专利名称：HGF基因的Poly A重复单元数目突变多态性检测用探针及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测HGF(hepatocyte growth factor :肝细胞生长因子)基因的启动子区域中的poly A重复单元数目的突变的多态性的探针及其用 途。
背景技术：
乳腺癌是发生于乳房组织的癌。是世界上常见的癌症，在西方国家中大约10%的女性一生中有罹患乳腺癌的机会。另外，大约20%的乳腺癌女性患者由于该疾病而死亡。因此，为了实现肿瘤的早期发现方法以及有效的治疗方法而耗费着巨大的劳动力。近年，已知乳腺癌的发病风险与HGF基因的启动子区域中的poly A重复单元数目的突变相关联。具体地，在HGF基因的启动子区域的polyA重复单元数目为正常型30时与poly A重复单元数目发生缩短突变(例如，变为25或25以下)吋，乳腺癌的发病风险不同(Jihong Ma,et ai. ，2009，bomatic mutation and functional polymorphism oi a novelregulatoryelement in the HGF gene promoter causes its aberrant expression inhumanbreast cancer. 、The Journal of Clinical Investigation Volume 119Number 3.，478-491)o作为HGF基因的poly A重复单元数目的突变检测方法的示例，有直接测序法(direct sequencing)以及用电泳检测的方法。但是,例如,在判别poly A重复单元数目为30和25以下时的A的重复数的差异时，直接测序法中測定相同碱基的连续序列时波形杂舌し难以确定正确的碱基序列。另外，即使使用电泳，也难以判别多个碱基(例如，30和25以下)的差别，难以正确判断是正常型还是突变型。另ー方面，近年来的基因多态性的检测方法中，使用着利用了熔解曲线分析(Tm分析)的检测方法。该方法为如下方法使用与含有检测目标基因多态性的检测靶标序列互补的探针，形成检测试样的靶标单链DNA与该探针的杂交体(双链DNA)，对该杂交体实施加热处理，通过吸光度或荧光强度等的信号測定来检测随着温度上升的杂交体解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值(°C)，从而判断目标多态性的有无。杂交体的同源性的越高则Tm值越高，同源性越低则Tm值越低。因此，对含有目标多态性的检测靶标序列和与其互补的探针的杂交体预先求得Tm值CC )(评价标准值)，測定检测试样的靶标单链DNA和该探针的Tm值(°C )，若该测定值与评价标准值相同，则可以判断为完全匹配，即靶标DNA中存在目标多态性，若该测定值低于评价基准值，则可以判断为错配，即靶标DNA中不存在目标多态性。此外，日本专利文献特表2007-510154号公报中，记载了以下所示的E. coli 16SrRNA-特异性补充(補足)探针、以及E. coli 16S rRNA-特异性检测补充探针(序列编号I和序列编号2)。但是，这些探针只有最多14个A。另外，A重复的部分必须位于探针的序列的端部。因此，不仅不能检测poly A重复单元数目为15个以上的突变型的情况，也不能检测其他的碱基夹着的HGF基因的启动子区域的poly A重复单元的突变型的情况。
序列编号I5’ -GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAAAAAAAAAAAAAA-3，序列编号25， -AAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3，
发明内容
本发明的目的在于，提供能够正确地判别HGF基因的启动子区域的poly A重复单元数目突变的多态性检测用探针、使用该多态性检测用探针的HGF基因的多态性检测方法、利用该多态性检测方法的药剂的评价方法、以及含有该多态性检测用探针的HGF基因的多态性检测用试剂盒。 本发明人发现通过设计能够正确地判别HGF基因的启动子区域的poly A重复单元数目突变的多态性检测用探针，并使用该多态性检测用探针进行Tm分析，能够更准确地检测该poly A重复单元数目突变的多态性，从而完成了本发明。本发明如下所述。〈I〉. 一种多态性检测用探针，其是用于检测HGF基因的多态性的探针，其特征在于，其由从下述(Pl-I)、(Pl-2)、(P1’ -I)、(P1’ -2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2，-I)、(P2，-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’ -I)和(P3’ -2)中选择的至少ー种荧光标记寡核苷酸构成(Pl-I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P1-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P1’ -I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P1’ -2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P2-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与喊基编号92对应的喊基用荧光染料标记；(P2-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；(P2’ -I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、相对于与序列编号3互补的 碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，与所述碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；(P3-1)荧光标记寡核苷酸，其为8 120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132 134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的4 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；(P3-2)荧光标记寡核苷酸，其为8 120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所不的喊基序列的喊基编号100、喊基编号132 134、以及由夹在所述喊基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的4 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列其，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；(P3’ -I)荧光标记寡核苷酸，其为8 56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132 134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的5 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸，其为8 56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132 134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的5 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记。