专利名称：用于犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别诊断rt-lamp检测引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明设计一套检测毒株的引物，尤其涉及一套用于检测犬瘟热病毒野毒株的 RT-LAMP引物，属于犬瘟热病毒的检测领域。
背景技术：
犬痕热病毒(Canine distemper virus, CD V)属于副粘病毒科 (Paramyxoviridae)，副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)，麻疫病毒属(Morbillivirus)。 CDV为有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组全长15 690bp，主要编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白⑶和大蛋白(L)6个结构蛋白。目前公认CDV只有一个血清型，但根据H基因氨基酸序列同源性高于95%的毒株可归为同一基因型的原则，可将⑶V分为亚洲I型(Asia-I)、亚洲II型(Asia-II)、欧洲型 (Europe)、美国型(USA 或 America)、北极型(Arctic)和疫苗型(Vaccine 或 Old CDVs) 6 个不同基因型。犬瘟热(Canine distemper，⑶)是由⑶V感染犬或其它肉食目动物所引起的急性、高度接触性传染病。临床以双相热、红疹、结膜炎及中枢神经系统损害为主要特征。 自1809年首次报道以来，该病已呈世界性分布，给养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成巨大危害。⑶感染可导致犬、貂、狐等的病死率达30% -80%，雪貂高达100%。 而对于CD的防治，除采用疫苗进行定期的免疫接种外，尚无特异性治疗方法。而目前用于CD防制的主要为弱毒疫苗，弱毒疫苗大规模应用使得区分动物自然感染与疫苗免疫 (Diffreentiating Infected from vaccinated Animals,DIVA)变得非常困难。因此建立一种可以鉴别诊断CDV强、弱野毒感染的敏感而特异的检测方法已势在必行。目前CDV检测方法有很多，包括病毒分离培养、动物接种试验、血清学诊断方法、 RT-PCR、RT-nested PCR,Semi-nested PCR和实时荧光定量RT_PCR(Real time RT-PCR)等。 其中病毒分离和动物试验不同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不足；常规的血清学试验又很难鉴别⑶V野毒感染和疫苗接种，而Real time RT-PCR方法对实验仪器的要求很高。虽然单克隆抗体技术用于诊断在一定程度上弥补了这一缺陷，但是基于抗原抗体反应的检测技术仍有一定的局限性(即敏感性不够高等)，如胶体金检测技术。上述方法或多或少存在缺陷，很难适合于基层实验室的快速准确检测。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)方法是日本学者Notomi等在2000年发明的一项恒温核酸扩增新技术。该技术特异性强、灵敏度高、成本低廉，特别适合在现场和基层部门应用。关于⑶V的RT-LAMP方法已有报道，但均不能用于⑶V野毒株和疫苗株的鉴别。为此，本研究建立了无需特殊的仪器、适合基层实验室使用的快速、灵敏、特异、准确，且可用于CDV野毒株和疫苗株进行鉴别诊断的RT-LAMP方法
发明内容
本发明所要解决的结束问题是克服现有技术的不足，提供一套可用于检测犬瘟热病毒野毒株的RT-LAMP引物。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的本发明的一套用于区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的RT-LAMP引物，其特征在于所述RT-LAMP引物包括一对外引物和一对内引物，其中，所述的外引物的序列为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示，所述内引物的序列分别为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。本发明还提供了一种用于区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的方法，其特征在于包括以下步骤配制25 μ L反应体系10 μ M引物F3和Β3各0.5 μ L，10 μ M引物FIP和BIP各 5 μ L,2. 5mM dNTPs 2. 5 μ L, 25mM MgCl2 5 μ L,5M Betaine 2. 5 μ L, 10 X ThermoBuffer
2.5 μ L, Bst DNA聚合酶20U,模板2 μ L,用去离子水补足25 μ L ;其中，引物F3和Β3为外引物，其序列分别为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示; 引物FIP和BIP为内引物，其序列分别为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示;PCR 反应程序62°C 45min ；80°C 2min ；观察取5μ L PCR产物，经I %琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。进一步的，本发明提出了一种区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的试剂盒，其特征在于包含本发明所述的引物。更进一步的，本发明提出了所述的引物在制备区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株感染试剂中的应用。