专利名称：焦磷酸测序法检测cda基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
吉西他滨是临床上用于治疗胰腺癌，肺癌，乳腺癌和膀胱癌等肿瘤的一种抗代谢药物。吉西他滨系胞嘧啶核苷衍生物，通过人平衡型核苷载体I (hENTl)进入细胞内。在胞浆内，吉西他滨被脱氧胞苷激酶(dCK)磷酸化为双氟脱氧胞苷一磷酸(dFdCMP)，后者继续活化为双氟脱氧胞苷二磷酸(dFd⑶P)及双氟脱氧胞苷三磷酸(dFdCTP)活性产物。dFd⑶P抑制核苷酸还原酶(RR)的活性，使细胞内DNA合成与修复所必需的原料脱氧二磷酸核苷减少，从而进一步抑制DNA的合成；dFdCTP是一种DNA多聚酶抑制剂，抑制DNA链的延长，使DNA复制提前终止，它的浓度增加还将抑制dCMP脱氨酶，减少dFdCMP代谢，使药物活化增加，自我强化其细胞毒的作用。所以，吉西他滨是通过细胞内多靶位作用而抑制DNA合成的。胞苷脱氨酶(CDA)是吉西他滨主要代谢酶，使吉西他滨下发生不可逆的脱氨基反应，生成相对无活性的代谢产物双氟脱氧尿苷(dFdU)而排出细胞外；吉西他滨另一次要代谢途径是中间产物，dFdCMP在dCMP脱氮酶的作用下生成双氟一磷酸脱氧尿苷，进而生成双氟脱氧尿苷而失活。肿瘤组织中CDA高表达，吉西他滨耐药的原因之一，而CDA酶活性降低，则有可能使吉西他滨体内浓度增高，毒副反应增加。CDA基因2号外显子区存在208G >A(rs60369023，CDA*3，Ala70Thr)突变，该突变位于CDA活性区域附近的SNP可影响蛋白结构中a螺旋的形成，进而影响CDA的活性，导致CDA对吉西他滨的脱氨基作用大大降低。CDA*3携带者约占人群的8 10%。突变纯合子CDA*3/*3和突变杂合子CDA*l/*3体内CDA的脱氨基活性分别为CDA*1/*1野生型纯合子的12%和25%，CDA*3/*3突变型纯合子肿瘤病人体内吉西他滨的血药浓度为CDA*1/*1野生型纯合子的5倍。携带CDA*3/*3的胰腺癌患者对吉西他滨的药物毒性反应有明显的加重，如粒细胞减少症、血小板减少症、口腔炎、皮疹等。进一步的研究发现，CDA*3可导致胰腺癌患者的吉西他滨在体内的清除减少，血清内吉西他滨浓度升高，血清CDA活性下降，代谢产物dFdU浓度减低，体内吉西他滨的清除率降低。当CDA*3/*3和CDA*l/*3突变携带者联合钼类化疗时，几乎肯定将发生骨髓抑制、3级或3级以上粒细胞减少症，需严密关注血相。综上所述，CDA基因多态性可作为吉西他滨不良反应预测的有效指标，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CDA基因多态性的试剂盒将为吉西他滨的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求
发明内容
本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测CDA基因(SEQ ID NO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测吉西他滨个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物上游引物5/-AGG GTG CAA CAT AGAAAA T-3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-TTG CCC TGAAAT CCT TGT ACC-3' (SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物5/ -TGT GCT GAA CGGACC-3' (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测CDA基因多态性的方法，包括如下步骤(I) DNA 提取；(2)聚合酶链反应配制50μ I PCR扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物
O.5μ 1，下游引物O. 5μ l，rTaqO. 5μ 1，水40μ 1，模板2μ I ;按照下面的循环参数设置扩增仪95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30S,52°C 30S,72°C 30S，进行35个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对CDA rs60369023 (G > A)目标序列进行分析和检测，该目标序列包括野生型 GGACCGCTATCC(SEQ ID NO. 5)和突变型 GGACCACTATCC (SEQ ID NO. 6);扩增出的片段长为90bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对CDA基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上吉西他滨个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明的CDA rs60369023(GG)焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例ICDA-pyroF(上游引物)5' -AGG GTG CAA CAT AGA AAA T-3' (SEQ IDN0. 2)；CDA-pyroR(下游引物)5/ -TTG CCC TGA AAT CCT TGT ACC-3' (SEQ IDN0. 3)；测序引物5'-TGT GCT GAA CGG ACC-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取
I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一11"生标识做好标记；I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管； I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；1.7 13，OOOrpm 室温离心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；I. 15 13，OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；I. 17移取300uL 75 %乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；I. 18 13，OOOrpm 室温离心 Imin ；I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；I. 21 目测沉淀大小，加入 50 IOOul DNA Rehydration Solution 至沉淀；I. 22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；I. 24保存核酸标本至4°C冰箱；2.聚合酶链反应2. I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物5' -AGG GTG CAA CAT AGAAAA T-3/ ； 下游引物5' -TTG CCC TGAAAT CCT TGTACC-3'； 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物5'-TGT GCT GAA CGGACC-3'。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测CDA基因多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA提取； (2)聚合酶链反应 配制 50μ IPCR 扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1，上游引物O. 5 μ 1，下游引物O. 5 μ 1，rTaqO. 5μ 1，水40μ 1，模板2μ I ;循环程序为-.95 V 5min预变性；依次在950C 30S,52°C 30S,72°C 30S，进行35个循环；72°C保持5min，最终保持在4°C,得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒及方法。所述试剂盒CDA基因多态性进行检查，具体是指rs60369023(G＞A)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2-4所示的引物。本发明的试剂盒及方法，可以实现准确、快捷、高通量CDA基因多态性的检测，从而达到对其底物吉西他滨实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102643907SQ201210094440
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