〈2〉.根据〈1>所述的多态性检测用探针，其特征在干，所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(Pr -I)和所述(Pr -2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基；所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)和所述(P2’ _2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基；所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)和所述(P3’ _2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。〈3〉.根据〈1>所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(pr -D和所述(Pr -2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基；所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’_l)和所述(P2’_2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基；所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’_l)和所述(P3’_2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。〈4〉.根据〈1> 〈3>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述荧光 标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。〈5〉.根据〈4>所述的多态性检测用探针，其特征在干，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度減少。〈6〉.根据〈1> 〈5>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27 57 ;所述(P1’ -I)或所述(P1’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22 52 ;所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 62 ;所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22 52 ;所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为30 60 ;所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为19 49。〈7〉.根据〈1> 〈6>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在干，所述(Pl-I)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 52 ;所述(P1’ -I)或所述(P1’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27 47 ;所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37 57 ;所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27 47 ;所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为35 55 ;所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为24 44。〈8〉.根据〈1> 〈7>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37 47 ;所述(P1’ -I)或所述(Pr -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 42 ;所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为42 52 ;
所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 42 ;所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为40 50 ;所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为29 39。〈9〉.根据〈1> 〈8>中任意一项所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述多态性检测用探针为用于熔解曲线分析的探针。〈10〉. ー种HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，使用〈1> 〈9>中任意ー项所述的多态性检测用探针。〈11〉.根据〈10>所述的HGF基因 的多态性检测方法，其特征在于，包括(I)使〈1>至〈9>中任意一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，获得所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸的杂交体的步骤；(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度，使所述杂交体解离，測定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动的步骤；(III)基于所述荧光信号的变动，评价所述杂交体的解离温度即Tm值的步骤；以及(IV)基于所述Tm值，检测HGF基因中的多态性的存在的步骤。〈12〉.根据〈11>所述的HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，还包括在所述(I)的获得杂交体之前或者与所述(I)的获得杂交体同时扩增核酸的步骤。〈13〉. 一种药剂的评价方法，其特征在于，包括(I)通过〈10>至〈12>中任意一项所述的HGF基因的多态性检测方法，来检测HGF基因的多态性的步骤；(II)基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效的步骤。〈14〉. HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，包括〈1> 〈9>中任意ー项所述的多态性检测用探针。〈15〉.根据〈14>所述的HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，还包括能够以含有与所述(pi-i)、所述(pi-2)、所述(Pr -I)、所述(pr -2)、所述(P2-i)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)、所述(P2’ -2)、所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。
