专利名称：硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途的制作方法
硫酸乙酰肝素粘多糖 裂解酶及其用途本申请为申请日为2006年11月3日、申请号为2006800502567、发明名称为“硫
酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途”的分案申请。相关申请的交叉引用本申请是2005年11月3日提交的美国申请序号11/265,908的部分连续申请，并要求该美国申请的优先权。
背景技术：
肝素和硫酸乙酰肝素代表以连接至己糖醛酸的D-葡糖胺的线性多糖为特征的一类粘多糖(Linhardt, R. J. (1991)Chem. Ind. 2,45-50 ;Casu, B. (1985)Adv. Carbohydr.Chem. Biochem. 43，51-134)。肝素和硫酸乙酰肝素是在哺乳动物胞外基质中具有关键功能作用的碳水化合物复合物。这些多糖调节和调控重要的生化信号通路，所述信号通路作用于正常的生理过程，例如细胞和组织的形态发生、细胞-细胞相互作用以及生长和分化。这些多糖也在多种病理过程中具有关键作用，所述病理过程包括伤口愈合、肿瘤生长和转移、某些神经变性疾病和微生物引起的发病，在此仅举几个例子。现在对肝素和硫酸乙酰肝素序列的理解大多依赖于对其生物合成的研究(Linhardt, R. J. , Wang, H. M. , Loganathan, D. , and Bae, J. H. (1992)Biol. Chem. 267,2380-2387 ；Lindahl, U. , Feingold, D. , and Roden, L. (1986)Trends Biochem.Sci. 11,221-225 Jacobson, I. , and Lindahl U. (1980) J. Biol. Chem. 255, 5094-5100 ；Lindahl, U. , and Kjellen, L. (1987)in The Biology of Extracellular MatrixProteoglycans(Wight,T. N. , and Mecham R. ,eds)pp. 59-104,Academic Press,New York)。硫酸乙酰肝素与肝素在化学上相关，其出现在细胞表面上以及差不多每种哺乳动物细胞类型的胞外基质(extracellular matrix, ECM)中。这些肝素样粘多糖(heparin-like glycosaminoglycan, HLGAG)作为称作蛋白聚糖的蛋白-多糖共轭物存在于这种胞外环境中。逐渐认识到HLGAG不仅仅具有结构功能，因为它们以功能性方式与许多胞外机制的蛋白质相互作用，所述蛋白质例如层粘连蛋白、纤连蛋白、整合蛋白和胶原蛋白。这样，HLGAG(作为蛋白聚糖的一部分)协助限定基质的生物学特性。这些HLGAG也与胞外基质中的一列细胞因子样生长因子和形态发生素，通过协助其与受体的生化相互作用以及保护它们不被蛋白水解降解而相互作用。例如,如Thornton, et al. , Science 222,623-625(1983)报道的肝素控制aFGF的生物学活性，这可能是如Schreiber，et al. ,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82，6138-6142 (1985)报道的通过控制aFGF对其细胞表面受体的亲和力。根据 Gospodarowicz and Cheng, J. Cell Physiol. 128,475-484(1986) ；Rosengart,et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 152,432-440(1988)；和 Lobb Biochem.27,2572-2578(1988)的报道，肝素保护aFGF和bFGF免于被热、酸和蛋白酶降解。根据Vlodavsky, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,2292-2296 (1987)和 Folkman, et al.，Am. J. Pathol. 130, 393-400 (1988)和 Emerson et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (14)4833-8(2004)的报道，bFGF储存在胞外基质中并可通过酶(例如乙酰肝素酶)的水解活性被动员为生物活性形式。
如Yayon, et al. , Cell 64,841-848(1991)和 Papraeger, et al. , Science 252，1705-1708(1991)报道，FGF结合到硫酸乙酰肝素上是FGF结合到其位于细胞表面上的高亲和力受体的先决条件。如 Kiefer，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87,6985-6989 (1990)描述的，已发现特异的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖调节bFGF对细胞表面的结合。肝素裂解酶，例如肝素酶是能够特异性切割肝素和硫酸乙酰肝素中的主要糖苷键的一类酶。已经在肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)中鉴定了 3种肝素酶,所述肝素黄杆菌作为使用GAG的有机体也生产外切葡糖醒酸糖苷酶(exoglycuronidases)、糖苷酶、硫酸酯酶(sulfoesterases)和氨苯磺胺酶(sulfamidases)以及其他另外作用于裂解酶产生的低聚糖产物的其他酶类(Yang, et al. J. Biol. Chem. 260，1849-1857 (1987)； Galliher, et al. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 15,252-257 (1982)。这些裂解酶被称为肝素酶1(肝素酶，EC 4. 2. 2. 7)、肝素酶11(肝素酶，没有EC号)和肝素酶ΠΙ(肝素酶EC 4. 2. 2.8)。这三种纯化的肝素酶在其切割肝素和硫酸乙酰肝素的能力上不同肝素酶I主要切割肝素，肝素酶III特异切割硫酸乙酰肝素，而肝素酶II同时作用于肝素和硫酸乙酰肝素。几个拟杆菌属(Bacteroides)的种类(Saylers,et al.Appl.Environ.Microbiol.33,319-322(1977) ；Nakamura, et al.J.Clin.Microbiol. 26,1070-1071 (1988))也产生肝素裂解酶。Bohmer, et al. J. Biol. Chem. 265,13609-13617(1990)从一种未鉴定的土壤细菌中，根据明显同源性也纯化了肝素裂解酶。发明概述本发明部分地根据来自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的粘多糖(glucosaminoglycan, GAG)裂解酶后文中称为“多形拟杆菌GAG裂解酶”的发现和重组表达，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I、多形拟杆菌GAG裂解酶II、多形拟杆菌GAG裂解酶III和多形拟杆菌GAG裂解酶IV，其特别可用于肝素和/或硫酸乙酰肝素的结构特异性切割，并且在某些情况下用于硫酸软骨素和硫酸皮肤素的结构特异性切割。因此，本发明包括多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段以及多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段的组合的方法、组合物和试剂盒，用于例如对粘多糖(GAG)(例如肝素样粘多糖(heparin-likeglycoaminoglycans, HLGAG),例如肝素或硫酸乙酰肝素)的表征或修饰,或者例如对非肝素/硫酸乙酰肝素GAG(例如硫酸软骨素和硫酸皮肤素)的表征或修饰。例如，所述方法、组合物和试剂盒可用于分析和监视GAGUf^BHLGAG)的异源群体。在其他方面，所述方法、组合物和试剂盒可用于修饰GAG (例如HLGAG)的结构和/或活性。因此，一方面，本发明的特征在于多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如具有SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段；基本上与SEQ IDNOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列相同的氨基酸；或者由核酸分子编码的氨基酸，该核酸分子在严格杂交条件下与包括SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39中的氨基酸序列的核酸分子杂交，其中所述核酸编码全长多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其功能片段。在另一方面，本发明的特征在于包括一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段的组合物，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一个实施方案中，所述组合物进一步包括一种或多种HLGAG降解酶,例如除GAG裂解酶多肽以外的一种或多种肝素酶,和/或一种或多种除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的GAG裂解酶多肽。例如，所述组合物进一步包括一种或多种不饱和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶(glycuronidase);多形拟杆菌Λ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α-艾杜糖醒酸酶(iduronidase) ; β _葡糖醒酸糖苷梅(glucuronidase));硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；N-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶(heparan-N-sulfatase));芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内_N_乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I (flavobacterium heparinumheparinase I)、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素卩遼胞菌(Cytophaga heparina)或肝素土地杆菌(Pedobacter heparinum)的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶(heparinase)、噬菌体K5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。这样的组合物可用于，例如切割HLGAG (例如肝素和/或硫酸乙酰肝素)，例如表征HLGAG(例如肝素和/或硫酸乙酰肝素)的制备。 在另一方面，本发明的特征在于特异切割HLGAG (例如肝素或硫酸乙酰肝素)的方法，其包括将HLGAG与一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一个实施方案中，所述HLGAG被切割成二-、三-、四-、五-、六_、八-和/或十糖，以及例如所述方法进一步包括确定所述HLGAG的二-、二-、四-、五-、六_、八-和/或十糖的序列。在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述HLGAG与一种或多种HLGAG降解酶(例如除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽以外的肝素酶多肽或GAG裂解酶多肽)接触。例如，所述HLGAG降解酶可以是一种或多种不饱和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形拟杆菌Λ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α -艾杜糖醛酸酶；β -葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；Ν-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内-N-乙酰氨基葡糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素噬胞菌或肝素土地杆菌的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶、噬菌体Κ5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。在另一方面，本发明的特征在于用于分析HLGAG异源群体的方法，所述HLGAG例如肝素(例如UFH、LMWH和合成的肝素)和硫酸乙酰肝素，所述方法包括将所述群体与一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。因此，在一些方面，本发明涉及与分析和监视HLGAG异源群体相关的方法和产品，所述分析和监视使用一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段从而以鉴定HLGAG异源群体的结构特征(structural signature)和活性,例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。
