专利名称：一株产西索米星突变菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于抗生素制药领域，涉及一株产西索米星突变菌株，应用于抗生素制造。
背景技术：
西索米星主要用于治疗由敏感的革兰阴性杆菌所致的严重感染，如铜绿假单胞菌、变形杆菌属(D引哚阳性和阴性)、大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属及枸橼酸杆菌属等所致的新生儿脓毒症、败血症、中枢神经系统感染(包括脑膜炎)、尿路生殖系统感染、呼吸道感染、胃肠道感染、腹膜炎、胆道感染、皮肤或骨骼感染、中耳炎、鼻窦炎、软组织感染、李斯特菌病等。小单孢菌可产生丰富的次级代谢产物，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等。这些小单孢菌分布奇特，生长缓慢且细胞壁结构特殊，故研究进展缓慢。因此，要得到高产稳产的西索米星产生菌，极其困难。由于缺乏通用的基因操作系统， 小单孢菌遗传操作困难，使得对其分子生物学的研究也大大落后于链霉菌依纽小单孢菌是西索米星产生菌。西索米星属氨基糖苷类抗生素，已在临床上应用了近半个世纪，是中国、乃至全世界抗感染必备的基本药物。西索米星产生菌属多组分代谢产物，但西索米星是其主要组分，其结构特点是分子中含有一个双键。西索米星 (Sisomicin)是进一步合成抗耐药菌药物奈替米星(Netilmicin)的母体；最新研究发现， 氨基糖苷类抗生素还具有抗HIV等功效。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，生物合成基因的研究，次级代谢产物生产水平提高的研究等，都极具意义。尽管人们对小单孢菌和西索米星的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果， 但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高了近万倍，而西索米星四十年中仅提高了几十倍，差别非常悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌细胞工程， 链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素研究等方面取得了一定的进展，但在小单孢菌中的应用进展缓慢。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高产西索米星的突变株。本发明所述突变株为依纽小单抱菌(#icr0 0/ 05770ra inyoensis) HP 388,已于 2012年3月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为 CGMCC No. 5921。本发明还提供了所述的产西索米星的突变株的发酵方法，依纽小单孢菌 (#icromonospora inyoensis) HP388发酵前先用稀释平板法分离出单菌落后，再转接于斜面培养基，35-40°C培养2-5天；再以4-6%的接种量接种于种子培养基，35_40°C摇床培养18-48 h，转速为260-300rpm，然后按8-12%接种量转接于发酵培养基，35_40°C摇床培养4-5天，转速为260-300rpm ;所述斜面培养基以重量百分数计，可溶性淀粉1.0-2. 0%，麸皮 I. 0-2. 0%, MgSO4 6H20 0. 01-0. 05%, KNO3 0. 1-0. 5%, K2HPO4 3H20 0. 01-0. 05%, NaCl
0.01-0. 09%, CaCO3 0. 1-0. 50%,琼脂I. 8-2. 2%,余量为水，pH7_8 ;种子培养基以重量百分数计，葡萄糖0. 1-1. 0%，淀粉I. 0-2. 0%，玉米粉0. 5-2. 5%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黄豆饼粉
0.5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%,余量为水，pH6. 5-7. 5，发酵培养基以重量百分数计，淀粉3. 0-6. 0%，玉米粉I. 0-2. 0%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黄豆饼粉I. 0-4. 0 %， KNO3 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%，余量为水， pH6. 5-7. 5。本发明还提供了所述的突变菌株HP388在制备抗菌药物中的应用。本发明通过以下反复持续筛选与驯化，最终得到了依纽小单孢菌HP388 :菌株 HP388的驯化筛选，需要多个循环，每个循环主要包括以下过程