图I为示出实施例I涉及的通过3T-HGF-WT-F1探针进行的Tm分析的结果的图。图2为示出实施例2涉及的通过3T-HGF-WT-F3探针进行的Tm分析的结果的图。图3为示出实施例3涉及的通过3T-HGF-WT-R1探针进行的Tm分析的结果的图。图4为示出比较例涉及的通过3T-HGF-WT-F2探针进行的Tm分析的结果的图。图5为示出实施例4涉及的通过3T-HGF-WT-R1探针进行的Tm分析的结果的图。
具体实施例方式在本发明中，检测的目标的多态性基本上是指HGF基因中的启动子区域的poly A重复单元数目突变。在美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation (NCBI))登录号 NT_007933. 15 (Homo sapiens chromosome 7genomic contig,GRCh37. p2reference primary assembly)中作为部分序列登录了本发明中的HGF基因的细节。本发明中的“碱基编号”是指作为该部分序列的序列编号3所示的碱基序列的、从5’末端起向3’末端方向数的对应碱基的编号，即碱基编号I 碱基编号249。此外，该碱基编号I 碱基编号249的碱基序列对应于前述的登录号NT_007933. 15中登录的77412220bp的全碱基序列的第1943861位的碱基 第19433101位的碱基的部分序列。人的HGF基因中的启动子区域的poly A重复单元数目若为正常型则是30 (31)，若为突变型则是0(1) 29 (30)。本发明中的“ poly A重复单元数目突变”是指基因处于这样的突变型的情況。本发明的poly A重复单元数目中，例如在表示为30(31)的情况下，“30”’表示序列编号3的碱基序列所示的HGF基因中的启动子区域的poly A重复单元数目、即碱基编号102 131的T(或与T互补的A)的数目，“(31)”是指序列编号3所示的碱基序列中，将前述启动子区域的poly A重复序列的5’末端侧上连接的T也包括在内的、碱基编号101 131的T(或与T互补的A)的数目。
在本发明中，作为检测对象的试样中的单链核酸、多态性检测用探针或引物的每个的序列，基于这些序列的互补关系的事项，只要不特别指出，也适用于和该各序列互补的序列。在将本发明的事项适用干与各序列互补的对应序列吋，由该互补的序列识别的序列，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。该适用是在本领域技术人员的技术常识的范围内进行替换。在本发明中，“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度Tm)，一般定义为260nm处的吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。例如，当加热含有双链DNA的溶液吋，260nm处的吸光度上升。这是因为双链DNA中的两条链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，全部双链DNA解离成单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约I. 5倍左右，由此可以判断熔解完成。Tm值基于该现象而设定。本发明中的Tm值只要不特别指出，均是指吸光度达到吸光度总上升量的50%时的温度。本说明书中“步骤” ー词，不仅包含独立的步骤，而且例如在不能与其他的步骤明确区别的情况下，只要达到了本步骤预期的效果，则也包含在本术语之内。另外，在本发明中，使用“ ”表示的数值范围表示分别包含“ ”的前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。另外，在本发明中，组成物中的各成分的量，在所述组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要不特别指出，是指组成物中存在的该多种物质的合计量。在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数第I 3位”时是以寡核苷酸链的3’末端为第I位起数的。本发明中的“靶标序列”是指为了检测多态性(poly A重复单元数目突变)而与对应探针杂交的核酸序列。下面说明本发明涉及的多态性检测用探针。此外，本发明中的“含有”和“具有”也包含“由……组成”以及“由……构成”的意思。本发明中的“至少80%以上的同一性”是指，从检测灵敏度的观点来说，可以显示85%以上的同一性、90%以上的同一性、95%以上的同一性、96%以上的同一性、97%以上的同一性、98%以上的同一性或99%以上的同一性。杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如按照MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中记载的方法等来进行。该文献通过參考被并入本说明书中。本发明的“在严谨条件下”是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mM 约50mM以及镁浓度约I. OmM 约
5.OmM中进行杂交的条件。作为详细的示例，可以举出在Tris-HCl (pH8. 6)、25mM的KCl以及I. 5mM的MgC12中进行杂交的条件,但不限于此。此外，严谨条件被记载在MolecularCloning 3rd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)中。该文献通过參考被并入本说明书中。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择上述条件。〈多态性检测用探针〉