在一些实施方案中，所述方法包括测定一组或多组HLGAG产品的结构特征，所述HLGAG与一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述方法进一步包括选择一组作为所述测定的结果。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述测定的结果与预选值例如参考标准进行比较。所述预选值可以是，例如一种或多种与HLGAG的切割相关的二 _、三_、四-、五_、六_、八-和/或十糖的存在与否或者给定值(例如摩尔％或曲线下的区域)，所述HLGAG的切割是用一种多形拟杆菌GAG裂解酶多 肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段进行的，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。对于本文描述的任何方法，可分析多形拟杆菌GAG裂解酶多肽(或者多种多肽)完全或部分消化的样品以一种或多种下列方式测定结构特征多种质谱(例如基质辅助激光解吸电离 / 飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization massspectroscopy, MALDI-MS)),核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)光谱(例如ID NMR 或 2D NMR)，凝胶电泳，毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),反相柱色谱(reverse-phase column chromatography,例如HPLC,例如具有用季铵盐动态涂敷的固定相的HPLC),离子配对HPLC(例如强阴离子交换HPLC(strong anion exchange HPLC,SAX-HPLC))。本文描述的方法进一步包括用一种或多种HLGAG降解酶消化所述样品，所述HLGAG降解酶例如除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽以外的肝素酶或肝素裂解酶多肽。例如，所述HLGAG降解酶可以是一种或多种不饱和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌Λ4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形拟杆菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α-艾杜糖醛酸酶；β-葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；Ν-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素噬胞菌或肝素土地杆菌的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶、噬菌体Κ5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。在另一方面，本发明的特征在于HLGAG制品(例如肝素或硫酸乙酰肝素制品)，所述HLGAG制品通过将HLGAG制品和一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接触而制备，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一个实施方案中，所述HLGAG制品(例如肝素或硫酸乙酰肝素制品)例如与参考标准相比，例如与市售肝素或硫酸乙酰肝素相比，或者与在多形拟杆菌GAG裂解酶多肽接触前的肝素或硫酸乙酰肝素制品相比，具有一种或多种降低的抗Xa活性和抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或增加抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其他的实施方案中，当维持或增强抗Xa活性时，降低抗IIa活性。在另外的实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。这样的制品可用于例如需要降低的抗Xa活性和/或抗IIa活性的应用中，例如将肝素或硫酸乙酰肝素用做另一个试剂例如治疗性试齐U、预防性或诊断性试剂的载体剂。因此，在一些实施方案中，所述HLGAG制品还包括除该HLGAG以外的第二试剂，例如该制品还包括一种或多种治疗性、预防性或诊断性试剂。在另一个实施方案中，所述HLGAG制品(例如所述肝素或者硫酸乙酰肝素制品)具有一种或多种增加的抗Xa活性和抗IIa活性，例如与参考标准相比，例如与市售肝素或硫酸乙酰肝素相比，或者在与多形拟杆菌GAG裂解酶多肽接触前与肝素或硫酸乙酰肝素制品相比。这样的制品可用于例如需要增加的的抗Xa活性和/或抗IIa活性的应用中，例如凝血剂和/或抗血栓形成的试剂。在另一个方面中，该发明的特征在于中和一种或多种HLGAG(例如肝素或硫酸乙酰肝素)活性的方法。该方法包括将HLGAG与一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段相接触，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段。当所述HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素时，待中和的活性 是一种或多种抗Xa活性和抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或增加抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其他的实施方案中，当维持或增强抗Xa活性时，降低抗IIa活性。在其他的实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在其他的实施方案中，维持抗Xa活性和抗IIa活性。所述HLGAG可例如离体(ex vivo)或在体内接触。因此，在一些实施方案中，该方法包括以中和受试者中抗Xa活性和/或抗IIa活性的有效量，施用一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段至受试者，例如已经施用了 HLGAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的受试者，例如已经施用了肝素或硫酸乙酰肝素以抑制凝血和/或血栓的受试者。在另一方面，本发明的特征在于在受试者内抑制血管生成的方法。该方法包括向受试者施用有效量的一种多形拟杆菌GAG裂解酶、多种多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段，例如本文描述的多形拟杆菌GAG裂解酶I多肽、多形拟杆菌GAG裂解酶II多肽、多形拟杆菌GAG裂解酶III多肽、多形拟杆菌GAG裂解酶IV多肽或其功能性片段，从而以抑制血管生成。在一个实施方案中，所述受试者患有与不需要的血管生成相关的疾病或病症。这样的病症包括，但不局限于关节炎(例如风湿性关节炎)、多种眼病(例如糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、炎症性病症(inflammatory disorders)、眼瘤(ocular tumors,例如视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))、水晶液后囊纤维化(retrolental fibroplasias)、葡萄膜炎(uveitis)，以及与脉络膜血管新生和虹膜血管新生相关的病症)和癌症(例如肿瘤生长和转移)。在另一方面，本发明的特征在于抑制受试者内不需要的细胞增殖和/或分化的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，从而抑制细胞增殖和/或分化。在一个实施方案中，所述受试者患有癌症。在另一方面，本发明的特征在于包括一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如本文描述的一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段和药用可接受载体的药用组合物。在一个实施方案中，所述一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段具有中和一种或多种HLGAG的 活性的有效量。优选地，所述HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素，并且所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段有效中和一种或多种抗Xa活性和抗IIa活性的量存在。在一些实施方案中，当维持或增加抗IIa活性时，降低抗Xa活性。优选，HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素，并且多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段是以有效中和一种或多种抗Xa活性和抗IIa活性的量存在。在一些实施方案中，当维持抗IIa活性活性时，抗Xa活性降低。在另外一些实施方案中，当维持或增强抗Xa活性时，降低抗IIa活性。在另外一些实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在另一个实施方案中，所述所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段以有效抑制血管生成的量存在。在另一方面，本发明的特征在于包含一种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽、多种多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段的组合物的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒还包括一种或多种HLGAG降解酶，例如一种或多种肝素酶多肽和/或除多形拟杆菌GAG裂解酶多肽以外的一种或多种GAG裂解酶多肽。例如，该试剂盒包含以下中的一种或多种不饱和葡萄糖醛酸水解酶(例如，肝素黄杆菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形拟杆菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡萄糖醛酸水解酶(例如哺乳动物α -艾杜糖醛酸酶；β -葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黄杆菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形拟杆菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脱硫酶；哺乳动物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳动物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；Ν-氨苯磺胺酶(例如肝素黄杆菌N-氨苯磺胺酶；哺乳动物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如内-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黄杆菌肝素酶I、肝素黄杆菌肝素酶II、肝素黄杆菌肝素酶III、肝素黄杆菌肝素酶IV也称为来自肝素噬胞菌或肝素土地杆菌的肝素酶)，哺乳动物乙酰肝素酶、噬菌体Κ5乙酰肝素裂解酶以及它们的功能片段和变体。