专利名称：大豆耐旱锌指蛋白基因stf-2的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及植物干旱胁迫应答的转录因子，确切地说是大豆锌指蛋白基因STF-2及其应用。
背景技术：
锌指蛋白是转录因子的一种，广泛的参与生物的表达调控和生长过程。研究最多的就是C2H2型锌指蛋白，尤其是对拟南芥(Arabidopsis thaliana),矮牵牛{Petuniahybrida Vilm)以及水稻{Oryza sativa)等植物的研究较多。研究发现了多种与植物胁迫 耐受相关的植物C2H2型锌指蛋白，例如，在拟南芥中发现了一个STZ基因，该基因能够编码一种双锌指结构的C2H2型锌指蛋白，转STZ基因的烟草明显提高了对冷及高盐条件的耐受能力(Sakamoto et al.，2000);在矮牵牛中获得的锌指蛋白基因Id，其翻译产物同样也含是具有双锌指结构的C2H2型锌指蛋白，转基因的烟草对干旱的耐受能力也得到明显提高。国内对植物C2H2型锌指蛋白研究较多的集中在水稻上，例如基因，石基因等，这两个基因所编码的锌指蛋白都能够提高植物对渗透胁迫的耐受能力(郭书巧等，2007;郭书巧，2006)。但是国内外对于大豆锌指蛋白的研究还比较少，分析较为明确的只有5T6F-7，其编码的锌指蛋白是典型的双锌指结构的C2H2型锌指蛋白，能明显提高转基因拟南芥对低温的耐受能力(Kim et al., 2001)。我们可以依据C2H2型锌指蛋白的特性利用基因工程技术定向的提高植物对逆境的耐受能力，为稳定农作物的生长具有重要价值和意义。大豆是我国重要的油料作物，干旱情况下对大豆的出苗率，生长情况，产量都有非常重要的影响。而至今从大豆中鉴定出来的C2H2型锌指蛋白基因并不多，而研究较为透彻的只有大豆耐冷锌指蛋白基因SCOF-I。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的大豆基因，大豆C2H2型锌指蛋白基因STF-2。大豆锌指蛋白基因STF-2，其碱基序列如序列表SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示；
大豆锌指蛋白STF-2，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示；
它来源于大豆品种“吉农18”；
是以大豆品种“吉农18”总RNA为模板，经反转录合成cDNA的第一链后，进行PCR扩增获得。一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了大豆锌指蛋白基因SCTF-I ；
所述的植物表达载体为PBI121。本发明的另一个目的是大豆锌指蛋白基因，在培养耐干旱转基因植物新品种中的应用。本发明提供的大豆锌指蛋白基因STF-2,是大豆中新发现的与干旱相关的C2H2型锌指蛋白基因。经实验表明，STF-2编码的蛋白能够定位到细胞核中，该基因过量表达后能够明显提高转基因植物的抗旱性，具有提高植物综合耐逆性的功能，本发明的基因来源于大豆，具有适合于大豆等双子叶植物的优化密码子，其基因工程受体主要适合于双子叶植物的大豆、烟草、棉花等，此外也适合于水稻、小麦、玉米等单子叶植物。
图I为倒置荧光显微镜下照片，其中a是ρΒΙ121-βΤ在洋葱表皮细胞中的瞬时表达；b是？81121-^^- 在洋葱表皮细胞中的瞬时表达；
图2为转基因植株耐旱性实验照片，其中图a是干旱处理的对照烟草和转基因烟草，图b是干旱处理的对照烟草和转基因烟草照片。
图3为转基因植株耐旱性实验照片，图3a是干旱处理后经25°C恢复培养12h后的对照和转基因烟草，图3b是干旱处理后经25°C恢复培养12h后的对照和转基因烟草单株照片。图4为转基因植株耐旱性试验照片，图4a是利用10%PEG6000溶液模拟干旱胁迫24h后对照和转基因烟草的对比图片，图4b是模拟干旱后经恢复水培养24h后对照和转基因烟草对比图片。
具体实施例方式实施例I
选用大豆品种“吉农18”，待幼苗生长一周后，4°C培养24h，取叶片，用液氮研磨，加入含有裂解液的I. 5ml的EP管中，震荡混匀后，使用试剂盒RNAiso Plus提取总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定RNA质量，然后用分光光度计测量RNA的浓度；按照美国FERMENTAS公司的反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA第一链；以植物C2H2型锌指蛋白的保守序列为探针搜索大豆基因组数据库，经过比对和序列拼接得到一个全长为1115bp的大豆C2H2型锌指蛋白序列，根据此序列分别设计两边引物5’ GCTCATCTACACTCATA 3’，5’TGATGAAAACAATTGTTA 3’，采用RT-PCR的方法进行cDNA克隆，PCR反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 40s，48°C复性 40s，72°C延伸 40s，32 个循环，72°C后延伸 IOmin ^fPCR产物克隆至PMD-18T载体上，测序后获得具有完整编码区的大豆C2H2型锌指蛋白基因其喊基序cDNA如序列表SEQ ID NO. I。STF-2全长1115bp，开放阅读框在97_844bp处，DNAMAN软件分析表明SCTF-I共编码249个氨基酸，有两个典型的C2H2型锌指结构，两个锌指结构间由36个氨基酸隔开。锌指结构中有植物锌指蛋白特有的保守氨基酸序列QALGGH。经DNAMAN软件分析，估算其等电点pl=8. 23，分子量MW=26. 7kDa。利用GENEBANK中BLAST搜索大豆基因组数据库，发现STF-2是一个新的大豆C2H2型锌指蛋白基因。实施例2