本发明的多态性检测用探针为用于检测HGF基因的多态性的探针，其特征在干，其由从下述(Pl-I)、(P1-2)、(Pr -I)、(P1’ -2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-l)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’ -I)和(P3’ -2)的组中选择的至少ー种荧光标记寡核苷酸构成。(Pl-I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P1-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P1’ -I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与所述碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P1’ -2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记；(P2-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的喊基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与喊基编号92对应的喊基用荧光染料标记；(P2-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；(P2’ -I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；
(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，与所述碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；(P3-1)荧光标记寡核苷酸，其为8 120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132 134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的4 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；(P3-2)荧光标记寡核苷酸，其为8 120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所不的喊基序列的喊基编号100、喊基编号132 134、以及由夹在所述喊基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的4 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；(P3’ -I)荧光标记寡核苷酸，其为8 56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132 134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的5 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记；(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸，其为8 56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132 134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的5 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记。本发明的所述荧光标记寡核苷酸可以为与互补链杂交时的荧光強度比未与互补链杂交时的荧光強度减少(淬灭)或増加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以为与互补链杂交时的突光强度比未与互补链杂交时的突光强度减少的突光标记寡核苷酸。
利用了这种突光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓的Q Probe(注册商标)。其中可以举出如下寡核苷酸，其被设计成3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)，并且被荧光染料标记以使该末端的C靠近鸟嘌呤(G)时发光变弱。若使用这样的探针，则可以根据信号的变动来容易地确认杂交和解离。此外，除了使用Q Probe(注册商标)的检测方法之外，也可以应用其它公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或MGB探针法等。所述荧光染料无特别限制，例如可以举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。这些荧光染料的市售产品例如可举出Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM> Cy3 和 Cy5、TAMRA 等。荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确 定。例如Pacific Blue能够在检测波长445 480nm下检测，TAMRA能够在波长585 700nm下检测，BODIPY FL能够在波长520 555nm下检测。如果使用具有这样的荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法，例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。此外，在与具有和荧光标记寡核苷酸互补的碱基序列的DNA杂交的情况下的Tm值、和具有仅有I个碱基为非互补的碱基序列的DNA杂交时的Tm值之差例如可举出2. (TC以上、3. (TC以上、5. (TC以上或7. (TC以上等。另外，本发明的多态性检测用探针例如可以在3’末端添加磷酸基。如后文所述，革巴标序列可以通过PCR (Polymerase Chain Reaction :聚合酶链式反应)法等基因扩增法来制备。此时，可以将本发明的多态性检测用探针共存于基因扩增反应的反应液中。这种情况下，如果在多态性检测用探针的3’末端添加磷酸基，则能够充分防止探针该多态性检测用探针自身由于基因扩增反应而延长。另外，通过在3’末端添加前述那样的标记物质也能够获得同样的效果。以下，作为本发明的多态性检测用探针的代表，详细叙述(Pl-I)、(PI’ -I)、(P2-1)、(P2’ -I)、(P3-1)和(P3’ -I)荧光标记寡核苷酸。此外，由于(P1-2)为与(Pl-I)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P1’ -2)为与(P1’ -I)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P2-2)为与(P2-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P2’ -2)为与(P2’ -I)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P3-2)为与(P3-1)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，(P3’ -2)为与(P3’ -I)类似的碱基序列的荧光标记寡核苷酸，因此特征相同，省略其详细说明。首先，所述(Pl-I)和所述(Pl’-l)荧光标记寡核苷酸的“与碱基编号95对应的碱基”是指与序列编号3所示的碱基序列中作为碱基编号95的碱基“G(鸟嘌呤)”对应的互补碱基“C(胞嘧啶)”。S卩，(Pl-I)和(Pl’-l)荧光标记寡核苷酸相对于与序列编号3所示的喊基序列互补的喊基序列具有至少80%以上的同一性，但是该同一性的条件为与喊基编号95对应的碱基为胞嘧啶。