专利名称：：一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法，应用该方法对益生菌进行检测，可准确、快速的完成肠道中益生菌的定性和定量研究。
背景技术：
：人类的肠道栖居着庞杂多样的微生物群落。这些微生物聚集在人类肠道内，其数量超过肠道的细胞，因此在人体肠道是一个多样性丰富动态平衡的生态系统。这个系统像是一个栖息地，一些微生物成员可以在此根深地固，一些却像是搭便车转瞬即逝。目前肠道菌群之间，及其与宿主的关系越来越引起人们的重视并成为研究热点。对其关系最常见的描述为共生(一个伙伴受益而其他的不受影响)而不是互惠(包括合作伙伴都一起受益)，这对稳定这个可持续发展的肠道环境是十分关键的。研究发现，不同肠道微生物结构和组成影响着宿主的营养物质加工、能量平衡、免疫功能、胃肠道发育及其他多种重要的生理活动，进而直接影响人类健康。在现代分子生物学技术的帮助下，肠道微生物的研究也深入到了基因和作用机制水平。人体肠道菌群可分为硬壁菌门，拟杆菌门，放线菌门，梭杆菌门，变形菌门，疣微菌门，蓝藻菌门。这些菌门的划分都基于对最全面和多样性16SrRNA测序的研究。在所有细菌的染色体基因组中，16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的rDNA序列，并具有高度的保守性和特异性。因此在生物进化的过程中16SrRNA变化级小，所以可以根据测定其序列追根溯源不同生物的亲缘关系。益生菌(Probiotic)，源于希腊语“对生命有益”，是定植于人体肠道内，能产生确切健康功效的活的有益微生物的总称，早在上个世纪初(1907年)著名细菌学家诺贝尔奖得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益寿的假说。益生菌主要包括乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium),其益生作用主要是通过直接或者间接的调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统的活性来实现的。口服益生菌能够治愈或缓解多种胃肠道或与胃肠道相关的疾病，目前研究证实口服益生菌有助于缓解乳糖不耐症，预防或者治愈胃肠炎(gastroenteritis)、抗生素相关性腹湾(antibiotic-associateddiarrhea)、旅行性腹湾(traveler，sdiarrhea)、便秘(constipation)及肠道感染(intestinalinfections),同时可抑制有害微生物在宿主肠道中定植，对肠易激综合征(irritablebowelsyndrome,IBS)、炎症性肠炎(inflammatoryboweldisease,IBD)及结肠癌(coloncancer)等肠道相关性疾病具有良好的预防和治疗作用。
发明内容本发明的目的是提供一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法，以L.plantarumP8的全基因组序列中一段特异性片段为依据，设计了该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株扩增和RT-PCR定量，可以快速准确的完成人体肠道中L.plantarumP8的定性定量研究。本发明的技术方案是一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌(LactobacillusplantarumP8)分离自由中国境内采集的酸马奶样本,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名植物乳杆菌，保藏号=CGMCCNo.5468，保藏日期为2011年11月18日。益生菌在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤I、粪便样品中宏基因组DNA的提取采用液氮冻融一CTAB法取I.Og粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，力口0.ImL10%SDS和10.0iiL10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心lOmin，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心IOmin(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽·提2次，经0.I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。2.L.plantarumP8的特异性片段的扩增扩增引物以L.plantarumP8的全基因组序列为依据,采用本实验室自主设计的引物前序列，该引物序列及扩增片段的具体信息为ATCGGTTAkCTMCGGGAGGAGTCAlGGGCGTGCGCCGAGCGGAAATTATCAATGGCTTACGATGGTCAGTAGTAGCGGACGCATTAGGGTTGCCCGCGGAAAATCGTCAACGGGGAACTTATCCGTTAATTACGGAAATGGTCGCAAGTGACTTTTGGAAACAGCCAGCAGGGAGCTGGTCTGATGACACATCGATGAGTTTAGGATTGATTGAGAATTTGGTTAGCGGTGGTGATTATGATGATCTCATjfcCCGMffllillgfCTATGCGCTTTGGAACGAACACGC扩增体系反应体系50iiL:10XPCRBuffer5uL,25mmol/LMg2+L0yL，2.5mmol/LdNTPs4uL,5mmol/L上下游引物各2yL,DNA模板IOOng左右，5U/uLTaqSI(Promega)0.5uL,ddH2O补足至50iiL。扩增条件95°C变性5min;循环30次95°C变性lmin，62°C退火45s，72°C延伸lmin，然后72°C延伸7min，4°C保存。3.琼脂糖凝胶电泳将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20_30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果。4.RT-PCR检测样品中L.plantarumP8的数量首先应用已知数量的L.caseiZhang通过RT-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L.caseiZhang的数量。RT-PCR扩增体系反应体系20iiL:10XPCRmix10yL，10mmol/L上下游引物各0.4yL，DNA模板IOOng左右，ddH2O补足至20uL。RT-PCR扩增条件95°C变性20s;循环40次95°C变性5s，62°C退火30s，72°C延伸45s。5.肠道中益生菌L.plantarumP8定植能力的检测随机选取33名近三个月内无抗生素类药物摄入的志愿者(性别比例17:16)，每日服用含益生菌LactobacillusplantarumP8的片剂(活菌数>2xl0lcl个/粒)3粒,连续服用28天，分别于0天，14天，28天以及停止服用菌片后一周(35天)，两周(42天)和四周(56天)采集志愿者粪便样品。样品采集后迅速放入液氮中速冻，并在8小时内完成粪便样品宏基因组DNA的提取。而后应用LactobacillusplantarumP8的特异性引物进行RT-PCR扩增，检测不同时间内各志愿者体内LactobacillusplantarumP8的残留量,进而判断其定植能力。本发明的效果是LactobacillusplantarumP8分离自由中国境内采集的酸马奶样本，是一株经过系统研究的益生菌。