在一个实施方案中，所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，以及一种或多种其他HLGAG降解酶在同一个组合物中。在另一个实施方案中，所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，以及一种或多种其他HLGAG降解酶在不同的组合物中。在另一个实施方案中，所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段与药学上有效的载体一起在药用组合物中。所述试剂盒还包括HLGAG，例如肝素和/或硫酸乙酰肝素。在一个实施方案中，当该试剂盒包括多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能性片段的药用组合物时，该HLGAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素也在药学组合物中，并且例如该试剂盒还包括用于中和HLGAG的一种或多种活性的指导性材料。在另一方面，本发明的特征在于编码多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或其功能片段的核酸分子。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子编码具有SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的氨基酸序列的多肽。在其他的实施方案方案中，本发明提供了具有SEQID NOs :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38所示的核苷酸序列的分离的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供与SEQ ID NOs :1、5、28或36所示的核苷酸序列基本上相同的核酸分子(例如天然存在的等位基因变体)，以及在严格杂交条件下与包含SEQ ID NOs :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子，其中所述核酸编码全长多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其功能片段。在相关方面，本发明还提供包含本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子的核酸构建体。在某些实施方案中，本发明的核酸分子有效连接至天然或异源调控序列。也包括包含本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子的载体和宿主细胞，例如适宜生产多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子和多肽的载体和宿主细胞。在另一方面，本发明的特征在于抗体及其抗原结合片段，其与多形拟杆菌GAG裂解酶多肽相互作用，或者更优选地与多形拟杆菌GAG裂解酶多肽特异结合。在另一方面，本发明提供筛选调节多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或核酸表达或活性的化合物的方法。以下详细的说明书和权利要求清晰显示了本发明的其他特性和优点。
图IA描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的DNA序列(SEQ ID NO :1)。起始甲硫氨酸密码子(ATG)加了下划线，而第二个内部甲硫氨酸密码子加了双下划线。图IB描绘了其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，并以粗体显示多形拟杆菌GAG裂解酶I的2个变体——称为M17变体(SEQ ID NO 4)和Q26变体(SEQ ID NO 23)的N-末端氨基酸残基。图2描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶I (SEQ ID NO. 2)与来自肝素黄杆菌的肝素酶I (SEQ ID NO 24)和共有序列(SEQ ID NO 26)的 BLAST 比对。图3A描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的Ml7变体的DNA序列(SEQ ID NO 3)和以阴影显示的甲硫氨酸17(M17)的ATG密码子。图3B描绘了其预测的氨基酸序列(SEQDD NO 4)。图4A描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的Q26变体的DNA序列(SEQ ID NO 22)。图4B描绘了其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO :23)。图5A描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶II的DNA序列(SEQ ID NO :5)。图5A也描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶II的核苷酸序列的部分，其未出现在多形拟杆菌GAG裂解酶II的2种变体中，S卩，称为"Q23变体"(SEQ ID NO :7)其删除部分以下划线显示，和"K169变体"(SEQ ID NO :9)，其删除部分以阴影显示。图5B描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶II的预测氨基酸序列(SEQ ID NO 6)，并且显示Q23变体(SEQ ID NO 8)和K169变体(SEQ ID NO 10)的氨基酸序列的删除部分。图6描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶II (SEQ ID NO 6)与来自肝素黄杆菌的肝素酶m(SEQ ID NO :25)和共有序列(SEQ ID NO 27)的 BLAST 比对。图7是MALDI-MS质谱的图示。A版(panel A)描绘了未处理的ATIII五糖ARIXTRA 的峰，也显示了其结构。B版描绘了用重组多形拟杆菌GAG裂解酶I消化ARIXTRA .后产生的峰。消化后产生了五硫酸化三糖产物，也显示了其结构。图8描绘了编码从多形拟杆菌克隆到的GAG裂解酶III基因序列的DNA序列(SEQID NO 28)。以粗体标注起始甲硫氨酸(ATG)和终止(TAA)密码子。对应于谷氨酸23 (Q23)的密码子(CAG)加了下划线。图9描绘了从多形拟杆菌克隆到的GAG裂解酶III的氨基酸序列(SEQ ID NO 29)。预测的输出信号序列加了下划线。为氨基末端变体的开端划定界限的谷氨酰胺23(Q23)涂有灰色阴影。图10描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶III (SEQ ID NO 29)的氨基酸序列——从顶端开始的所列第三项一与相关的肝素/硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶的比对。以深灰色表示相同的残基，浅灰色表示相似的残基。BT表示多形拟杆菌，ra表示肝素黄杆菌。
图11描绘了从多形拟杆菌分离的GAG裂解酶III (BT GAG裂解酶)、从肝素黄杆菌分离的肝素酶II (FH肝素酶II)和从肝素黄杆菌分离的肝素酶III (FH肝素酶III)的酶活性。该酶活性表示为所述3种测试的酶底物的特异性。4种测试的“肝素样”底物是猪小肠肝素、2种不同的硫酸乙酰肝素(称为“HI”和HO”，每个在硫酸化作用程度上变化)和低分子量药用肝素即依诺肝素(enoxaparin)。所示酶活性描绘了根据在232nm处吸收值评估的，在彻底消化中，针对这些底物的总的切割活性。图12描绘了从多形拟杆菌分离的GAG裂解酶III (BT GAG裂解酶)和从肝素黄杆菌分离的肝素酶II (FH Hep II)的切割活性。该切割活性表示测试酶的底物特异性。实际的切割产物通过毛细管电泳分级，并通过在232nm处的吸收值(Y轴)监视。实线描绘了 BTGAG裂解酶，而虚线描绘了 Hep II。
图13描绘了编码多形拟杆菌GAG裂解酶IV的DNA序列(SEQ ID NO 36)。起始甲硫氨酸密码子(ATG)和终止密码子为粗体，而对应于天冬氨酸20的第二密码子(GAC)加了下划线。图14描绘了具有加了下划线的信号序列的其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO37)。另外，称为D20变体(SEQ ID NO 38)的多形拟杆菌GAG裂解酶IV变体的N-端氨基
酸残基以阴影表示。图15描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶IV (SEQ ID NO 36)的氨基酸序列——从顶端开始的所列第三项一与相关的肝素/硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶的比对。以深灰色表示相同的残基，浅灰色表示相似的残基。BT表示多形拟杆菌，ra表示肝素黄杆菌。图16描绘了多形拟杆菌GAG裂解酶IV对3种不同底物的底物特异性，所述底物即是未分级的肝素Ofeparin)和硫酸乙酰肝素(HS)的2种称为“H0-HS”和“HI-HS”的级分。详细描述鐘述本公开描述了来自多形拟杆菌的活性多形拟杆菌GAG裂解酶的重组表达，其对于GAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素粘多糖及其衍生物的修饰和表征特别有用。例如，本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶是现有化学-酶促方法的补充工具，所述方法用于以结构特异的方式切割GAG，例如肝素和硫酸乙酰肝素多糖(以及在一些情况下的其它GAG，例如硫酸软骨素和硫酸皮肤素)。GAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素的结构特异切割可用于，例如确定异源GAG制品中的GAG结构。另外，切IllJ可用于，例如从GAG中生产较低分子量的多糖。因此，多形拟杆菌GAG裂解酶可用于产生，例如肝素和硫酸乙酰肝素衍生的寡糖。这样的肝素和硫酸乙酰肝素衍射的寡糖具有诊断、预防和治疗潜能。另外，本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶也在例如与血管生成相关的疾病中具有预防和治疗潜能。所述多形拟杆菌GAG裂解酶进一步在体外、离体和/或体内可用于中和肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗凝血和/或抗血栓形成活性。所述多形拟杆菌GAG裂解酶I序列(图1，SEQ ID NO 1)包括潜在的非翻译区在长度上大约有1251个核苷酸，包含大约1179个核苷酸的预测的甲硫氨酸起始的编码序列，其中包括终止密码子(在图I中指定为SEQ ID NO :1编码的核苷酸)。该假定的编码序列编码392个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO :2)。其中氨基末端开始于残基17 (M17)的甲硫氨酸的变体可用于生产重组蛋白质。氨基末端开始于残基17的甲硫氨酸(M17)的变体也可用于产生重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的M17变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图3B(SEQID NO 4)和3A(SEQ ID NO 3)中。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx, DsbC, NusA和生物素也可用于获得该酶。