及所述的试剂盒在制备区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株感染试剂中的应用。及所述的引物在制备检测犬瘟热病毒野毒株或疫苗株试剂中的应用。及所述的试剂盒在制备检测犬瘟热病毒野毒株或疫苗株试剂中的应用。本发明根据GenBank中⑶V H基因序列，设计RT-LAMP引物(因为H基因序列存在的差异是CDV基因型分类依据，所以根据H基因的碱基差异设计了专门针对CDV野毒株的RT-LAMP引物)，包括一对外引物F3/B3 (SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)，一对内引物 FIP/BIP(SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示)，以样品的cDNA为模板，利用Bst DNA聚合酶，在62°C恒温条件下进行扩增。该方法可检测出不同基因型的CDV野毒株，检出极限为
3.5TCID50的CDV ;特异性试验表明，该方法对CDV疫苗株、CPV以及其他常见犬源性病毒均无扩增反应。该方法无需特殊仪器，是一种适用于基层的快速、简便的CDV野毒株鉴别方法。以本发明所设计的引物采用RT-LAMP检测方法对各种基因型的CDV野毒株进行检测，检测结果均为阳性，而对CDV弱毒疫苗株、CPV以及其他常见犬源性病毒检测结果均为阴性。应用本发明引物序列采用RT-LAMP检测方法，可以非常准确的鉴别出CDV野毒株，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。本发明所设计的引物序列在犬瘟热早期检测和快速诊断中具有重要意义。
图I为RT-LAMP敏感性试验结果；I DL 2000 DNA Marker ；2 10_1 ；3 :1(Γ2 ；4 :1(Γ3 ；5 :1(Γ4 ；6 :1(Γ5 ；7 :1(Γ6 ；8 :阴性对
图2为RT-LAMP特异性试验结果；I CPV 模板；2 =CAV-I 模板；3 =CAV-II 模板；4 :CDV 模板；5 DL 2000 DNA Marker图3为RT-LAMP重复性试验结果。I DL2000 DNA Marker ；2~4 :不同代次的⑶V野毒株细胞培养物，同一时间提取 RNA模板；5-7 同一 CDV野毒株细胞培养物，分别在3个时间提取RNA模板
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例II材料和方法I. I病毒株和待检材料Asia-I型和Asia-II型⑶V野毒株XDV弱毒疫苗株、CPV株、I型犬腺病毒(CAV-I) 株、II型犬腺病毒(CAV-II)株和狂犬病毒(RV)株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所经济动物组保存。待检材料包括56份从东北地区不同养殖场送检的临床病例样品。I. 2引物设计与合成参照GenBank中Q)V H基因序列，利用在线软件Primer Explorer V4作为辅助， 设计RT-LAMP引物，其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP (表I)。表IRT-LAMP引物序列
_引物序列(5，-3，)_
F3 GCCTGTATTGGTCTCTGAG (SEQ ID NO: I)
B3 CTCCG TTCAGTATAACCGG ( SEQID NO: 2)
FIP TGCACATAGGGTAGGATTTTCT-
GAACAAGAGGAGCAAAAAAACT ( SEQ ID NO: 3)
BIP AGTTGCCTTCTTATGGGCGGATG-
TTAAGTTGAAGGTCAATGC( SEQ ID NO: 4)I. 3病毒RNA提取和cDNA合成I. 3. IRNA 的提取用QIAamp Viral RNA Kit提取试剂盒(QIAgen公司)提取病毒RNA，具体操作方法参照说明书进行。I. 3. 2cDNA 的合成
取1“1^病毒1 應，加入到2(^1^反转录反应体系中，内含44 1^ 5XRT Buffer、2yL dNTP Mixture (各 IOmM)、50pmoI 9_mer 随机引物、IOU禽源反转录酶(AMVRT XL)和 20U RNA 酶抑制剂(HPRI)，42°C水浴lh，最后70°C 15min灭活反转录酶。I. 4RT-LAMP 方法的优化I. 4. I镁离子浓度的优化以⑶V全长cDNA为模板，镁离子的浓度在2. 5 6. 5mM,以O. 5mM递增，每个反应重复3次。反应条件为62°C 60min,80°C 2min，产物于2%琼脂糖凝胶电泳中观察。1. 4. 2引物浓度的优化由于外弓丨物对实验结果影响很小，所以实验中固定外弓丨物浓度，对内引物浓度进行梯度稀释(O. 8μΜ、1. 2μΜ、1. 6μΜ和2. O μ Μ)，每个浓度的引物重复3个反应，产物于 2%琼脂糖凝胶电泳中观察。I. 4. 3反应温度的优化在完成以上所有条件优化基础上进行反应温度优化。反应温度从61 °C 65°C，以 I°C依次递增，每个温度重复3次反应，产物于2%琼脂糖凝胶电泳中观察。I. 5扩增产物的检测反应结束后，取6 μ L RT-LAMP扩增产物，于2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。I. 6RT-LAMP的敏感性试验将104_ 6TCID5tl的⑶V野毒株细胞培养物用灭菌的去离子水进行连续10倍梯度稀释，分别提取RNA反转录后，运用优化的RT-LAMP方法进行检测。L 7RT-LAMP的特异性试验提取CDV 疫苗株、Asia-I 型和 Asia-ΙΙ 型的 CDV 野毒株、CPV、CAV-I、CAV_II 和 RV 等病毒核酸，按照所建立的CDV RT-LAMP检测方法进行特异性试验。