出发菌株T125 (依纽小单孢菌澄江变种T125)—分离纯化一菌丝培养一原生质体制备 —原生质体融合一耐自身代谢产物(西索米星)梯度筛选一突变株生产力测定一正突变菌株，
通过反复筛选得到菌株HP388，通过培养基及培养条件优化一小试一中试一工业化放大，得到西索米星产品。依纽小单孢菌HP388 (CGMCC No. 5921)的培养特征本菌株斜面外观呈深紫红色。 加入梯度自身代谢产物西索米星，浓度控制在5(Tl000 u/mL左右，可抑制其色素的产生，经驯化后，最终可变成不产色素的菌株，在斜面呈淡黄色。本发明采用工业微生物育种方法，对依纽小单孢菌T125进行选育和筛选，得到西索米星发酵稳定高产的突变株。该菌株已于2012年3月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号， 保藏编号为CGMCC No. 5921。突变菌株HP388的最显著特征是发酵单位高，生产工艺稳定，便于控制，耗氧量小，成本低，污染小，产品质量好。
图I依纽小单孢菌HP388西索米星生物合成基因簇。图2为依纽小单孢菌388染色体DNA与质粒DNA酶切效果电泳检测图；其中M 入-AcoT14 marker ； I HPl 102 染色体；2 :酶切后的 HP1102 染色体 /Sau^A I ；3 :双酶切 Supercos-l/AXe I /BamW I ；4 :单酶切 Supercos-l/AXe I。图3为西索米星生物合成基因簇目标克隆子PCR筛选确定图；其中M:DL5000 marker ；1 :经M1/M2引物扩增确定的克隆子；2 :经S1/S2引物扩增确定的克隆子；3 :经Cl/ C2引物扩增确定的克隆子。图4为120301批西索米星的HPLC分析结果。图5为120302批西索米星的HPLC分析结果。图6为120303批西索米星的HPLC分析结果。
具体实施例方式实施例I :本发明的菌株HP388的驯化筛选，至少需要10个循环以上，每个循环主要包括以下过
程
取出发菌株T125 (依纽小单孢菌澄江变种T125)培养好的斜面，加入3ml无菌水，用接种针轻轻地将孢子刮下，取出孢子悬液，于振荡器上充分震荡，使分散成单孢子，然后进行梯度稀释(10°、10' 10' 10' 10' 10' 10' 10〃)，涂布平板，紫外线照射(10、20、30、40、50 秒)后，于37°C培养，分离单菌落。当单菌落生长到可以辨别其特征后(25天)，挑取不同形态特征的菌落，进行深层发酵培养(6天)，发酵毕，检测发酵单位，保存高单位者，供下一步使用。取以上优质菌株，培养菌丝，制备原生质体，采用单亲灭活自身原生质体融合法 (自身原生质体融合，将一份灭火后制备原生质体，一份不灭火活制备原生质体，然后两份混合，即所谓单亲灭火自身原生质体融合)进行原生质体融合，涂布平板，于37°C培养到长好菌落后(25天)，刮下孢子，如上制备单孢子悬液，梯度稀释，涂布平板，以不同梯度的西索米星溶液覆盖，使终浓度依次达到100、200、300、——1000iig/ml (该过程简称耐自身代谢产物梯度筛选培养)，于37°C下培养，直至长出单菌落；取高抗性菌落进行斜面松弛培养， 然后制备单菌落，再次进行耐自身代谢产物梯度培养，反复3次。再进行单菌落分离，对不同形态特征的菌株进行生产力测定，取发酵高单位者保存备用，至此，第一循环结束，并进入下一循环。重新制备单孢子悬液，进行紫外线诱变，单亲灭火法自身原生质体融合，耐自身代谢产物梯度筛选，生产力测定，如此循环往复不断提高西索米星的发酵水平，最终确定为依纽小单孢菌HP388，并继续生产发酵的优化。突变菌株依纽小单孢菌HP388经培养基及培养条件优化一小试一中试一工业化放大一制备西索米星产品，发酵单位稳定，能够满足产业化生产，最高发酵单位可达1600 u/mL以上，比出发菌株最高发酵单位仅197 ug/mL，提高了 8倍以上。实施例2突变菌株HP388西索米星生物合成基因簇的获得及其DNA序列测定 I材料
1.1菌种与质粒依纽小单孢菌HP388，疋co/i DH5a及粘粒载体
Supercos-I (购自上海生工)；疋co7i LE392购自Stratagene公司。1.2试剂限制性内切酶、蛋白酶K、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP酶)、T4 DNA连接酶和Taq酶均购自TAKARA公司；溶菌酶购自上海生工；噬菌体包装蛋白抽提物 (Gigapack III XL packaging extract)购自 Stratagene 公司。1.3培养基细菌培养基LB，根据需要添加氨苄青霉素(终浓度为 100 u g/ml)和卡那霉素(终浓度为25 u g/ml);依纽小单孢菌培养基。文库构建法