在(pi-i)和(pr -D荧光标记寡核苷酸中，用荧光染料标记的C的位点不一定非要是3’末端，如下述的具体的变化实施方式所示，可以在从3’末端起数第I 3位的位置具有该C，通过该C存在于3’末端，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。该(Pl-I)荧光标记寡核苷酸的长度可以为27 57碱基长、32 52碱基长、或37 47碱基长。另外，该(Pl’-l)荧光标记寡核苷酸的长度可以为22 52碱基长、27 47碱基长、或32 42碱基长。例如，作为具体的(Pl-I)的变化实施方式，可以举出以下的荧光标记寡核苷酸。在(pr -D的情况下，与以下所示的(pi-i)不同，(pr -D成为仅在作为poiy a重复序列的部分的序列的3’末端附属有含其他种类的碱基的碱基序列的状态。poly A重复单元数目30 (31)、46mer、序列编号45，-CAGTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-(荧光标记)-3，poly A重复单元数目30 (31)、42mer、序列编号55，-TTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCC-(荧光标记)-3，poly A重复单元数目0(l)、12mer、序列编号6
5，-TTGTGAGCTGCC-(荧光标记)~3 ’接下来，所述(P2-1)和所述(P2’ -I)荧光标记寡核苷酸的“与碱基编号92对应的碱基”是指与序列编号3所示的碱基序列中作为碱基编号92的碱基“G(鸟嘌呤)”对应的互补碱基“C (胞嘧啶)”。S卩，(P2-1)和(P2’ -I)荧光标记寡核苷酸相对于与序列编号3所示的碱基序列互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，但是该同一性的条件为与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶。如下述的具体的变化实施方式所示，该C不一定是3’末端，可以在从3’末端起数第I 3位的位置具有该C，通过该C存在于3’末端，例如具有检测灵敏度变高等的倾向。该(P2-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为32 62碱基长、37 57碱基长、或42 52碱基长。另外，该(P2’-l)荧光标记寡核苷酸的长度可以为22 52碱基长、27 47碱基长、或32 42碱基长。例如，作为具体的(P2-1)的变化实施方式，可以举出如以下的荧光标记寡核苷酸。在(P2’ -I)的情况下，与如以下所示的(P2-1)不同，(P2’ -I)成为仅在作为poly A重复序列的部分的序列的3’末端附属有含其他种类的碱基的碱基序列的状态。poly A重复单元数目30(31)、46mer、序列编号75 ’ -TTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-(荧光标记)~3，poly A重复单元数目30(31)、42mer、序列编号85，-TGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCTGC-(荧光标记)-3，poly A重复单元数目0(1)、llmer、序列编号95 ’ -GAGCTGCCTGC-(荧光标记)~3 ’最后，所述(P3-1)和所述(P3’ -I)荧光标记寡核苷酸的“碱基编号134的碱基”是指序列编号3所示的碱基序列中作为碱基编号134的碱基“C (胞嘧啶)”。S卩，(P3-1)和(P3’ -I)突光标记寡核苷酸相对于序列编号3所不的碱基序列具有至少80%以上的同一性，但是该同一性的条件为碱基编号134的碱基为胞嘧啶。如下述的具体的变化实施方式所示，该C并不一定要是3’末端，而是可以在从3’末端起数第I 3位的位置具有该C，通过该C存在于3’末端，例如有检测灵敏度变高等的倾向。该(P3-1)荧光标记寡核苷酸的长度可以为30 60碱基长、35 55碱基长、或40 50碱基长。另外，该(P3’ -I)荧光标记寡核苷酸的长度可以为19 49碱基长、24 44碱基长、或29 39碱基长。例如，作为具体的(P3-1)的变化实施方式，可以举出以下所示的荧光标记寡核苷酸。在(P3’ -I)的情况下，与以下所示的(P3-1)不同，(P3’ -I)成为仅在作为poly A重复序列的部分的序列的3’末端附属有含其他种类的碱基的碱基序列的状态。
poly A重复单元数目30(31)、46mer、序列编号105，-AGAGCAGGCAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-(荧光标记)~3，poly A重复单元数目30(31)、36mer、序列编号115，-GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAC-(荧光标记)~3，poly A重复单元数目2(3)、8mer、序列编号125 ’ -GCTTTCAC-(荧光标记)~3 ’如上述(Pl-I)、(Pr-I)、(P2-1)、(P2，-I)、(P3-1)或(P3，-I)(也包括特征类似的(Pl-2)、(P1’ -2)、(P2-2)、(P2’ -2)、(P3-2)或(P3’ -2))荧光标记寡核苷酸所示的本发明涉及的多态性检测用探针能够用于HGF基因的poly A重复单元数目突变的检測。检测方法无任何限制，只要是利用靶标序列和这些多态性检测用探针的杂交的方法即可。例如，可以仅使用(Pl-I)、(PI，-D、(P2-1)、(P2，-I)、(P3-1)或(P3，-I)的 poly A 重复单元数目30(31)的多态性检测用探针(正常型探针)，来检测HGF基因的poly A重复序列突变。另外，也可以使用(Pl-I)、(P1，-I)、(P2-1)、(P2，-I)、(P3-1)或(P3，-I)的 poly A 重复单元数目30(31)之外的各种poly A重复单元数目重复 数的多态性检测用探针(突变型探针)，来检测HGF基因的polyA重复单元数目突变。另外，本发明的多态性检测用探针的特征在于其为用于熔解曲线分析的探针。以下叙述HGF基因的多态性检测方法的详细(也包括利用这样的熔解曲线分析的方法)。〈HGF基因的多态性检测方法>本发明的HGF基因的多态性检测方法(HGF基因的poly A重复单元数目突变的检测方法)特征在于使用前述的多态性检测用探针。即，本发明的多态性检测方法的特征在于使用前述的本发明的多态性检测用探针，其他的构成或条件等不限于以下的记载。本发明的多态性检测方法例如包括下述步骤(I)、步骤(II)、步骤(III)和步骤