氨基末端开始于残基Q26的谷氨酰胺的另一个变体也可用于生产重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的Q26变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图4B(SEQID NO :23)和4A(SEQ ID NO :22)中。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx, DsbC, NusA和生物素也可用于获得该酶。多形拟杆菌GAG裂解酶I与从肝素黄杆菌得到的肝素酶I，至少在一级氨基酸序列水平上共享结构特征(图2)。多形拟杆菌GAG裂解酶II基因序列(图5，SEQ ID NO 5)包括终止密码子(在图5A中指定为SEQ ID NO 5编码的核苷酸)在内有大约2001个核苷酸长。该编码序列编码666个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO 5B)。氨基末端开始于残基23 (Q23)处的谷氨酰胺的变体也可用于生产重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶I的Q23变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图5B(SEQID NO 8)和5A(SEQ ID NO 7)中。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA和生物素也可用于获得该酶。缺失开始于残基169 (K169)处的赖氨酸而结束于残基186处的谷氨酸的另一个变体也可用于生产重组蛋白质。编码多形拟杆菌GAG裂解酶II的K169变体的氨基酸序列和核苷酸序列分别描绘于图5B(SEQ ID NO 10)和5A(SEQ ID NO 9)中。多形拟杆菌GAG裂解酶II蛋白质与从肝素黄杆菌得到的肝素酶III，至少在它们各自的一级氨基酸序列水平共享许多结构特征。多形拟杆菌GAG裂解酶III序列(图8，SEQ ID NO 28)大约2690个核苷酸长(包括非翻译序列)并包含大约2622个核苷酸的预测的甲硫氨酸起始的编码序列，其中包括终止密码子。起始和终止密码子以粗体显示在图8中。该编码序列编码873个氨基酸的蛋白质(在图9中的SEQ ID NO. 29)。氨基末端开始于谷氨酰胺残基23 (Q23)的变体也可用于生产重组蛋白质。该变体的核苷酸序列描绘于SEQ ID NO :33中，而该变体的氨基酸序列显示于SEQ ID N0:34中。谷氨酰胺23残基在图9中加了下划线，而在图10中显示为灰色阴影。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白，以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC, NusA和生物素也可用于获得该酶。多形拟杆菌GAG裂解酶III与从肝素黄杆菌得到的肝素酶II共同包含一些结构特征和底物特异性。多形拟杆菌GAG裂解酶III蛋白质具有对肝素和硫酸乙酰肝素两者的底物特异性。另外，其能够切割硫酸软骨素和硫酸皮肤素。
多形拟杆菌GAG裂解酶IV序列(图13，SEQ ID NO 36)大约2109个核苷酸长。起始和终止密码子在图15中粗体表示。该编码序列编码702个氨基酸的蛋白质(图14中的 SEQ ID NO 37)。
氨基末端开始于氨基酸残基20(D20)处的天冬氨酸的变体也可用于生产重组蛋白质。该变体的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO :38中，而该变体的氨基酸序列显示在SEQ IDNO 39中。天冬氨酸20残基的密码子在图13中加了下划线，而天冬氨酸20在图14中显示为灰色阴影。另外，已产生6X组胺酸融合蛋白以利于纯化。包含不同的纯化标签，例如GST、MBP、Trx、DsbC, NusA和生物素也可用于获得该酶。多形拟杆菌GAG裂解酶IV蛋白质包含与从多形拟杆菌得到的其它GAG裂解酶或从肝素黄杆菌得到的肝素 酶相似的有限序列。另外，多形拟杆菌GAG裂解酶IV蛋白质具有与从多形拟杆菌得到的其它GAG裂解酶或从肝素黄杆菌得到的肝素酶不同的底物特异性。例如，其切割在科学文献中报道的、通常在大部分天然肝素和/或硫酸乙酰肝素通常不出现的二或四糖。由于本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶多糖可以调节肝素和/或硫酸乙酰肝素介导的活性，因此，它们可用于多种预防性和治疗性应用，以及开发用于肝素和/或硫酸乙酰肝素介导的或和相关疾病的新的预防和治疗试剂。如本文中所用的，“GAG裂解酶活性”、“GAG裂解酶的生物活性”或“GAG裂解酶的功能活性”指多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质、多肽或核酸分子在生理环境中发挥出的活性。例如GAG裂解酶活性可以是由多形拟杆菌GAG裂解酶对例如GAG裂解酶底物例如肝素或硫酸乙酰肝素中的糖苷键发挥出的活性。可在体内或体外测定GAG裂解酶的活性。预测本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶分子具有与从肝素黄杆菌得到的多种肝素酶相似的生物活性。例如，本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质具有一种或多种以下活性(I)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖键，例如以与在切割位点产生具有C4和C5位置之间的不饱和键的糖醛酸(例如Λ 4，5)相同的方式；(3)调节，例如增加或降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性；以及(4)降低或消除血管生成。在一些方面，多形拟杆菌GAG裂解酶I具有与从肝素黄杆菌得到的肝素酶I相似，但不相同的生物活性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶I具有一种或多种以下活性(I)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割与硫酸化糖醛酸有关的一种或多种糖苷键，例如2-0糖醛酸；切割与硫酸化的氨基己糖有关的一种或多种糖苷键，例如6-0-硫酸酯和/或N-磺胺；(3)例如与参考标准比较时，降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在一些实施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在一些方面中，多形拟杆菌GAG裂解酶III具有与从肝素黄杆菌得到的肝素酶II相似，但不相同的生物活性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶III具有一种或多种以下活性(I)结合肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割硫酸化氨基己糖例如N-硫酸化的和/或6-0硫酸化的或未硫酸化的但乙酰化的氨基己糖(例如HNAc)和硫酸化的糖醛酸例如2-0硫酸化的糖醛酸或者未硫酸化的糖醛酸之间的一种或多种糖苷键；⑶例如与参考标准比较时，降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当可能维持抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其它的实施方案中，同时降低抗Xa活性和抗IIa活性。因此，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子可作为新型治疗性试剂用于控制肝素相关的疾病。这样的疾病的实例包括肝素诱导的抗凝血和/或血管生成。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III分子，可用于例如在手术中或手术后降低或消除(例如中和)肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种抗凝血特性。在其它的实施方案方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I和/或多形拟杆菌GAG裂解酶III，可用于对血液去肝素化，例如在生物反应器中，例如在心肺和/或肾透析中使用的生物反应器。在一些方面，多形拟杆菌GAG裂解酶II具有与从肝素黄杆菌得到的肝素酶III相似，但不相同的生物活性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶II具有一种或多种以下活性(I)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割硫酸化的和未硫酸化的一种或多种糖苷键；(3)例如与参考标准比较时，增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当降低抗IIa活性时,维持或可能增加抗Xa活性。在其它实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。在一些方面，多形拟杆菌GAG裂解酶IV具有与其他从多形拟杆菌得到的GAG裂解酶和从肝素黄杆菌得到的肝素酶不同的生物活性，例如底物特异性。例如，多形拟杆菌GAG裂解酶IV具有一种或多种以下活性(I)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割低至中等硫酸化密度的一种或多种糖苷键，特别是与2-0-硫酸化的糖醛酸和邻近的乙酰化有关的键葡糖胺(在多数天然肝素和/或硫酸乙酰肝素制品中不经常发现)；(3)例如与参考标准比较时，增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或降低抗IIa活性时，增加抗Xa活性。在其它实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。因此，这样的多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶II和多形拟杆菌GAG裂解酶IV分子可用于制备用于治疗凝血和/或血栓形成的肝素和/或硫酸乙酰肝素制品。这样的疾病的实例包括溶解或抑制血栓的形成，治疗和预防以下所产生的病症心脏和中央神经系统血管梗塞、动脉硬化、血栓形成、心肌梗塞、心律不整(arrythmias)、心房震颤(atrial fibrillation)、心绞痛、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、充血性心力衰竭、弥散性血管内凝血、经皮冠状动脉干预(percutaneous coronary intervention,PCI)、冠状动脉旁路移植手术(coronary artery bypass graft surgery, CABG)、再灌注的冠状旁路的再闭塞或再狭窄(reocclusion or resenosis of reperfused coronary arteries)、 风湿热、中风、暂时性缺血性发作、血栓性中风、栓塞性中风(embolic stroke)、深静脉血栓形成(deep venous thrombosis)、肺栓塞(pulmonary embolism)、偏头痛、过敏症、哮喘、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory stree syndrome, ARDS)、囊肿性纤维化、眼部的新血管生成、骨质疏松症、牛皮癣、关节炎(风湿性或成骨性)、阿尔茨海默症、骨折、大手术/外伤、烧伤、外科过程、移植(例如骨髓移植)、臀部替换(hip replacement)、膝盖替换(knee replacement)、败血病、败血病性休克、怀孕、遗传性疾病例如血友病。在其他实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶II和/或多形拟杆菌GAG裂解酶IV分子，可用于治疗或预防细胞增殖性或分化性疾病，例如通过阻止或抑制表现出不需要的增殖和/或分化或者另外与不需要的增殖和/或分化相关的细胞的血管生成。细胞增殖性或分化性疾病的实例包括糖尿病；关节炎，例如风湿性关节炎；眼病，例如眼部新血管生成，糖尿病视网膜病变，新生血管性青光眼，晶体后纤维增生症(retrolental fibroplasia),色素膜炎(uveitis),与脉络膜新生血管(choroidalneovascularization)有关的眼病，与虹膜新血管生成相关的眼病；癌，例如肿瘤、肉瘤、转移疾病或造血瘤疾病，例如白血病。