(a)依纽小单孢菌基因文库的构建粘粒载体Supercos-I以限制性内切酶船6>I完全消化并去磷酸化，得到一条约7. 9kb的单一条带(图2)。再以限制性内切酶ifeMl I完全消化，电泳检测得到I. Ikb和6. Skb的两个片段(图2)，回收该两个片段，低温保存备用；
(b)提取完整的依纽小单孢菌HP388染色体DNA，电泳检测得到一条分布在IOOkb左右的单带，达到满足构建基因组粘粒文库的要求。利用识别4个核苷酸的限制性内切酶 Sau3k I对提取得到的染色体DNA进行部分消化，控制大小介于3(T40kb左右(图2)，所产生的DNA片段具有与载体相匹配的粘性末端，回收经过消化后的的染色体DNA，低温保存备用。(c)以(a)/ (b)=l/5左右的比例混合，以T4DNA连接酶进行过夜连接，然后取5
连接产物(约Iu g)，用噬菌体包装蛋白进行体外包装，并侵染疋coli LE392，最后涂布于含卡那霉素(终浓度为25 ii g/ml)的LB平板上，37°C培养过夜，得到了大约12500个转化子。生物合成基因簇筛选
依纽小单孢菌西索米星生物合成基因簇的筛选以GenBank已公布的FJ160413和 AJ628149基因簇为模板，设计三对筛选探针引物M (M1/M2)，S(S1/S2)和C(C1/C2)
表I实施示例所涉及的引物
权利要求
1.一株产西索米星的突变株，其特征在于，所述突变株为依纽小单孢菌 (Micromonospora inyoensis) HP 388,已于2012年3月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5921。
2.一种如权利要求I所述的产西索米星的突变株的发酵方法，其特征在于，依纽小单孢菌iMicromonospora inyoensis) HP388发酵前先用稀释平板法分离出单菌落后,再转接于斜面培养基，35-40°C培养2-5天；再以4-6%的接种量接种于种子培养基，35_40°C摇床培养18-48 h，转速为260-300rpm，然后按8-12%接种量转接于发酵培养基，35-40°C摇床培养4-5天，转速为260-300rpm ;所述斜面培养基以重量百分数计，可溶性淀粉I. 0-2. 0%， 麸皮 I. 0-2. 0%, MgSO4 6H20 0. 01-0. 05%, KNO3 0. 1-0. 5%, K2HPO4 3H20 0. 01-0. 05%, NaCl 0. 01-0. 09%, CaCO3 0. 1-0. 50%,琼脂I. 8-2. 2%,余量为水，pH7_8 ;种子培养基以重量百分数计，葡萄糖0. 1-1. 0%，淀粉I. 0-2. 0%，玉米粉0. 5-2. 5%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黄豆饼粉 0. 5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%,余量为水，pH6. 5-7. 5，发酵培养基以重量百分数计，淀粉3. 0-6. 0%，玉米粉I. 0-2. 0%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黄豆饼粉I. 0-4. 0 %， KNO3 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%，余量为水， pH6. 5-7. 5。
3.如权利要求I所述的产西索米星的突变株在制备抗菌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种产西索米星的突变株，应用于抗生素制造，属于抗生素制药领域。所述突变株为依纽小单孢菌(Micromonosporainyoensis)HP388，已于2012年3月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.5921。本发明的突变菌株HP388的最显著特征是发酵单位高，生产工艺稳定，便于控制，耗氧量小，成本低，污染小，产品质量好。
文档编号C12R1/29GK102618473SQ201210099020
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者宋逸婷, 张国华, 沈斌彬, 洪文荣, 黄俊龙 申请人:浙江震元制药有限公司, 福州大学