它有抗氧化和免疫调节特性，并已被用于发酵剂和乳制品的工业化生产。本发明以LplantarumP8的全基因组序列中一段特异性片段为依据，设计了该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株扩增和RT-PCR定量，可以快速准确的完成人体肠道中L.plantarumP8的定性定量研究。下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。图I为粪便样品宏基因组DNA电泳图；图2为5个样品中LactobacillusplantarumP8的特异性扩增条带图；图3为L.plantarumP8的RT-PCR扩增标准曲线图；图4不同时期青年组、中年组和老年组粪便中LactobacillusplantarumP8的含量曲线图。具体实施例方式一株可以定植于肠道中的益生菌,所述益生菌(LactobacillusplantarumP8)分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号=CGMCCNo.5468，保藏日期为2011年11月18日。益生菌LactobacillusplantarumP8在肠道中的检测方法,包括下列步骤I.粪便样品中宏基因组DNA的提取采用液氮冻融一CTAB法取I.Og粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，力口0.ImL10%SDS和10.0iiL10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心lOmin，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心IOmin(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。图I为类便样品宏基因组DNA电泳图，图I中，I为样品I，2为样品2，M为入-DNA/HindIIIMarkers。2.LactobacillusplantarumP8的特异性片段的扩增扩增引物以LplantarumP8的全基因组序列为依据，釆用本实验室自主设计的引物前序列，该引物序列及扩增片段的具体信息为权利要求1.一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌(LactobacillusplantarumP8)分离自由中国境内采集的酸马奶样本,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号=CGMCCNo.5468，保藏日期为2011年11月18日。2.可以定植于肠道益生菌在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤(1)粪便样品中宏基因组DNA的提取采用液氮冻融一CTAB法取I.Og粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于I.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，力口.0.ImL10%SDS和10.0iiL10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下.12000g离心lOmin，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心IOmin(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.I倍体积的醋酸钠，I倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。(2)L.plantarumP8的特异性片段的扩增扩增引物以L.plantarumP8的全基因组序列为依据，引物前序列及扩增片段的具体信息为ATCGGTTAkCTMGGGGAGGAGTGATIGGGCGTGCGCCGAGCGGAAATTATCAATGGCTTACGATGGTCAGTAGTAGCGGACGCATTAGGGTTGCCCGCGGAAAATCGTCAACGGGGAACTTATCCGTTAATTACGGAAATGGTCGCAAGTGACTTTTGGAAACAGCCAGCAGGGAGCTGGTCTGATGACACATCGATGAGTTTAGGATTGATTGAGAATTTGGTTAGCGGTGGTGATTATGATGATCTCATilfCCCGIfltfMGMCTllATGCGCTTTGGAACGAACACGC扩增体系反应体系50iiL:10XPCRBuffer5uL,25mmol/LMg2+L0yL，2.5mmol/LdNTPs4uL,5mmol/L上下游引物各2yL，DNA模板IOOng左右，5U/yLTaq酶(Promega)0.5uL,ddH2O补足至50uL；扩增条件95°C变性5min;循环30次95°C变性lmin，62°C退火45s，72°C延伸lmin，然后72°C延伸7min，4°C保存。(3)琼脂糖凝胶电泳将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20_30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果；(4)RT-PCR检测样品中L.plantarumP8的数量首先应用已知数量的L.caseiZhang通过RT-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L.caseiZhang的数量；RT-PCR扩增体系反应体系20iiL:10XPCRmix10yL，10mmol/L上下游引物各.0.4uL,DNA模板IOOng左右，ddH2O补足至20uL。RT-PCR扩增条件95°C变性20s;循环40次95°C变性5s，62°C退火30s，72。。延伸.45s。(5)肠道中益生菌L.pIantarumP8定植能力的检测随机选取33名近三个月内无抗生素类药物摄入的志愿者(性别比例1716)，每日服用含益生菌LactobacilluspiantarumP8的片剂(活菌数>2xl0lcl个/粒)3粒,连续服用.28天，分别于0天，14天，28天以及停止服用菌片后一周即第35天，两周即第42天和四周即第56天采集志愿者粪便样品；样品采集后迅速放入液氮中速冻，并在8小时内完成粪便样品宏基因组DNA的提取；而后应用LactobacillusplantarumP8的特异性引物进行RT-PCR扩增，检测不同时间内各志愿者体内LactobacilluspiantarumP8的残留量,进而判断其定植能力。全文摘要一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌(LactobacillusplantarumP8)分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCNo.5468，保藏日期为2011年11月18日。益生菌LactobacillusplantarumP8在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤(1)粪便样品中宏基因组DNA的提取；(2)L.plantarumP8的特异性片段的扩增；(3)琼脂糖凝胶电泳；(4)RT-PCR检测样品中L.plantarumP8的数量；(5)肠道中益生菌L.plantarumP8定植能力的检测。文档编号C12Q1/68GK102747012SQ201210150968公开日2012年10月24日申请日期2012年5月15日优先权日2012年5月15日发明者张佳超,王丽凤,高鹏飞申请人:北京和美科盛生物技术有限公司