在其他实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶分子，例如多形拟杆菌GAG裂解酶III分子，可用于制备硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素制品。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质，其片段，以及其SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :6、SEQID N0:29或SEQ ID NO :37中序列的衍生物和其它变体都称为“本发明的多肽或蛋白质”或“多形拟杆菌GAG裂解酶多肽或蛋白质”。编码这些多肽或蛋白质的核酸分子都称为“本发明的核酸”或“多形拟杆菌GAG裂解酶核酸”。“多形拟杆菌GAG裂解酶分子”指多形拟杆菌GAG裂解酶核酸、多肽和抗体。如本文中所用的，术语“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如mRNA)和DNA或RNA的类似物。可从核苷酸类似物合成DNA或RNA类似物。DNA分子可以是单链的或者双链的，但优选是双链DNA。术语“分离的核酸分子”或“纯化的核酸分子”包括与核酸的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。例如，对于基因组DNA，术语“分离的”包括从该基因组DNA与之天然相关的染色体上分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸在该核酸来源的有机体的基因组DNA内，没有天然位于其侧翼的序列(例如，位于该核酸5’和/或3’端的序列)。例如，在多个实施方案中，所述分离的核酸分子包含小于5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的5'和/或3'核苷酸序列，在该核酸来源的细胞基因组DNA中，所述核苷酸序列天然位于该核酸分子的侧翼。而且，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可基本上没有通过重组技术生产时的其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，基本上没有化学前体或化合物。如本文所用的，术语“在严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤条件。严格杂交条件是在6 X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在大约45°C下的杂交，其后在65°C的0.2 X SSC、0. I % SDS中洗漆2次。杂交条件是本领域技术人员已知的，并可在Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6 中找到。水相和非水相方法(aqueous and nonaqueous methods)描述在该参考文献中，并可使用其中任一种。杂交条件的其它实例如下1)低严格性，在6XSSC中，在大约45°C下杂交，其后在55°C的0. 2XSSC.0. 1% SDS中洗涤一次或多次；2)中等严格性，在6XSSC中，在大约45°C下杂交，其后在60°C的0. 2XSSC、0. I % SDS中洗涤一次或多次；以及优选的3)高严格性，在6X SSC中，在大约45 °C下杂交，其后在65 °C的0. 2 X SSC、0. I % SDS中洗涤一次或多次。特别优选的严格条件(以及如果实施者不确定应该使用使用什么样的条件来测定分子是否在本发明的杂交限制内，应使用的条件)是在65°C、0. 5M磷酸钠、7% SDS，其后在65°C的0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗涤一次或多次。优选，本发明的分尚的核酸分子，其在严格条件下杂交与SEQ ID N0:l、5、28或36的序列杂交，对应于天然存在的核酸分子。如本文中 所用的，“天然的存在的”核酸分子指具有在天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如天然存在的核酸分子可编码天然蛋白质。如本文所用的，术语“基因”和“重组基因”指包括至少一个编码多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的可读框的核酸分子。该基因任选地还包括非编码序列，例如调控序列和内含子。“分离的”或“纯化的”多肽或蛋白质基本上没有来自该蛋白质来源的细胞或组织的细胞材料或其它污染蛋白质，或者基本上没有化学合成时的化学前体或其它化合物。“基本上没有”表示多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的制品至少是10%纯的。在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的制品中少于大约30%、20 %、10%并且更优选地是5%(干物质重量比)的非多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质(在本文中也引述为“污染蛋白质”)，或者化学前体或非多形拟杆菌GAG裂解酶化学品。当多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其生物活性部分重组生产时，其也优选基本上没有培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于大约20%、更优选地少于10%，并且最优选地少于5%。本发明也包括干重至少为0. 01、
0.1、1. 0和10毫克的分离的或纯化的制品。“非必需”氨基酸残基是可从多形拟杆菌GAG裂解酶的野生型序列中改变而不破坏或实质上改变GAG裂解酶活性的残基。优选地，所述改变不实质上改变GAG裂解酶的活性，例如该活性至少是野生型的20 %、40 %、60 %、70 %或80 %。“必需”氨基酸残基是当从多形拟杆菌GAG裂解酶的野生型序列中改变时，导致GAG裂解酶活性破坏从而具有少于20%野生型活性的残基。例如，预测多形拟杆菌GAG裂解酶的保守氨基酸残基特别经不起改变。“保守氨基酸取代”是其中该氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组胺酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组胺酸)。因此，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质中预测的的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。可选地，在另一个实施方案中，可在多形拟杆菌GAG裂解酶编码序列的全长或部分中通过例如饱和诱变引入突变，并以GAG裂解酶生物活性筛选所得突变体以鉴定保留活性的突变体。SEQ ID NO USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :36 诱变后，重组表达所编码的蛋白质并确定该蛋白质的活性。如本文所用的，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的“生物活性部分”包括多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的片段，其参与相互作用例如分子间相互作用。分子间相互作用可以是结合相互作用或酶促相互作用(例如该相互作用可以是瞬时的，并且形成或破坏共价键)。分子间相互作用可在GAG裂解酶多形拟杆菌分子和非多形拟杆菌GAG裂解酶分子例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段之间。多形 拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的生物活性部分包括含有与多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质基本上同源或由其衍生的氨基酸序列的肽，例如SEQ IDNO :2、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :29和SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列，其包括少于全长多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的氨基酸，并且表现出至少一种GAG裂解酶蛋白质活性。通常，生物活性部分包括具有至少一种GAG裂解酶蛋白质活性的结构域或基序，例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段的解聚作用(例如，以位点特异性方式)，肝素、硫酸乙酰肝素及其片段对糖苷键的切割，降低或消除抗凝血活性，例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段的抗凝血活性。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的生物活性部分可以是例如长度为10、25、50、100、200、300、400、500或更过多个氨基酸的多肽。如下进行序列间的同源性或序列同一性(这两个术语在本文中可交换使用)的计
笪为确定两个氨基酸序列或两个氨基酸序列的百分比同一性，比对所述序列获得最佳比较目的(例如缺口(gap)引入至第一和第二氨基酸和核酸序列的一个或两个中用于最佳比对，而针对比较目的，忽视非同源序列)。两个序列间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数量的函数，其中考虑到缺口的数量，以及对于两个序列的最佳比对而需要弓IA的每一个缺口的长度。为了确定分子是否在本文的序列同一性或同一性限制范围内，通过Needleman and Wunsch ((1970) J. MoI. Biol. 48 :444-453)的数学算法确定百分比同一性，通过在GCG软件套装(来自http://www.gcg.com)的GAP程序完成,并使用下述参数缺口罚分为12的Blossum 62得分矩阵、缺口延伸罚分为4，并且移码缺口罚分是5。在优选的实施方案中，出于比较目的而比对的参考序列的长度是该参考序列的长度的至少30%，优选至少40%、更优选至少50%、60%，以及更优选地至少70%、80%、90%、100%。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中某一位置被第二序列上相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在此位置上是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”是等价的)。为了分析有关多形拟杆菌GAG裂解酶分子的生物序列，除了上述的Needleman和Wunsch算法外使用以下对比程序。两个氨基酸或核苷酸序列间的百分比同一性可使用E. Meyers and ff. Miller ((1989) CABI0S, 4 :11-17)的算法来测定，使用 PAM120 加权残基表、缺口长度罚分是12、并且缺口罚分是4，其已经被并入ALIGN程序(2.0版)。本文所述的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”以执行针对公共数据库的搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关的序列。可使用Altschul，et al. (1990) J. MoI. Biol. 215 403-10的NBLAST和XBLAST程序(2. 0版)进行这样的搜索。BLAST核苷酸搜索可使用NBLAST程序(得分=100，字长=12)进行，以获得与本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可使用XBLAST程序(评分=50，字长=3)进行，以获得与本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白分子同源的氨基酸序列性。为了获得用于比较目的的缺口比对，如 Altschul et al, (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 的描述使用缺口的BLAST。当使用BLAST和缺口的BLAST程序时，使用各个程序(例如XBLAST和 NB LAST)的缺省参数。