(IV)。(I)使所述多态性检测探针和试样中的单链核酸接触，来获得荧光标记寡核苷酸和单链核酸的杂交体的步骤。(II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动的步骤。(III)基于所述荧光信号的变动来评价所述杂交体的解离温度、即Tm值的步骤。(IV)基于所述Tm值来检测HGF基因中的多态性的存在的步骤。此外，上述步骤(III)中，“评价Tm值”可以是仅仅包括评价(确定)Tm值下的温度，也可以包含评价(确定)Tm分析中的峰的高度，即评价(确定)每单位时间的荧光强度的变化量的峰。通过评价该峰的高度，能够确认具有poly A重复单元数目突变的碱基序列的丰度比。更具体地说，例如，在仅使用正常型探针来实行这样的多态性检测方法的情况下，预先測定使用正常型单链核酸的情况下的Tm值。正常型单链核酸例如从全血等中使用市售的基因组DNA分离盒来分离基因组DNA并使用。之后，通过比较该正常型的Tm值和试样的Tm值，能够评价试样HGF基因是否具有poly A重复单元数目突变。S卩，当Tm值为与正常型时完全相同的值时，判断为试样poly A重复序列与正常型探针完全匹配。但是，Tm值小于正常型时，表示试样单链核酸和正常型探针的解离温度低，因此这种情况下，可知试样单链核酸的poly A重复单元数目少于正常型的30 (31)。另外，即使不是正常型探针，而是0 (I) 29 (30)的任意poly A重复单元数目的突变型探针，也能够使用这样的方法来评价是完全匹配还是错配，并正确地检测试样的polyA重复单元数目突变。另外，至少使用一种这样的各种多态性检测用探针即可，也可以ー起使用两种以上。通过一起使用两种以上的多态性检测用探针，并评价每单位时间的荧光強度的变化量(荧光信号)的峰，能够一次性地评价与各个多态性检测用探针完全匹配的poly A重复单元数目的靶标序列的丰度比。反应体系中本发明的多态性检测用探针的添加浓度无特别限制，对于每一种多态性检测用探针例如可以举出10 lOOOnmol/L或20 500nmol/L。本发明涉及的HGF基因的多态性检测方法，也可以含有在前述(I)的获得杂交体之前，或者与获得杂交体的同时扩增核酸的步骤。作为核酸的扩增法无特别限制，例如可以举出 PCR 法、NASBA(Nucleic AcidSequence Based Amplification :基于核酸序列的扩增)法、TMA (Transcription-Mediated Amplification :转录介导扩增)法、或SDA(Strand Displacement Amplification :链置换扩增)法等。其中可以为PCR法。核酸的扩增法的条件无特别限制，可以通过以往公知的方法来进行。基于作为模板的核酸来生成扩增产物中，例如可以举出使用用于扩增含有该检测目标的poly A重复単元数目突变的序列的引物。该引物的扩增区域无特别限制，可以根据检测目标的poly A重复单元数目突变来适当设定。例如，可以举出含有与前述的(Pl-1)、(P1’-I)、(P2-1)、(P2’ -I)、(P3-1)或(P3’ -I)荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域。另外，该引物的序列无特别限制，例如，只要能够扩增检测目标的poly A重复单元数目突变的序列即可，可以根据该检测序列和其周边序列等来通过现有公知的方法而适当设定。另外，该引物的长度无特别限制，可以设定为一般的长度，例如可以举出10 50碱基长。作为这样的引物，例如可以使用扩增正义链的正向引物(F引物)和扩增反义链的反义引物(R引物)中的任何一者，例如可以举出使用将两者作为ー对的引物对。在使用该引物的反应体系中，引物的添加浓度无特别限制，例如对于ー种引物可以举出0. I 4iimol/L、0. 25 I. 5 y mol/L或0. 5 I y mol/L。另外，在使用F引物和R引物的情况下，F引物和R引物的添加比例无特别限制，例如，按照以摩尔比的F引物R引物，可以举出I : 0. I I : 10 或 I : 0. 5 I : 5。适用本发明的HGF基因的多态性检测方法的试样无特别限制，例如可以举出生物试样。作为该生物试样的具体示例，例如可以举出全血、白血球细胞等血细胞、骨髄、口腔粘膜等口腔内细胞、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰液、羊水、石蜡包埋组织、尿、洗胃液等。在本发明中，该试样的采集方法以及由该试样制备被检核酸的方法等无特别限制，可采用现有的公知方法。在该生物试样为全血时，本发明的反应体系中该全血的浓度例如可以举出0. 01 2体积％、0. 05 I. 5体积％或0. I I体积％。另外，在该生物试样为血清时，本发明的反应体系中该血清的浓度例如可以举出0. I 20体积％、0. 25 15体积％或0. 5 10体积％。<药剂的评价方法>本发明的药剂的评价方法以通过利用前述的HGF基因的多态性检测方法、来评价能够用于与HGF基因相关的疾病的药剂的耐受性或药效为特征。即，本发明的药剂的评价方法的特征在于使用前述HGF基因的多态性检测方法进行评价，其他的构成或条件等不限于以下的记载。本发明的药剂的评价方法例如包括下述步骤(I)和步骤(II)。(I)通过前述的HGF基因的多态性检测方法，来检测HGF基因的多态性的步骤。(II)基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效的步骤。具体的详情与前述HGF基因的多态性检测方法相同。(II)中的“基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效”例如是指，基于突变型和正常型的丰度比或有无等来对针对乳腺癌等药剂的耐受性或药剂的药效进行评价。如此的药剂的评价方法在确定由于该poly A重复单元数目突变导致的疾病的治疗方针(如增减药剂的施与量、或改变为其他的治疗药等)中有用。 〈HGF基因的多态性检测用试剂盒>本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒以含有前述的多态性检测用探针为特征。即，本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒的特征在于含有前述的多态性检测用探针，其他的构成或条件等不限于以下的记载。此外，还可以含有能够以含有与前述的多态性检测用探针即(Pl-I)、(Pr -I)、(P2-1)、(P2’ -I)、(P3-1)或(P3’ -I)(也包括特征类似的(Pl-2)、(Pl，-2)、(P2-2)、(P2，-2)、(P3-2)或(P3，-2))荧光标记寡核苷酸杂交的碱基序列的区域为模板进行扩增的引物。下面叙述本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒的示例。例如，本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒为在HGF基因的poly A重复单元数目突变的检测中使用的试剂盒。试剂盒中也可以含有ー种或两种以上的前述的多态性检测用探针。在后者的情况下，两种以上的多态性检测用探针可以以混合状态被包含，也可以作为単独的试剂被包含。另外，在两种以上的本发明的多态性检测用探针以混合的状态包含在本发明的HGF基因的多态性检测用试剂盒中的情况下，或者虽然作为单独的试剂被包含，但是例如使用时在相同的反应体系中进行各多态性检测用探针和各靶标序列的Tm解离分析的情况下，各多态性检测用探针可以用不同的荧光染料进行标记。通过如此改变荧光染料的种类，使得即使相同的反应体系中，也能够进行针对各个多态性检测用探针的检測。作为所述荧光染料，例如，可以举出检测波长不同的物质。如前所述，近年，据称HGF基因的poly A重复单元数目突变与乳腺癌的发病风险有夫。因此，通过本发明的多态性检测用探针、HGF基因的多态性检测方法以及HGF基因的多态性检测用试剂盒等，能够正确地检测poly A重复单元数目的多个碱基単位的突变，因此使得能够预先检查乳腺癌的发病风险，很有可能能够与乳腺癌的早期发现等相关联。接下来说明本发明的实施例。但是，本发明不限于下述实施例。下面叙述如下实施例，所述实施例中使用本发明的多态性检测用探针评价了作为HGF基因的启动子区域的部分序列的、从第19432961位的碱基到第19432991位的碱基的poly A重复单元数目突变。(实施例I)实施例I中，利用本发明的多态性检测用探针，对HGF基因的启动子区域的polyA重复单元数目突变，使用全自动SNPs检查装置(商品名i-denSy(IS-5310)、爱科来公司制)进行了 Tm分析。添加到i-densy(IS-5310)中的探针等溶液、试剂的处方如下表所示。表I