根据大豆C2H2型锌指蛋白基因STF-2的cDNA序列，设计扩增完整编码阅读框的引物，在上游添加Xba I酶切位点，下游添加Sac I酶切位点，上游引物GGG TCTAGAATGGCTTTGGAGGCTTTGA，下游引物TTTGAG AAACAAACGCGGCCTCT,以实施例 I 中获得的 cDNA为模板进行PCR扩增，将STF-2的cDNA克隆到PMD-18T载体上，进一步克隆到双元表达载体PB 1121上；将基因链接到上面的载体上，构建成pB 1121-STF-2-GFP载体，将pB 1121 -STF-2-GFP通过农杆菌侵染的方法转入到洋葱表皮细胞中进行瞬时表达，通过激光共聚焦纤维镜管擦，发现pBI 121- STF-2-GFP基因嵌合产物定位于细胞核内，表明大豆STF-2基因是定位于细胞核内的转录因子，见图I，其中a是pBI 12在洋葱表皮细胞中的瞬时表达，b是在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。a、b是在倒置荧光显微镜下的观察，通过显微镜观察，图a可以看出在转入的洋葱表皮细胞中整个细胞都有绿色荧光，而图b转入的洋葱表皮细胞只有细胞核能检测到绿色荧光，说明STF-2编码的蛋白能够定位到细胞核中。实施例3
将表达载体PBI121-转入农杆菌，利用农杆菌侵染的方法，进一步转入烟
草中，对获得的转基因植株进行PCR、RT-PCR、Southern杂交检测后，对转基因植株的T2代和对照植株进行耐逆性分析；耐旱转基因植株的获得将转基因的烟草和对照放入25°C培养箱中连续不浇水培养15d，相对湿度为40%，之后再恢复25°C正常浇水培养12h。将转基因烟草和对照放入25°C培养箱中连续不浇水培养15d，培养箱的相对湿度控制在40%，每天观察和记录生长情况，发现在胁迫IOd后，对照植株叶片出现枯黄和打卷现象，胁迫15d后，转基因烟草生长基本正常，而对照植株出现枯萎现象，而转基因植株基本正常，如图2a、图2b所示。图2a和图2b的左列为对照，右列为转基因植株。在恢复浇水培养12h后，转基因植株恢复情况要明显优于对照组，如图3a，图3b是恢复浇水后的全苗单株状态图片。图3a和图3b的左侧为对照，右侧为转基因植株。实施例4
将转基因烟草和对照烟草放入含有10%PEG6000溶液的培养皿中培养24小时，观察和记录各自生长情况，发现在胁迫24h后，90%的对照植株都出现了叶片枯萎和打卷现象，转基因烟草也出现一些叶片打卷现象，但是总体上强于对照烟草，如图4a。恢复水培养24小时候，转基因植株的恢复情况也明显强于对照植株，如图4b。上述实验表明本发明中克隆的大豆C2H2型锌指蛋白基因为大豆中新发现的与干旱相关的C2H2型锌指蛋白基因。实施例3表明，该基因过量表达后能够明显提高转基因植物的抗旱性，具有提高植物综合耐逆性的功能。本发明的基因来源于大豆，具有适合于大豆等双子叶植物的优化密码子，其基因工程受体主要适合于双子叶植物的大豆、烟草、棉花等，此外也适合于水稻、小麦、玉米等单子叶植物。
权利要求
1.大豆耐旱锌指蛋白基因，其碱基序列如序列表SEQID NO. I或SEQ ID NO. 2所示。
2.大豆耐旱锌指蛋白STF-2，其氨基酸序列如序列表SEQID NO. 3所示。
3.根据权利要求I所述的大豆耐旱锌指蛋白基因，它是以大豆品种“吉农18”总RNA为模板，经反转录合成cDNA的第一链后，进行PCR扩增获得。
4.一种植物表达载体，它是在植物表达载体中插入了其碱基序列如序列表SEQ IDNO. I或SEQ ID NO. 2所示的大豆耐旱锌指蛋白基因SCTF-1。
5.根椐权利要求4所述的所述的植物表达载体为PBI121。
6.大豆锌指蛋白基因在培养耐干旱转基因植物新品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了大豆锌指蛋白基因STF-2，是大豆中新发现的与干旱相关的C2H2型锌指蛋白基因。经实验表明，STF-2编码的蛋白能够定位到细胞核中，该基因过量表达后能够明显提高转基因植物的抗旱性，具有提高植物综合耐逆性的功能，本发明的基因来源于大豆，具有适合于大豆等双子叶植物的优化密码子，其基因工程受体主要适合于双子叶植物的大豆、烟草、棉花等，此外也适合于水稻、小麦、玉米等单子叶植物。
文档编号C12N15/29GK102703467SQ20121013577
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者付永平, 宋冰, 崔程程, 张卓, 晏佳琳, 李勃, 李翠, 杜鹃, 洪洋, 王丕武, 王丹, 王贺, 王鹏, 邢飞, 马建 申请人:吉林农业大学