参见 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。本发明的具体的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽具有与SEQ ID Nos :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列。在氨基酸序列中，本文使用术语“充分相同”或“基本上相同”指包含足够的或最小数量的氨基酸残基的第一氨基酸，所述氨基酸残基i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或者ii)是第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基的保守替换，从而该第一和第二氨基酸序列具有共同的结构折叠和/或共同的功能性活性。例如，含有具有至少大约60 %或65 %同一性，可能是75 %同一性，更可能是85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的共同结构性结构域的氨基酸序列被称作充分或基本上相同。在核苷酸序列中，本文使用术语“充分相同”或“基本上相同”指包含足够的或最小数量的核苷酸的第一核酸，所述核苷酸与第二核酸序列中比对的核苷酸相同，从而该第一和第二核苷酸序列具有相同的功能活性或编码共同的结构性多肽折叠或共同的功能多肽活性。本文所教导的方法有时根据肝素样粘多糖(HLGAG)来描述，但本文所教导的特性可扩展到其它多糖。如本文所用的，术语“HLGAG”和“糖氨聚糖”(GAG)可交换地用于指具有肝素样结构和特性的分子家族，其通常在本文中称为“肝素”。这些分子包括，但不局限 于低分子量肝素(low molecular weight heparin,LMWH)、未分级肝素、生物技术制备的肝素、化学修饰的肝素、合成肝素如五糖(例如ARIXTRATM)、肝素模拟物和硫酸乙酰肝素。术语“生物技术肝素”包括从经过化学修饰的多糖的天然来源制备的肝素，并描述于Razi etal.，Bioche. J. 1995 JuI 15 ；309(Pt 2) :465-72 中。化学修饰的肝素描述于 Yates et al.，Carbohydrate Res (1996) Nov 20 ；294 :15-27中，并且是本领域技术人员已知的。合成的肝素是本领域技术人员熟知的并描述于Petitou, M. et al.，Bioorg Med Chem Lett. (1999)Apr 19 ；9 (8) :1161-6和 Vlodavsky et al. , Int. J. Cancer, 1999,83 :424-431 中。合成肝素的实例是磺达肝癸钠(Fondaparinux)。磺达肝癸钠(ARIXTRATM)是对应于AT-III结合位点的5个单位的合成的粘多糖。硫酸乙酰肝素指包含与肝素相似的二糖重复单位的粘多糖(Glycoaminoglycan),但其具有更多的N-乙酰基团和更少的N-和O-硫酸基团。肝素模拟物是具有至少一种肝素的生物活性(即，抗凝血、抑制癌症、治疗肺病等)的单糖(例如硫糖铝)、寡糖和多糖。优选，这些分子是高度硫酸化的。肝素模拟物可以是天然存在的、合成的或化学修饰的(Barchi，JJ.，Curr. Pharm. Des. , 2000,Mar, 6 (4) :485-501)。术语“HLGAG”也包括上述HLGAG分子的功能性变体。这些功能性变体具有相似的结构，但包括对该结构的轻微修饰，从而使得该分子保留其大部分生物活性或者具有提高的生物活性。如本文所用的“LMWH”指具有平均分子量小于8000Da的硫酸化粘多糖(GAG)的制品，LMWH制品的大约至少60%的寡糖链具有小于8000Da的分子量。几种LMWH可购买获得，但也可例如使用HLGAG降解酶从肝素中制备LMWH。HLGAG降解酶包括，但不局限于肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、肝素酶IV、乙酰肝素酶、D-葡醛酸糖苷酶和L-艾杜糖醛酸酶。这3种来自肝素黄杆菌的肝素酶是已经用于产生LMWH(5，000-8, OOODa)和超低分子量肝素(_3，OOODa)的酶工具。另外，可使用例如本文所述的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽制备LMWH。市售的LMWH包括，但不局限于依诺肝素(enoxaparin)(商标名称为 Lovenox ；Aventis Pharmaceuticals)、达月干素(dalteparin) (Fragmin,Pharmacia and Upjohn)、舍托月干素(certoparin) (Sandobarin, Novartis)，阿地月干素(ardeparin)(Normiflo, Wyeth Lederle)、那屈月干素(nadroparin) (Fraxiparine,Sanofi-ffinthrop),帕月干素(parnaparin)(Fluxum, Wassermann)> 瑞月干素(reviparin)(Clivarin,Knoll AG)和亭扎月干素(tinzaparin) (Innohep,Leo Laboratories，Logiparin，Novo Nordisk)。LMWH的一些优选形式包括依诺肝素(Lovenox)和达肝素(Fragmin)。如本文所用的术语"戊聚糖钠(Arixtra)"指包括甲基0_2_脱氧-6-0-硫代-2-(磺胺基)-a-D-吡喃葡糖基-(I — 4)-0-0-D-吡喃葡糖基-(I — 4)-0-2-二氧-3，6-二-硫代-2-(磺胺基)-a -D-批喃葡糖基-(I — 4) -0-2-0-硫代-a -L-艾杜吡喃葡糖基(idopyranuronosyl) - (I — 4)_2_ 二氧-6-0-硫代 _2_(磺胺基)_ a -D-卩比喃葡糖苷、其十钠盐和衍生物的的合成的五糖的组合物，如本文所用的，“合成的肝素”或“合成的HLGAG”指HLGAG示合成的化合物，并且不是由肝素的片段衍生的。制备肝素的方法提供于，例如Petitou et al. (1999)Nature 398 :417中，其内容通过引用并入本文。如本所用的，“错误表达或异常表达”指在RNA或蛋白质水平上基因表达的非野生型形式。其包括非野生型水平的表达，即过量表达或低表达；在该基因表达的时间或阶段 方面，不同于野生型的表达形式，例如在预定的发育时期或阶段增加或降低的表达(与野生型相比)；在预定的细胞类型或组织类型中在改变的表达(与野生型相比)方面，不同于野生型的表达形式；，在所表达的多肽的剪接长度、翻译的氨基酸序列、翻译后修饰或生物活性方面，不同于野生型的表达形式；在该基因表达的环境刺激或细胞外刺激的作用方面，不同于野生型的表达形式，例如在该刺激的强度增加或降低的情况下增加或降低的形式(与野生型相比)。如本文所用的，“受试者”指哺乳动物生命体。在优选的实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是试验动物或适于作为疾病模型的动物。这些受试者的非限定性实例包括小鼠(mice)、大鼠(rates)和兔(rabbits)。受试者也可以是非人动物,例如马(hourse)、牛(cow)、山羊(goat)和其它家畜(domestic animal)。以下更详细地描述本发明的多个方面。分离的核酸分子一方面，本发明提供了分离的或纯化的的核酸分子，其编码本文描述的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽，例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其片段，例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的生物活性部分。也包括适用于作为杂交探针的核酸片段，其用于，例如鉴定编码本发明的多肽的核酸分子、多形拟杆菌GAG裂解酶mRNA和适用于作为探针的片段例如用于扩增和突变核酸分子的PCR引物。在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括SEQ ID NO U SEQ ID NO :5、SEQ ID N0:28或SEQ ID NO :37所示的核苷酸序列或任何这些核苷酸序列的一部分。在一个实施方案中，该核酸分子包括编码多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的序列(即，SEQ ID NOUSEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ ID NO 36的“编码区”)，以及5，非翻译序列。可选地，该核酸分子不包括正常伴随该目标序列(subject sequence)的侧翼序列。在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括为SEQ ID NO U SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ ID NO :36所示的核苷酸序列或任何这些核苷酸序列的一部分互补物(complement)的核酸分子。在其它实施方案中，本发明的核酸分子与SEQ ID N0U SEQ ID NO :5、SEQ IDN0:28或SEQ ID NO :37所示的核苷酸序列充分互补，从而其可与SEQ ID NO USEQ ID NO:5、SEQ ID NO 28或SEQ ID NO 37所示的核苷酸序列杂交，而形成稳定的双链体。在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括与SEQ ID NO USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ ID NO :36所示的核苷酸序列的全长或任何这些序列的一部分优选相同长度的部分具有至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。本发明的核酸分子可仅包括SEQID NO USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ IDNO 36的核酸序列的一部分。核酸包括那些包括编码序列的部分或全部并延长至5’或3’非编码区域之一(或两者)的核苷酸序列。其它的实施方案包括片段，其包括编码本文所述氨基酸片段的核苷酸序列的片段，特别是其在长度上具有至少100个氨基酸的片段。片段也包括对应于上述具体氨基酸序列或其片段的核酸序列。核酸片 段不应直译为包括那些在本发明前已公开的片段。可通过分离SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核苷酸序列的一部
分一所述核苷酸序列的一部分编码具有GAG裂解酶生物活性(例如在本文中描述的GAG裂解酶蛋白质的生物活性)的多肽、通过表达多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的编码部分(例如通过体外重组表达)以及通过评估多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的编码部分的活性，来制备编码“多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的生物活性部分”的核酸片段。编码多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的生物活性部分的核酸片段包括长度上大于300或更多个核苷酸的核苷酸序列。在优选的实施方案中，核酸分子其在长度上包括大约100、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900 或更多个核苷酸，在严格杂
