专利名称：一种生产重组混合异淀粉酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产重组混合异淀粉酶。
背景技术：
异淀粉酶(Isoamylase EC 3. 2. I. 68),亦称α -1,6_葡萄糖苷酶,支链淀粉酶。异淀粉酶广泛存在于微生物界，现已知产异淀粉酶的微生物有细菌和真菌两大类。异淀粉酶能够水解支链淀粉分支点的α-1，6_葡萄糖苷键，催化支链淀粉、糖原及某些分支糊精中 的α_1，6糖苷键的断裂反应。异淀粉酶广泛应用于淀粉エ业生产、啤酒生产、饲料エ业和饮食等行业。不同的用途对于异淀粉酶作用的适合温度和PH有着不同的要求。当前市场上的异淀粉酶产品是来源于天然菌株生产的异淀粉酶，当前的异淀粉酶产品的适合反应温度范围和适合反应pH范围窄，不能满足当前市场的需求。由于异淀粉酶有多种来源，那么，不同来源的异淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的异淀粉酶的理化特性可不相同。毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)是最近迅速发展的ー种真核表达宿主，营养要求不高，适合于大规模生产方式，分泌很少的自身蛋白，表达的外源蛋白容易纯化。
发明内容
根据异淀粉酶有多种来源，不同来源的异淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的异淀粉酶的理化特性可不相同，如果将某些不同理化特性的异淀粉酶基因重组于同一个细胞的基因组进行表达，那么，所表达的混合异淀粉酶将具有理化特性多祥性，即具有多个最适温度和最适pH。这种混合酶将比其中单种酶的使用价值高。来源于解淀粉假单胞杆菌(Pseudomonas amyloderamosa)的异淀粉酶最适合pH 5. 6,最适温度是56°C ;来源于软腐细菌(Pectobacterium chrysanthemi)的异淀粉酶最适pH7,最适温度40°C。由于这两种酶的功能相同，若将这两种酶联合应用，就有两个最适合的PH反应点和温度反应点，那么，其用途将比其中的単独酶广。若分别用不同的菌株来表达这两种酶，其生产成本将高于用一个菌株同时生产这两种酶的混合酶。本发明构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，生产重组混合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶和软腐细菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶。本发明所采用的技术方案是I.克隆酶基因应用PCR技木，分别从解淀粉假单胞杆菌基因组和软腐细菌基因组中扩增异淀粉酶基因。2.获得应用于表达载体构建所需的启动子，重组序列，信号肽，转录終止子和抗性基因。3.构建如附图的含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体。
4.应用电转化法将含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组。[说明.表达框架启动子-信号肽-基因-转录终止子]5.筛选高表达解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶和软腐细菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶的重组子作为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。6.发酵毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶。本发明构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶的优点体现于
本发明通过构建毕赤酵母工程菌，应用工程菌生产两种重组异淀粉酶的混合酶产品，一方面提供最适pH7和最适pH5. 6,最适温度40°C和50°C的混合异淀粉酶新产品，另ー方面取代发酵含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶，发酵含软腐细菌的异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶。即用ー个发酵エ序生产两种异淀粉酶取代用两个エ序分别生产两种异淀粉酶。达到节省原材料、能耗和人力资源的作用。
附图.含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体。p.毕赤酵母三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S. α因子信号肽；genel.解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因；gene2.软腐细菌的异淀粉酶基因；TT.转录终止子；G418. G418抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColEl.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；p. pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。
具体实施例方式下面用非限定性实施例对本发明作进ー步说明。实施例I :I. I构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母组表达载体I. I. I构建克隆载体由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPM。I. I. 2犹取基因①PCR扩增解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因引物I :5’ ggTTCGAAgccatcaacagcatgagcct3 [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A 区 TGATGATGATGATGATG
cttggagatcaacagcagcagcgat3’ [说明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]
提取解淀粉假单胞杆菌基因组DNA，以解淀粉假单胞杆菌基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因大小的扩增帯。PCR产物经DNA序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。②PCR扩增软腐细菌的异淀粉酶基因引物I :5’ gctacKtaatgggtgaactgttggcggg3 [说明5’ 的 8 个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]引物2:5， CAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG ttgttttaccagtacgcacaccgcatt3，[说
明5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个 碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]提取软腐细菌基因组DNA，以软腐细菌基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合软腐细菌的异淀粉酶基因大小的扩增帯。PCR产物经DNA序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是软腐细菌的异淀粉酶基因。I. I. 3分别构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架。①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。