石油降解菌剂碾碎后，进行表面喷金，然后置于扫描电镜下观察。电压设为20kv，在适宜的放大倍数下观察载体及菌剂表面情况。固定载体的表层复合膜在电镜下呈现多孔的疏松状结构，如图2所示，而降解菌剂中，石油降解菌附着在载体表面的孔洞中，如图4所示。实施例6.石油降解菌剂对石油的降解将石油降解菌剂按照I %的浓度接种到含原油0. 5 %的50ml MMC培养基中，30°C、 180rpm摇床培养7天，培养液用于降解率的测定。
实施例7.石油降解菌剂对石油降解率的测定将培养液倒入IOOmL的分液漏斗，取20mL石油醚冲洗三角瓶后一并倒入分液漏斗中，加盖充分振摇2min，并注意放气，静置分层2min，将下层液体培养基放回摇瓶中。用上面放有2g无水硫酸钠的漏斗过滤上层石油醚萃取液，滤液置于IOOmL容量瓶中。再将液体培养基倒人分液漏斗，用20mL石油醚冲洗摇瓶，重复提取2次，合并2次提取液于IOOmL容量瓶中，用石油醚定容，在紫外分光光度计225nm处，以石油醚为参比测定吸光度，根据标准曲线，计算出石油降解率。经测定，菌剂对石油的7天降解效率为82. 3%，石油醚萃取后的残余石油如图5所示。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为本发明各个方面的例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
权利要求
1.一种海洋石油降解菌剂，包括生物固定载体和石油降解菌群，其特征是该菌剂由海洋石油降解菌群附着在可漂浮可降解的生物固定载体上制成。
2.按权利要求I所述的石油降解菌剂，其特征是生物固定载体用膨化后的可降解材料作为核心，外层包被可降解的带正电复合膜。
3.按照权利要求I所述的石油降解菌剂，其特征是所说石油降解菌群是从石油污染的海水中富集培养得到。
4.按照权利要求2所述的石油降解菌剂，其特征是所说可降解材料选自淀粉、木质纤维、木屑、玉米粒、玉米芯、麦麸、甲壳素、大黄米、小黄米、大米、秸杆粉中之一或它们的任何组合。
5.按照权利要求2所述的石油降解菌剂，其特征是所说的带正电复合膜由选自微晶纤维、羧甲淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧丙基纤维素、壳聚糖、明矾、海藻酸钠、聚乙二醇、丙烯酰胺、琼脂中之一或它们的任何组合制成。
6.按照权利要求3所述的石油降解菌剂，其特征是所说的菌群选自食烷菌属、无色杆菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属、微球菌属、假单孢菌属、弧菌属、气单孢菌属、节细菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、放线菌属、诺卡氏菌属中的一种或它们的任何组合。
7.按照权利要求5所述的石油降解菌剂，其特征是所说的的带正电复合膜要在无机盐溶液中进行成膜反应。
8.按照权利7所述的石油降解菌剂，其特征是所说的无机盐溶液由选自氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、氢氧化钙、硫酸钙中的一种或它们的任何组合。
9.按照权利要求I所述的石油降解菌剂的制备方法，包括下列步骤(1)将高温高压膨化后的可降解材料作为核心，加入到带电复合膜的可降解材料的水溶液中，搅拌5-10min，捞起备用；(2)将浸泡过复合膜降解材料水溶液的核心材料加入到成膜无机盐溶液中，搅拌 5-10min,进行成膜反应,反应后捞起,作为湿生物载体；(3)将湿生物载体加入石油降解菌群的培养液中，100rpm，30°C摇床震荡3小时，进行菌体附着，捞出，作为湿菌剂；(4)将湿菌剂在_70°C预冻4小时，上冻干机，-56°C真空冻干后，4°C保存。
全文摘要
本发明涉及海洋环境治理技术领域，具体涉及一种海洋石油降解菌剂及其制备方法。本发明公开了一种海洋石油降解菌剂，包括石油降解菌群和生物固定载体，其特征在于该菌剂由海洋石油降解菌群附着在一种可漂浮可降解的生物固定载体上制成。本发明所述生物固定载体用膨化可降解材料作为核心，外层包被可降解的带正电复合膜；膨化可降解材料使生物固定载体具有漂浮性；可降解复合膜带正电，能够与带负电的菌体互相吸引，使细菌牢固附着在载体上，而且复合膜呈多孔状的疏松结构，使降解菌群能够附着在复合膜孔状结构的壁上；与单纯的石油降解菌群相比，降解菌剂的降解效率提高显著。本发明所涉及的海洋石油降解菌剂有望用于海洋石油污染的生物修复治理。
文档编号C12N11/02GK102604924SQ20121005542
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者何颖, 侯登勇, 刘玉明, 刘琼, 李珂娴, 沈先荣, 王庆蓉, 莫琳芳, 蒋定文, 钱甜甜, 陈伟 申请人:中国人民解放军海军医学研究所