权利要求
1.一种多态性检测用探针，其是用于检测HGF基因的多态性的探针，其特征在于，其由从下述(Pl-I)、(Pl-2)、(Pl，-I)、(Pl，-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2，-I)、(P2，-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3，-I)和(P3’ -2)的组中选择的至少ー种荧光标记寡核苷酸构成 (Pl-I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； (P1-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； (pr -D荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，与所述碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； (P1’ -2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95 100以及由夹在所述碱基编号95 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为7 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记； (P2-1)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； (P2-2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和所述碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为11 94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； (P2’ -I)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下、相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述与碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记；(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号92 100以及由夹在所述碱基编号92 100的3’末端和碱基编号132之间的I 31个碱基中的任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为10 55个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号92对应的碱基为胞嘧啶的条件下，与序列编号3的碱基序列在严谨条件下杂 交，与所述碱基编号92对应的碱基用荧光染料标记； (P3-1)荧光标记寡核苷酸，其为8 120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132 134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的4 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于序列编号3的碱基序列具有至少80%以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； (P3-2)荧光标记寡核苷酸，其为8 120个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号100、碱基编号132 134、以及由夹在所述碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的4 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； (P3’ -I)荧光标记寡核苷酸，其为8 56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132 134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的5 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的喊基为胞B密唳的条件下,相对于序列编号3的喊基序列具有至少80 以上的同一性，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记； (P3’ -2)荧光标记寡核苷酸，其为8 56个碱基长的碱基序列，且含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号132 134以及由夹在碱基编号100和所述碱基编号132 134的5’末端之间的5 31之间任意个数的连续的T构成的子碱基序列，其在碱基编号134的碱基为胞嘧啶的条件下，和与序列编号3互补的碱基序列在严谨条件下杂交，并且所述碱基编号134的碱基用荧光染料标记。
2.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其特征在干， 所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(P1’ -I)和所述(P1’ -2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基； 所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)和所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基； 所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)和所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸在从3’末端起数第I 3位的位置具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。