同时把CDV株F3和B3 之间的扩增条带切胶回收，插入PMD18-T载体，然后测序验证。应用DNAStar软件对序列进行分析，并在GenBank中对序列进行BLAST分析，用以验证扩增产物的特异性。I. 8RT-LAMP的重复性试验取等量的3份不同代次的CDV株细胞培养物，提取RNA，反转录后，进行RT-LAMP检测，用以检测批内重复性。取等量的3份不同代次的CDV毒株细胞培养物，不同时间提取病毒RNA，反转录后，在同一反应条件下进行独立的RT-LAMP，用以检测批间重复性。2 结果2. I优化的RT-LAMP反应条件通过对RT-LAMP反应条件的优化，确定最佳的反应体系为反应体系为25 μ L : 1(^]\1引物卩3和83各0.54 1^，1(^]\1引物？1 和81 各54 1^，2.51111 dNTPs 2. 5μ L,25mM MgCl2 5μ L,5M Betaine 2. 5 μ L, IOXThermo Buffer 2. 5 μ L, Bst DNA 聚合酶 20U，模板
2μ L，用去离子水补足25 μ L。反应条件为62°C 45min ；80°C 2min。2. 2RT-LAMP 的敏感性运用优化的RT-LAMP方法进行检测，检测为阳性的最低稀释度为10°_6(3. 5TCID50) (图I所示)。2. 3RT-LAMP 的特异性所建立的⑶V RT-LAMP检测方法可以检测出不同基因型的⑶V野毒株，而对⑶V 弱毒疫苗株、CPV、CAV-I, CAV-II和RV检测结果均为阴性(图2所示)。测序结果分析表明，扩增的214bp的片段与CDV的H基因序列(FJ409464)同源性为100%。2. 4RT-LAMP 的重复性2. 4. I批内重复性取不同代次的CDV野毒株细胞培养物，同一时间提取RNA，反转录后，在同一反应条件下进行独立的RT-LAMP检测，3次检测结果无明显差异(图3所示)。2. 4. 2批间重复性取同一 CDV野毒株细胞培养物，分别3个时间提取RNA，反转录后，进行一次 RT-LAMP检测，3个重复结果无明显差异(图3所示)。
权利要求
1.一套用于区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的RT-LAMP引物，其特征在于所述 RT-LAMP引物包括一对外引物和一对内引物，其中，所述的外引物的序列为SEQ ID NO :1和 SEQ ID NO :2所示，所述内引物的序列分别为SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4所示。
2.一种用于区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的方法，其特征在于包括以下步骤配制25 μ L反应体系10 μ M引物F3和Β3各O. 5 μ L，10 μ M引物FIP和BIP各5 μ L，2.5mM dNTPs 2. 5 μ L,25mM MgCl2 5 μ L,5M Betaine 2. 5 μ L,10 X ThermoBuffer 2. 5 μ L, Bst DNA聚合酶20U,模板2μ L,用去离子水补足25 μ L ;其中，引物F3和Β3为外引物，其序列分别为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；引物 FIP和BIP为内引物，其序列分别为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示；PCR 反应程序62°C 45min ；80°C 2min ；观察取5μ L PCR产物，经I %琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。
3.—种区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的试剂盒，其特征在于包含权利要求I所述的引物。
4.权利要求I所述的引物在制备区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株感染试剂中的应用。
5. 权利要求2所述的试剂盒在制备区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株感染试剂中的应用。
6. 权利要求I所述的引物在制备检测犬瘟热病毒野毒株或疫苗株试剂中的应用。
7.权利要求2所述的试剂盒在制备检测犬瘟热病毒野毒株或疫苗株试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一套用于区分犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的RT-LAMP引物及其应用，所述RT-LAMP引物包括一对外引物和一对内引物，其中，外引物的序列为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；内引物的序列分别为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。以本发明所设计的引物采用RT-LAMP检测方法对各种基因型CDV野毒株进行检测，检测结果均为阳性，而对犬瘟热疫苗株、犬细小病毒以及其他常见犬源病毒检测结果均为阴性。应用本发明引物序列采用RT-LAMP检测方法，可以非常准确地区分CDV野毒株和CDV疫苗株，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。
文档编号C12Q1/68GK102586485SQ20121006346
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者刘大飞, 刘春国, 张洪英, 戚亭, 曲连东 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所