交条件下与SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核酸分子的核苷酸序列杂交。本发明包括不同于SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38所示的核苷酸序列的核酸分子。这些差异源于遗传密码的兼并性(并产生编码与本文所公开的核苷酸序列编码的蛋白质相同多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的核酸)。在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有至少I个，但少于5、10、20、50或100个SEQ ID N0:2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸残基不同的氨基酸序列。如果对这种比较需要进行比对，则应当针对最大同源性比对该序列。认为来自缺失或插入或错配的“成环”序列是不同的。对于具有具体表达系统的优选或非优选的密码子，可选择发明人的核酸。例如，该核酸可以是这样一种核酸，即，在该核酸中，至少一个密码子，优选地至少10%%或20%%的密码子被改变，使得该序列对于在大肠杆菌、酵母、人、昆虫或CHO细胞中表达是最佳的。核酸变体可以是天然存在的，例如等位基因变体(相同的基因座)和同系物(不同的基因座)，或者可以是非天然存在的。非天然存在的变体可通过诱变技术产生，其中包括那些应用于多核苷酸、细胞或生命体的技术。所述变体可包含核苷酸取代、缺失、倒置和插入。变体可发生在编码和非编码区域之一或两者上。所述变体既可产生保守的氨基酸取代也可产生非保守的氨基酸置换(如在所编码的产物中比较的)。在优选的实施方案中，该核酸不同于SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核酸在于如下至少一个，但不多于10、20、30或40个核苷酸；至少一个，但不多于1%、5 %、10 %或20 %的目标核酸中的核苷酸。如果对于该分析，此是必须需，则应当针对最大同源性比对该序列。认为来自缺失或插入或错配的“成环”序列是不同的。可使用本领域已知的方法鉴定同系物和等位基因变体。这些变体包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列或这些序列的片段具有50%、至少大约70-75%，通常至少大约70-75%，更典型地至少大约80-85 %，并且最通常至少大约90-95 %的同一性。由于这些核酸分子能够在严格条件下，与编码 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :6、SEQ ID、NO :29 或 SEQ ID NO 37 所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者所述序列的片段杂交，所以这些核酸分子易于鉴定。对应于本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶DNA的同系物和等位基因变体的核酸分子可通过定位于与多形拟杆菌GAG裂解酶基因相同的染色体或基因座进行分离。优选的变体包括那些与本文所述的GAG裂解酶活性相关的变体。多形拟杆菌GAG裂解酶的等位基因变体包括功能性和非功能性蛋白质两者。功能性等位基因变体是维持一种或多种GAG裂解酶活性的群体中的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的天然氨基酸序列变体。功能性等位基因变体通常仅包含SEQ ID N0:2、6、29或37的一个或多个氨基酸的保守取代，或者包含该蛋白质的非关键区域内非关键残基的取代、缺失 或插入。功能性变体的实例包括本文所述的M17、Q26、Q23、K169和D20变体(即分别是SEQID NOs :4、23、8、10和39)，以及GAG裂解酶III的Q23变体(SEQ ID NO :34)。非功能性等位基因变体是不具有一个和多个本文所述的GAG裂解酶活性的群体中的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的5个天然氨基酸序列。非功能性等位基因变体通常包含SEQ ID N0:2、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO 29或SEQ ID NO 37的氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入，或未成熟的截短，或者包含该蛋白质的关键残基或者关键区域中的取代、插入、或缺失。而且，本发明包括编码其它多形拟杆菌GAG裂解酶家族成员的核酸分子，并且，其因此其有不同于SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :29或SEQID NO :37的多形拟杆菌GAG裂解酶序列。分离的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽另一个方面，本发明的特征在于分离的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质及其片段，例如其生物活性部分。可使用标准蛋白质纯化技术从细胞或组织来源分离多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。可通过重组DNA技术或化学合成来产生多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质及其片段。本发明的多肽包括那些产生自多重基因的存在、选择性转录事件、选择性RNA剪接事件和选择性翻译和翻译后事件的那些多肽。多肽可在系统中表达，例如培养的细胞，其导致基本上与当该表达的多肽在天然细胞中表达时具有的相同的翻译后修饰；或者多肽在导致翻译后修饰的改变或省略的系统中表达，例如当在天然细胞中表达时存在的糖基化或切割。在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶多肽具有一种或多种以下特征(I)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键；
(3)调节，例如增加或降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性；以及
(4)降低或消除血管生成。在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶I，并且多形拟杆菌GAG裂解酶I具有一种或多种以下活性⑴结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；⑵切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割一种或多种硫酸化糖醛酸的糖苷键，例如2-0糖醛酸；切割一种或多种涉及硫酸化的氨基己糖的糖苷键，例如6-0-硫酸酯和/或N-磺胺；(3)降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如与参考标准比较时，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，维持当抗IIa活性时，抗Xa活性降低。在其它的实施方案中，同时降低抗Xa活性和抗IIa活性。在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶II，并且多形拟杆菌GAG裂解酶II具有一种或多种以下活性(I)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，如切割一种或多种硫酸化的和未硫酸化的糖醛酸的糖苷键；(3)增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如与参考标准比较时，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当降低抗IIa活性时，维持或增加抗Xa活性。在其它的实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶III，并且多形拟杆菌GAG裂解酶III具有一种或多种以下活性(I)结合肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割硫酸化的氨基己糖(例如N-硫酸化的和/或6-0硫酸化的)或未硫酸化的、但乙酰化的氨基己糖(例如HNAc)和硫酸化的糖醛酸例如2-0硫酸化的糖醛酸或者未硫酸化的糖醛酸之间的一种或多种糖苷键；(3)降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如与参考标准比较时，参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持抗IIa活性时，降低抗Xa活性。在其它的实施方案中，同时降低抗Xa活性和抗IIa活性。在一些实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶是多形拟杆菌GAG裂解酶IV，并且多形拟杆菌GAG裂解酶IV具有一种或多种以下活性(I)结合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一种或多种糖苷键，例如切割低至中等硫酸化密度的一种或多种糖苷键，特别是涉及2-0硫酸化的糖醛酸和邻近的乙酰化葡糖胺的键(在大多数天然存在的肝素和/或硫酸乙酰肝素制品中不经常发现)；(3)增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性,例如与参考标准比较时,参考标准例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些实施方案中，当维持或降低抗IIa活性时，增加抗Xa活性。在其它的实施方案中，当维持抗Xa活性时，增加抗IIa活性。在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质或其片段不同于SEQ ID NO2、4、6、8、10、23、29、34、37或39中的相应序列。在一个实施方案中，其至少有一个氨基酸不同，但不同的氨基酸不多于15、10或5个。在另一个实施方案中，其与SEQ ID N0:2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的相应序列至少有一个氨基酸不同，但不同的氨基酸不多于其残基的20%、15%、10%或5% (如果此比较需要比对，应当针对最大同源性比对该序列。认为来自缺失或插入或错配的“成环”序列是不同的)。所述不同优选是在非必需残基或者保守取代处的不同或变化。其他实施方案包括在氨基酸序列中含有一种或多种变化的蛋白质，例如在对活性不是必须的氨基酸残基中的变化。这样的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质在氨基酸序列上不同于 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37 或 39，但保留了生物活性。、
在一个实施方案中，该蛋白质包括与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39至少具有 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高同源性的
氨基酸序列。其中该蛋白质的区域被删除的生物活性部分可通过重组技术制备，并评估其天然多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的一种或多种功能性活性。在优选地实施方案中，该多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列。在其他的实施方案中，该多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39基本上相同。仍然在另一个实施方案中，该多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质与SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39基本上相同，并且保留了如在上文的部分中详细描述的SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的蛋白质的功能性活性。 另一方面，本发明提供了多形拟杆菌GAG裂解酶嵌合或融合蛋白质。如本文所用的，多形拟杆菌GAG裂解酶“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”包括连接与非多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽。“非多形拟杆菌GAG裂解酶多肽”指具有具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列对应于基本上不与多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质同源的蛋白质，例如不同于多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质并且来自相同或不同的生命体的蛋白质。所述融合蛋白质的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽相当于多形拟杆菌GAG裂解酶氨基酸序列的全部或一部分，例如本文描述的片段。