3.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(pr -D和所述(Pr -2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号95对应的碱基； 所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)和所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述与碱基编号92对应的碱基； 所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)和所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸在3’末端具有用荧光染料标记的、所述碱基编号134的碱基。
4.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度減少或増加。
5.根据权利要求4所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出荧光，并且在与所述靶标序列杂交时荧光强度減少。
6.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)突光标记寡核苷酸的碱基长为27 57 ; 所述(Pr -I)或所述(Pr -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22 52 ; 所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 62 ; 所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为22 52 ; 所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为30 60 ; 所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为19 49。
7.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 52 ; 所述(Pr -I)或所述(Pr -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27 47 ; 所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37 57 ; 所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为27 47 ; 所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为35 55 ; 所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为24 44。
8.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述(Pl-I)或所述(P1-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为37 47 ; 所述(PI’ -D或所述(P1’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 42 ; 所述(P2-1)或所述(P2-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为42 52 ; 所述(P2’ -I)或所述(P2’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为32 42 ; 所述(P3-1)或所述(P3-2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为40 50 ; 所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸的碱基长为29 39。
9.根据权利要求I所述的多态性检测用探针，其特征在于，所述多态性检测用探针为用于熔解曲线分析的探针。
10.ー种HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，使用权利要求I所述的多态性检测用探针。
11.根据权利要求10所述的HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，包括 (I)使权利要求I所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，获得所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸的杂交体的步骤； (II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度，使所述杂交体解离，测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动的步骤； (III)基于所述荧光信号的变动，评价所述杂交体的解离温度即Tm值的步骤；以及 (IV)基于所述Tm值，检测HGF基因中的多态性的存在的步骤。
12.根据权利要求11所述的HGF基因的多态性检测方法，其特征在于，还包括在所述(I)的获得杂交体之前或者与所述(I)的获得杂交体同时扩增核酸的步骤。
13.—种药剂的评价方法，其特征在于，包括 (I)通过权利要求10所述的HGF基因的多态性检测方法，来检测HGF基因的多态性的步骤； (II)基于检测到的多态性的有无，来评价针对药剂的耐受性或药剂的药效的步骤。
14.HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求I所述的多态性检测用探针。
15.根据权利要求14所述的HGF基因的多态性检测用试剂盒，其特征在于，还包括能够以含有与所述(Pl-I)、所述(P1-2)、所述(P1’ -I)、所述(P1’ _2)、所述(P2-1)、所述(P2-2)、所述(P2’ -I)、所述(P2’ -2)、所述(P3-1)、所述(P3-2)、所述(P3’ -I)或所述(P3’ -2)荧光标记寡核苷酸杂交的序列的区域为模板进行扩增的引物。
全文摘要
本发明提供HGF基因的poly A重复单元数目突变多态性检测用探针及其用途。所述多态性检测用探针为用于检测HGF基因的多态性的探针，其由(P1-1)、(P1-2)、(P1’-1)、(P1’-2)、(P2-1)、(P2-2)、(P2’-1)、(P2’-2)、(P3-1)、(P3-2)、(P3’-1)和(P3’-2)中的至少一种荧光标记寡核苷酸构成。例如(P1-1)为如下荧光标记寡核苷酸，其碱基序列与含有序列编号3所示的碱基序列的碱基编号95～100、碱基编号132、以及由夹在所述碱基编号95～100的3’末端和所述碱基编号132之间的1～31个碱基中任意个数的连续的T构成的子碱基序列且长度为8～94个碱基长的碱基序列互补，其在与碱基编号95对应的碱基为胞嘧啶的条件下，相对于与序列编号3互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性，并且所述与碱基编号95对应的碱基用荧光染料标记。
文档编号C12N15/11GK102776277SQ20121015014
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者井口亚希, 平井光春 申请人:爱科来株式会社