提取毕赤酵母的基因组DNA，应用以基因组DNA为模板，应用如下引物(5’ CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3’，5’ GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3’ )进行 PCR 扩增，PCR产物经序列測定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列的5’端和3’端的有下划线的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点出个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCG TTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGT CTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCC CTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAA AAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAA AGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAAT TGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC[说明毕赤酵母基因组DNA提取方法将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)于30°C振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCG GTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCT TCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTC TTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGG GGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGT ACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5， CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，说明引物的5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位(有下划线的6个碱基)。提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物I和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。⑥表达框架构建过程A.含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将PCR扩增获得的解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列重组于PPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的载体称为PPM1。B.含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的构建通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将PCR扩增获得的软腐细菌的异淀粉酶基因序列重组于PPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录終止子序列重组于PPM载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的载体称为PPM2。⑦完成毕赤酵母表达载体的构建A.将两套表达框架组装于同一个克隆载体。
·
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，切下pPM2载体的表达框架，并将其切下的表达框架重组于PPMl的多克隆位点。此载体称为pPM12.B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pPM12载体的多克隆位点，构成含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图)。I. 2构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌用电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体(见附图)转化毕赤酵母GS115，将经过电转化的GSl 15细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因的特异引物和软腐细菌的异淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩増，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含两种异淀粉酶基因表达框架的重组子在接种于YPD[2%蛋白胨，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培养基中，30°C摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这两个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的两种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这两种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因和软腐细菌的异淀粉酶基因都能在含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的两种混合异淀粉酶的重组子作为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。I. 3生产重组混合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶和软腐细菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶分别将含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和不含异淀粉酶基因的毕赤酵母分别接种于YPD培养基中，30°C摇床培养两天。分别收集其发酵液上清于两个条件(①pH 5. 6、56°C，②pH 7、40°C )测定异淀粉酶活性，将结果记录于表I。表I结果表明含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在pH 5.6、56°C和pH 7、40°C都具有良好的酶活性，但是，含单种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液只是在其中的ー个条件下具有良好的酶活性。含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉 酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在pH 5.6、56°C条件下和在pH 7、40°C的条件下的异淀粉酶活性约为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在同样条件下的异淀粉酶活性之和。表I.发酵液水解异淀粉试验试验
权利要求
1.一种生产重组混合异淀粉酶的方法。其特征在于应用分子生物学技术克隆解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因和软腐细菌的异淀粉酶基因，构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体；将毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母从而获得毕赤酵母重组子；筛选高表达以上所述的两种异淀粉酶的毕赤酵母重组子作为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；用含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶。
2.根据权利要求I所述一种生产重组混合异淀粉酶的方法，其特征在于利用权利要求I所述的生产重组混合异淀粉酶的方法制备成混合异淀粉酶产品。
全文摘要
本发明公开了一种生产重组混合异淀粉酶的方法。属生物技术领域。首先分别克隆解淀粉假单胞杆菌和软腐细菌的异淀粉酶基因；构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体，并将其表达载体转化毕赤酵母，筛选高表达以上所述的两种异淀粉酶的重组子作为工程菌；发酵毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶。与传统的由单基因编码的异淀粉酶不同，本发明生产的重组混合异淀粉酶出现酶反应的两个最适温度和pH，理化特性高，适合于多种用途；由于实现两个酶基因同时在其毕赤酵母中表达，使其异淀粉酶产量显著提高，起到降低生产成本的作用。
文档编号C12R1/38GK102719420SQ201210141970
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月2日 优先权日2012年5月2日
发明者刘振旺, 张添元, 张爱联, 易国辉, 罗进贤, 陈丽萍 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所