在优选的实施方案中，多形拟杆菌GAG裂解酶融合蛋白质包括多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的至少一个(或两个)生物活性部分。所述非多形拟杆菌GAG裂解酶多肽可与所述多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的N末端或C末端融合。该融合蛋白质包括对配体具有高亲和力的部分。例如，该融合蛋白质是GST-多形拟杆菌GAG裂解酶融合蛋白质，其中所述多形拟杆菌GAG裂解酶序列融合到GST序列的C末端。这样的融合蛋白质有助于重组多形拟杆菌GAG裂解酶的纯化。可选地，该融合蛋白质是在其N末端含有异源信号序列的多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可通过使用异源信号序列来提高多形拟杆菌GAG裂解酶的表达和/或分泌。而且，本发明的多形拟杆菌GAG裂解酶-融合蛋白质可用作免疫原以在受试者中生产抗多形拟杆菌GAG裂解酶抗体，从而纯化多形拟杆菌GAG裂解酶配体，并在筛选分析中鉴定抑制多形拟杆菌GAG裂解酶与多形拟杆菌GAG裂解酶底物相互作用的分子。表达载体可购买获得的，并且已经编码融合部分(例如GST多肽)。可以将编码多形拟杆菌GAG裂解酶的核酸克隆入这样的表达载体，使得该融合部分框内连接至多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。在另一方面，本发明的特征也在于多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的变体，例如其可作为拮抗剂(模拟物)发挥作用的突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的变体可通过诱变产生，例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的序列或平截的不连续点突变、插入或缺失。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的拮抗剂基本上保留多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的天然存在形式的相同的或其中部分的生物活性。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的变体可通过以拮抗剂活性筛选突变体例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的截断突变体的组合物文库来鉴定。多形拟杆菌GAG裂解酶I的突变体包括SEQ ID NO :4所示的Ml7突变体和SEQ ID NO 23所示的Q26突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶II的突变体包括SEQ ID NO :8所示的Q23突变体和SEQ ID NO: 10所示的K169突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶III的突变体包括SEQ ID NO 34所示的Q23突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶III的突变体包括SEQ ID NO 39所示的D20突变体。多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白编码序列的片段例如N末端、C末端或内部片段的文库可用于产生片段的多种群体，用于筛选和随后选择多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的变体。特别优选其中添加或删除半胱氨酸残基，或者添加或删除被糖基化的残基的变体。用于筛选通过点突变或平截产生的组合物文库的基因产物，和用于筛选具有选择的特性的基因产物的cDNA文库的方法在本领域中是已知的。这些方法适于快速筛选通过多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的组合诱变产生的基因文库。递归式整体诱变(Recursiveensemble mutagenesis, REM),是一种增强文库中功能性突变频率的新技术,其可用于与该筛选分析组合使用，来鉴定多形拟杆菌GAG裂解酶变体(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA S9 :7811-7815 ；Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331)。可开发基于细胞的分析试验以分析多种多形拟杆菌GAG裂解酶文库。例如，可将表达载体的文库转染到细胞系中，例如通常以底物依赖模式响应多形拟杆菌GAG裂解酶的细胞系。随后，将该转染的细胞与多形拟杆菌GAG裂解酶接触，可通过例如测量肝素或硫酸乙酰肝素的切割来检测该突变体的表达对多形拟杆菌GAG裂解酶底物的作用。其后从细胞中回收质粒DNA，所述细胞对抑制评分或可选地增强多形拟杆菌GAG裂解酶底物的信号，其后进一步表征这些个别的克隆。在另一个方面，本发明的特征在于制备天然存在的多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的片段或类似物的方法。该方法包括例如通过一个或多个残基的取代或删除，来改变多形拟杆菌GAG裂解酶多肽的序列，例如改变本文描述的非保守区域的序列、或结构域或残基，并且测试该改变的多肽的所需活性，例如上文所述的活性。重组表汰载体、宿主细胞和遗传改造的细胞在另一发明，本发明包括载体，优选表达载体，其包含编码本文所述多肽的核酸。如本文所用的，术语“载体”指能够运输其连接的另一个核酸的核酸分子，其包括质粒、粘粒或病毒载体。该载体能够自主复制或其能整合到宿主DNA中。病毒载体包括，例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒(adeno-associated viruses) 载体可以包括具有适于在宿主细胞中表达的核酸形式的多形拟杆菌GAG裂解酶核酸。优选，该重组表达载体包括有效连接至待表达的核酸分子的一种或多种调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷化信号)。调控序列包括那些指导核酸序列组成性表达序列，以及组织特异性调控和/或诱导的序列。表达载体的设计依赖如待转染宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等这类因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞，从而生产蛋白质或多肽，其中包括由本文描述的核酸编码的融合蛋白质或多肽(例如多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质、多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质的突变体形式、融合蛋白质等)。设计本发明的重组表达载体用于在原核或真核细胞中表达多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质。例如，本发明的多肽可在大肠杆菌、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。适宜的宿主细胞进一步在Goeddel，(1990)GeneExpression Technology Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA中讨论。可选地，该重组表达载体可在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。在原核生物中的蛋白质表达最经常在大肠杆菌中使用载体进行，所述载体包含指导融合或非融合蛋白质表达的组成性或诱导性启动子。融合载体将一定数量的氨基酸添加到其所编码的蛋白质中，通常是加入到重组蛋白质的氨基末端。这样的融合载体通常具有三个目的1)增加重组蛋白质的表达；2)增加该重组蛋白质的可溶性；以及3)通过作为亲和纯化中的配体来协助该重组蛋白质的纯化。常常将蛋白质水解切割位点引入至该融合部分和该重组蛋白质的结合处，以能够在纯化该融合蛋白质后，从该融合部分分离该重组蛋白质。这些酶类以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括 pGEX (Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D. B.和 Johnson, K. S. (1988) Gene 67 31-40)>pMAL(New England Biolabs, Beverly,MA)和 pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白质或蛋白质A融合至靶重组蛋白质上。纯化的融合蛋白质可用于多形拟杆菌GAG裂解酶活性分析中(例如下文更详细描述的直接分析或竞争性分析)，或者用来产生多形拟杆菌GAG裂解酶蛋白质特异性的抗体。在优选地实施方案中，在本发明的逆转录病毒表达载体中表达的融合蛋白质可用于感染其后被移植到受辐射处理的受体中的骨髓细胞。在经过足够的时间(例如6周)后，检查该受试者受体的病理学。使重组蛋白在大肠杆菌中表达最大化是在以蛋白水解方式切割该重组蛋白质的能力受损的宿主细菌中表达该蛋白质(Gottesman, S. , (1990)Gene ExpressionTechnology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California119-128)。另一种策略是改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的个别密码子是在大肠杆菌中优先使用的密码子(Wada et al, (1992)Nucleic AcidsRes. 20 :2111-2118)。本发明的核酸序列的此类改变可通过标准的DNA合成技术来进行。所述多形拟杆菌GAG裂解酶表达载体可以是酵母表达载体、在昆虫细胞表达的载体例如杆状病毒表达载体，或适于在哺乳动物细胞中表达的载体。当用于哺乳动物细胞中时，可通过病毒调控元件提供该表达载体的控制功能。例如，常用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40 (Simian Virus 40)。在另一个实施方案中，该启动子是可诱导的启动子，例如被留类激素、多肽激素(例如，通过信号转导通路的方式)、或异源多肽(例如四环素-诱导系统、"Tet-On"和"Tet-Off';参见例如 Clontech Inc. , CA, Gossen and Bujard (1992) Proc. Natl. Acad.ScL USA 89 :5547 和 Paillard(1989)Human Gene Therapy 9 :983)调控的启动子。仍然在另一个实施方案中，该重组哺乳动物表达载体能够指导该核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，组织特异性调控元件用于表达该核酸)。适宜的组织特异性启动子 的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异的性；Pinkert et al. (1987)Genes Dev. I 268-277)、淋巴特异性的启动子(Calame and Eaton(1988)Adv. Immunol. 43 :235-275)、特别是T细胞受体启动子(Winoto and Baltimore (1989)EMBO J. 8 :729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji et al. (1983) Cell 33 :729-740 ;Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)、神经元特异性的启动子(例如，神经纤维启动子；Queen and Baltimore (1983)Cell 33 :741-748)、胰脏特异性的启动子(Edlund et al. (1985) Science 230:912-916)和乳腺特异性的启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4，873，316和欧洲申请
发明者詹姆斯·迈特 申请人:莫曼塔医药品有限公司